Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10-

Após obter evidências de que as referidas manchas azuis, observadas na CCD, causam a inibição do crescimento de C. glabrata ATCC2001, foi realizado um fracionamento da fração 02-PLL03, por diferentes processos cromatográficos, a fim de isolar essas substâncias bioativas. Desse processo, não foi possível obter substâncias isoladas em quantidade suficiente para a realização de testes biológicos, porém foi possível obter uma fração, que se apresentou como uma única mancha azul após análise por CCD e revelação com vanilina sulfúrica, com pureza e quantidade suficiente para análises estruturais por ressonância magnética nuclear (RMN). Conforme será descrito na seção posterior, foram realizadas análises por RMN monodimensional e bidimensional, que possibilitaram a identificação de uma saponina com núcleo damarano, equivalente ao da jujubogenina. Detalhes da elucidação estrutural são apresentados no item 6.7. Assim, esse resultado corrobora com a hipótese de que as manchas azuis são saponinas.

Além disso, a partir desse fracionamento, foram obtidas frações concentradas em manchas que apresentam cor amarela na CCD, após revelação com vanilina sulfúrica, e fluorescência azul sob visualização com luz UV a 365 nm, característico de cumarinas.

A partir da fração 07-CCFR07, enriquecida em saponinas e de rendimento satisfatório, e da fração 10-CCFR12, concentrada nas hipotéticas cumarinas, foi realizado um novo teste de microdiluição em caldo RPMI-1640, utilizando um leque maior de microorganismos. As amostras foram testadas frente às 8 cepas de referência de Candida spp e T. asahii., com o objetivo de averiguar se a atividade da fração 07-CCFR07 se estenderia para as outras cepas, ao mesmo tempo em que se avaliaria a possibilidade de as hipotéticas cumarinas também contribuírem para o efeito antifúngico.

A fração 10-CCFR12, dentro do intervalo de concentração e do critério para a determinação da CIM utilizados, não foi capaz de inibir qualquer uma das 8 cepas de referência. Por outro lado, a fração 07-CCFR07, além de inibir o crescimento de C.

glabrata, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. rugosa e T. asahii com baixas CIMs. A média da CIM para C. albicans e C. glabrata foi equivalente (94 µg/mL), assim como entre C. dubliniensis e

C. parapsilosis (CIM = 188 µg/mL), e entre C. rugosa e T. asahii (CIM = 125 µg/mL)

(Tabela 24; Figura 31)

Após a observação da CIM, a concentração fungicida mínima (CFM) foi determinada por meio do repique em ASD do conteúdo dos poços que não apresentaram crescimento visível. As cepas de Candida rugosa ATCC10571 e

Trichosporon asahii CBS2630 apresentaram CFM correspondente a CIM, o que

significa dizer que a concentração de 125 µg/mL apresentou efeito fungicida frente a essas duas cepas. Em contrapartida, para C. albicans ATCC90028, C. dubliniensis CBS7987, C. parapsilosis ATCC22019 e C. glabrata ATCC2001, a CIM apenas foi capaz de apresentar efeito fungistático, porém em concentrações superiores apresentou efeito fungicida.

Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de Candida.

Cepas de referência CIM (mg/mL)* CFM (mg/mL)*

Candida albicans ATCC90028 0,094±0,044 0,3125±0,265

Candida tropicalis ATCC13803 +** +

Candida dubliniensis CBS7987 0,188±0,088 0,5±0

Candida parapsilosis ATCC22019 0,188±0,088 +

Candida glabrata ATCC2001 0,094±0,044 0,125±0

Candida krusei ATCC6258 + +

Candida rugosa ATCC0571 0,125±0 0,125±0

Trichosporon asahii CBS2630 0,125±0 0,125±0

* Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2)

Figura 31 - Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07.

A =. Candida albicans. B = C. tropicalis. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C. glabrata. F =

C. krusei. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Coluna 1 = Controle de esterilidade da amostra.

Coluna 2 – 9 = diluição da amostra. Coluna 10, 11 e 12 = controle de viabilidade do inóculo, controle

de viabilidade na presença de DMSO, controle de esterilidade do meio. Fonte: autor.

Duplicata 1

Figura 32 - Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração 07- CCFR07.

1 = duplicata 1. 2 = duplicata 2. A = Candida albicans. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C.

glabrata. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Numeração de 2 a 6 indica os possos que não

apresentaram creacimento visível. Número 10 = controle de viabilidade do inoculo. CN = controle negativo. Fonte: autor.

Na literatura, há estudos que demonstram a capacidade de extratos vegetais e substâncias isoladas, como saponinas, em inibir a transição morfológica de

Candida albicans de blastoconídio para hifa verdadeira, um importante fator de

virulência desta espécie (CHEVALIER.; MEDIONI; PRÊCHEUR, 2012; LAURENÇON et al., 2013; SILVA-ROCHA et al., 2015). Baseado nisso, foi realizada uma análise por microscopia óptica do conteúdo dos poços da microplaca (réplica 1) após a incubação. Retirou-se uma amostra do poço A6 (CIM da réplica 1) e do poço A10 (controle de viabilidade do inóculo da réplica 1), os quais continham a levedura

Candida albicans ATCC90028. Como resultado, foi observada a presença de

blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas bem desenvolvidas no poço A10 (figura 33A); por outro lado, para o poço A6, no qual havia ocorrido efeito fungistático, foi observada a presença de alguns blatoconídios e a ausência de hifas (figura 33B). A partir desses indícios, é possível sugerir que essas saponinas tenham a capacidade de inibir a filamentação de Candida albicans, um importante fator de virulência envolvido na invasão tecidual durante o processo infeccioso (SUDBERY, 2011). Assim, são necessários mais estudos para avaliar se essa inibição se estende para outras cepas de Candida e como ela ocorre.

Figura 33 - Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans ATCC90028.

Visualização em objetiva de 100x. A = poço A10, controle de viabilidade. B = poço A6, 62,5 µg/mL da fração 07-CCFR.07. Fonte: autor.

Todos os resultados apresentados até o momento corroboram para as hipóteses de que as saponinas são as principais substâncias responsáveis pela atividade anti-Candida e de que, previamente ao fracionamento, estavam em baixa concentração no EHF. Além disso, é importante mencionar o potencial antifúngico, ao menos in vitro, que essas substâncias apresentam, pois uma fração foi capaz de inibir diferentes cepas de Candida, além de Trichosporon asahii CBS2630, numa concentração média abaixo de 190 µg/mL. Por conseguinte, as saponinas isoladas podem apresentar CIMs ainda menores e potencial para inibir um maior número de cepas.

6.6.6 Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a isolados