EFEITOS DO EXTRATO DO ABACAXI Ananas comosus (L.) MERRIL NA MIOSITE INDUZIDA EM RATOS
2.7 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Os músculos retirados foram encaminhados à análise histopatológica e preparados pelo método da hematoxilina-eosina (H/E). Na referida análise foram observados parâmetros que serviram de comparação entre os grupos para a verificação da eficácia do tratamento. Análise macroscópica da miosite - A análise macroscópica da tendinite foi realizada primeiramente: a aferição do tamanho e dos diâmetros ântero-posterior (DAP) e látero-lateral (DLL) do membro inferir direito do animal com a paquímetro. No último dia de experimento de 7 e 14 dias foi feito a aferição do membro posterior direito novamente, e eutanásia dos ratos a partir da análise do o diâmetro dos tendões, em seu terço médio, com paquímetro posicionado médio- lateralmente, fazendo as medidas de acordo com os tempos experimentais estudados e posteriormente a análise estatística.
2.8 ANÁLISE HISTOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA
Para contagem do número de células inflamatórias foi utilizado o programa de computador Image J®, na sua função “cell conter”. A avaliação qualitativa foi baseada nos estudos dos cortes histológicos com relação à presença de células inflamatória e fibroblastos em relação ao tempo experimental. Esta foi realizada com o auxílio de microscópio óptico (Olimpus, 2000) acoplado a um sistema de câmera digital. Para tanto, foram obtidas imagens de três regiões das lesões cirúrgicas (margem direita, região central e margem esquerda) de cada animal, na objetiva de 40X, utilizando o programa LeicaQwin.
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados coletados foram realizados de maneira descritiva, através do teste ANOVA para comparação entre grupos. O intervalo de confiança foi entre 95% e o nível de significância, ou seja, a probabilidade de erros na análise p< 0,05. Os resultados foram quantificados e expressos através de gráficos feitos no software estatísticos GraphPad Prism 5.0.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados qualitativos demostraram que o extrato do abacaxi no processo inflamatório, no tempo experimental de sete dias, o gru po MO apresentou uma menor quantidade de tecido de granulação, presença de fibroblastos e uma melhor organização das fibras colágenas, quando comparados aos animais do gru po M caracterizando, portanto, a fase de proliferação no processo de cicatrização .
Aos 14 dias como podemos observar na figura 1, o processo inflamatório nos animais do grupo M reduziu e o número de fibroblastos aumentou, porém ainda apresentava tecido de granulação. Os animais do grupo MO, apresentaram ausência de células inflamatórias, fibroblastos maduros, e uma modelação das fibras colágenas, quando comparados com os animais do grupo M, evidenciando a fase de remodelação do processo de cicatrização normal do tecido (Figura 1).
Figura 1: Aspectos qualitativos do processo inflamatório no processo de cicatrização da
miosite o extrato do abacaxi (Ananas comosus) no tempo experimental de 14 dias.
O cálculo da média do diâmetro do tendão apresentou resultado significativo no período de sete e quatorze dias, ou seja, houve melhora na regressão do edema. Podemos analisar que no dia 1 o diâmetro entre os grupos mostrou-se sem grande diferença estatística, porém nos dias de 7 e 14 dias de experimento dos grupos M e MO comparado com o grupo C houve uma disparidade significativa, ocorrendo assim uma melhor redução do edema nos grupos MO e M (Tabela 1).
Tabela 1. Média da área do membro posterior direito dos ratos submetidos à miosite.
GRUPOS
Área média do membro posterior direito
Dia 1 Dia 7 Dia 14
Controle 46,9 38,7 24,8
Miosite 44,3 22,4 13,6
Miosite tratada 47,2 19,9 11,4
Grupos controle (C), miosite (M) e miosite tratada (MO), em tempos experimentais de 7 e 14 dias. Unidade de medida utilizada: mm.
Com relação à análise quantitativa, o número de células inflamatórias, observou- se diferença significativa entre os grupos controle C e grupo MO comparado com o Grupo M com p<0,001 no tempo experimental de sete dias o que permite afirmar a presença do processo inflamatório. Os animais do grupo M no tempo experimental de 14 dias comparados aos do grupo M, apresentaram diferença estatisticamente significativa com p<0,05 havendo, portanto, uma redução do processo inflamatório. Quando se relacionam os números de fibroblastos presentes nos grupos C, grupo M com MO aos sete dias, há diferença estatística significativa p<0,001. No tempo experimental de 14 dias os mesmos grupos verificam-se uma diferença significativa (p<0,001), ou seja, uma maior presença de fibroblastos, caracterizando a fase de proliferação do processo de cicatrização normal tecidual.
Figura 3. Número de células inflamatórias (20.000und/µm2) nos grupos estudados em
Figura 4. Número de fibroblastos (20.000und/µm2) nos grupos estudados em tempos
experimentais de 7 e 14 dias tratados com o extrato do abacaxi.
As miosites, caracterizadas pelo processo inflamatório muscular e limitação funcional do membro acometido, possuem um ciclo de pouca inflamação, pouca restrição nas atividades de vida diária, porém complicações secundárias à miosite, podem levar a óbito como a pneumonia, devido ao enfraquecimento muscular provocado pelo desuso em decorrência do processo inflamatório limitante. Dessa forma a cicatrização dessa patologia é de suma importância (BARCA et al., 2012).
A inflamação trata-se de um processo de mecanismo de defesa, e a reparação pode causar cicatrizes e comorbidades que afetam a fisiologia e estética dos tecidos, como músculos e articulações. Nesse processo de defesa há uma distribuição variável de exsudados inflamatórios que altera a funcionalidade do fascículo muscular, impedindo a adequada nutrição muscular e a sua continuidade podendo levar até a necrose do local afetado (DE OLIVEIRA; PINHEIRO, 2013). Estes dados corroboram com os resultados encontrados quando observadas ao microscópio, os grupos induzidos por ácido acético, apresentaram edema, inflamação, acúmulo de células inflamatórias linfocíticas. Esse processo inflamatório passa por várias etapas, várias células com suas formas e funções especificas agem de modo a defender e equilibrar o organismo de ataques de agentes patógenos, essas células são os fibroblastos, eosinófilos, macrófagos, neutrófilos, entre outras(DELLÚ FRANCO et al., 2017).
O primeiro evento dessa cascata é o deslocamento de células à região agredida como os leucócitos que iram fagocitar ou produzir substâncias nocivas aos antígenos e tecidos
necróticos (COELHO; REZENDE; TENORIO,1999). Os neutrófilos, linfócitos e eosinófilos
chegam ao processo inflamatório através da corrente sanguínea e tem como função também proteger o organismo de agentes invasores após os primeiros dias da lesão, porém com o passar dos dias esse número de células vai sendo substituído por fibroblastos e tramas de elastina e colágeno(MUQARRABUN et al., 2014). Estas células foram objetos de estudo para mensurar o processo de inflamação induzido em ratos.
Na análise qualitativa e quantitativa nos mostrou que nos grupos de 7 dias de tratamento, houve uma redução do número da quantidade de tecido de granulação, presença de fibroblastos e uma organização das fibras colágenas, quando comparadas aos grupos C e M. No tempo experimental de 14 dias o grupo MO apresentou ausência de células inflamatórias, fibroblastos maduros, e uma trama de colágeno já desenvolvida, em comparação ao grupo M que ainda possuía células de defesa e poucos fibroblastos. Portanto, evidencia-se conforme o estudo que tanto o grupo de 7 quanto o de 14 dias houve diferença significativa entre os grupos tratados e não tratado com o extrato.
Juntamente com a locomoção das células, ocorre a contração arteriolar transitória estimula a liberação de mediadores químicos, como prostaglandinas que dá início à dilatação subsequente das arteríolas e levam a hiperemia ativa, outros mediadores também atuam como a histamina e bradicinina, levam ao aumento das vênulas com a consequente exsudação de um liquido plasmático rico em proteínas, comumente chamada de edema (COELHO; REZENDE; TENORIO,1999). Ao avaliar o membro posterior direito dos animais macroscopicamente, observou-se uma evolução do processo com redução da área do membro posterior direito de forma acentuada no grupo tratado, ou seja, mostrou que o extrato foi eficaz na redução do edema, pois esse é considerada um indicativo do potencial de cicatrização, ou seja, quanto melhor a cicatrização maior é a percentagem da diminuição.
Segundo estudos o edema pode manter-se e se prolongar por vários dias em situações em que a lesão foi mais grave pois nelas ocasionam destruição de capilares, vênulas e arteríolas. Nesses casos o edema dura o tempo necessário para o trombosamento
ou o repara das paredes vasculares (DURVAL; LÍGIA, 2001). Na nossa pesquisa o tempo de
inflamação não foi prolongado, dessa forma a lesão muscular induzida no estudo não foi agressiva ao ponto de danificar nenhum tecido vascular e durou poucos dias.
Em estudos recentes foi comprovado que a enzima bromelina encontrada no extrato,
al., 2009; COELHO et al., 2011). Nesse contexto no estudo proposto evidenciou-se que o extrato do abacaxi foi responsável pela ação anti-inflamatória tendo, portanto, capacidade de substituir fármacos anti-inflamatórios que exercem inúmeros efeitos colaterais que podem restringir seu uso, além de ser uma planta nativa e de fácil acesso e produção em nosso país.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se que a aplicação do extrato do abacaxi em musculatura acometida por miosite foi satisfatória no processo inflamatório, melhorando a função do membro acometido. Houve uma redução do número de células inflamatórias no tempo de 7 dias e um aumento do número de fibroblastos e uma maior deposição e organização das fibras colágenas nos animais do grupo tratado com o óleo no tempo experimental de 14 dias.
Pode-se inferir do texto indícios da possibilidade terapêutica utilizando-se do extrato desta fruta, necessitando para tanto de novos e mais abrangentes estudos para confirmação destes achados em outros modelos experimentais.
5. REFERÊNCIAS
ABÍLIO, G.M.F.; HOLSCHUH, H.J.; BORA, P.S.; OLIVEIRA E.F. Extração, atividade da bromelina e análise de alguns parâmetros químicos em cultivares de abacaxi. Revista
Brasileira de Fruticultura, v. 31, n. 4, p. 1117-1121, 2009.
BARCA, E.; AGUENNOUZ, M.; MAZZEO, A.; MESSINA, S.; TOSCANO, A.; VITA, G.L.; et al. ANT1 is reduced in sporadic inclusion body myositis. Neurological Sciences, v. 34, n. 2, p. 217-224, 2012.
BRESOLIN, I.R.A.P. Purificação da enzima bromelina de resíduos de abacaxi para
estudo de estabilidade em bases dermatológicas. (Tese) Doutorado em Engenharia
Química - Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2013.
BRITO, M.V.H.; FIGUEIREDO, R.C.; TAVARES, M.L.C.; SILVEIRA, T.S.; CANTANHÊDE, G. Efeito dos óleos de andiroba e copaíba na miosite induzida em ratos. Revista Paraense de
COELHO, D.F.; PAULO, A.G.; SOARES, E.S.; JÚNIOR, A.P.; TAMBOURGI, E.B. Purificação de bromelina dos resíduos de abacaxi (Ananas comosus L. Merril) por sistemas bifásicos aquosos PEG/Sal. Exacta, v. 9, n. 3, p. 333-338, 2011.
COELHO, M.C.O.; REZENDE, C.M.F.; TENORIO, A.P.M. Contração de feridas após cobertura com substitutos temporários de pele. Ciência Rural, v. 29, n. 2, p. 297-303, 1999. COLEY, W.; RAYAVARAPU, S.; PANDEY, G.S.; SABINA, R.L.; MEULEN, J.H.V.; AMPONG, B.; et al. The molecular basis of skeletal muscle weakness in a mouse model of inflammatory myopathy. Arthritis & Rheumatism, v. 64, n. 11, p. 3750-3759, 2012.
DA COSTA, H.B. Desenvolvimento de processo para a purificação de bromelina a partir
de resíduos de abacaxizeiro (Ananas comosus var. comosus) cv. Vitória. (Tese)
Doutorado em Biotecnologia- Universidade Federal do Espírito Santo, 2014.
DANKÓ, K.; PONYI, A.; CONSTANTIN, T.; BORGULYA, G.; SZEGEDI, G. Long-term survival of patients with idiopathic inflammatory myopathies according to clinical features. Medicine, v. 83, n. 1, p. 35-42, 2004.
DIORGE, J.; MARMIT, T.; REMPEL, C.; GOETTERT, M.; SILVA, A. plantas medicinais da renisus com potencial anti-inflamatório: revisão sistemática em três bases de dados científicas. Revista Fitos, v. 9, n. 2, p. 73-159, 2015.
FRANÇA-SANTOS, A.; ALVES, R. S.; LEITE, N.S; FERNANDES, R.P.M. Estudos bioquímicos da enzima bromelina do Ananas comosus (abacaxi). Scientia Plena, v. 5, n. 11, 2009.
FRANCO, A.D.; PEREIRA, L.E.; GROSCHITZ, M.; AIMBIRE, F.; MARTINS, R.A.B.L.; CARVALHO, R.A.. Análise do efeito do ultra-som no edema inflamatório agudo – estudo experimental. Fisioterapia em Movimento, v. 18, n. 2, 2017.
MEGRAJ, K.V.K.; RAJU, K.; BALARAMAN, R.; MEENAKSHISUNDARAM, K. Biological activities of some Indian medicinal plants. Journal of Advanced Pharmacy Education &
Research, v.1, p. 2-44, 2011.
MENDES, D.A.G.B. Ação anti-inflamatória cutânea de uma planta nativa brasileira:
Sapium glandulatum (Vell.) Pax. (Tese) Doutorado em Farmacologia - Universidade
Federal do Paraná, Curitiba, 2015.
MUQARRABUN, L.M.R.; AHMAT, A.L.; ARIS, S.; RUZAINA, S. A review of the medicinal uses, phytochemistry and pharmacology of the genus Sapium. Journal Of Ethnopharmacology, v. 155, n. 1, p. 9-20, 2014.
OLIVEIRA, M.L.M.; PINHEIRO, D.C.S.N. Cellular and molecular biomarkers involved in immune-inflammatory response modulated by unsaturated fatty acids. Acta Veterinaria
Brasilica, v. 7, n. 2, p. 1-12, 2013.
OMOTOYINBO, O. V; SANNI, D. M. characterization of bromelain from parts of three different pineapple varieties in Nigeria. American Journal of Bioscience, v. 5, n. 3, p. 35-41, 2017.
PALHARES, D.B.; LEME, L.M. Miosite ossificante progressiva: uma perspectiva no controle da doença. Jornal de Pediatria, v. 77, n.5 p. 431-434, 2001.
REGO, L.M. Avaliação do efeito anti-inflamatório do óleo essencial da alpínia zerumbet
na miosite induzida por carragenina no tecido muscular do gastrocnêmio em ratas. (Dissertação) Mestrado em Saúde e Ambiente - Universidade Tiradentes Programa
de Pós-graduação em Saúde e Ambiente, Aracaju, 2014.
TAN J.A.; ROBERTS-THOMSON P.J.; BILIMBERGS P.; HAKENDORT P.; COX S.R.; LIMAYE V. Incidence and prevalence of idiopathic inflammatory myopathies in South Australia: a 30-year epidemiologic study of histology-proven cases. International Journal of