O uso de plantas medicinais, ao contrário da opinião popular, pode causar danos à saúde, principalmente quando exercido de forma irracional. No Brasil, as plantas comumente são utilizadas sem que existam evidências científicas da sua eficácia e segurança, o que pode comprometer o tratamento ou causar reações adversas (LANINI et al., 2009).
Outro problema é a qualidade da droga vegetal e de seus derivados comercializados, que podem estar contaminados, adulterados, apresentarem falsa autenticidade ou conter quantidade insuficiente de substâncias ativas para promover um efeito terapêutico (ZHANG et al., 2012). Portanto, além de testes farmacológicos e toxicológicos não-clinicos e clinicos, devem ser realizados ensaios de controle de qualidade para garantir a constância da segurança e eficácia do produto.
Uma das estratégias utilizadas no controle de qualidade de plantas medicinais e fitoterápicos é o emprego de marcadores químicos, que podem ser substâncias relacionadas diretamente ou não ao efeito terapêutico. Por exemplo, um marcador pode ser uma molécula com atividade farmacológica ou uma substância majoritária da planta. A sua quantificação apresenta várias aplicações, tanto para fins de fiscalização quanto para a padronização e monitoramento da qualidade de fitoterápicos durante a sua produção (LI et al., 2008).
A qualidade dos produtos à base de plantas medicinais comercializadas no Brasil é cada vez mais preocupante. Pesquisas realizadas em diferentes regiões do país constataram diversas irregularidades, que podem comprometer a eficácia do produto e pôr em risco a saúde do consumidor. Estas irregularidades envolvem a
presença de resíduos de pesticidas, elevado teor de impurezas e de umidade, ausência ou baixa concentração dos constituintes ativos, adulterações, além de informações inadequadas na embalagem do produto (ZUIN; YARIWAKE; BICCHI, 2004; BARA et al., 2006; MELO et al., 2007; DIAS et al., 2013).
Em resposta a esse problema, existe a resolução RDC 26/2014, de 13 de maio de 2014, que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de medicamentos fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, além da resolução RDC 17/2010, que trata das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Segundo estas resoluções, os medicamentos fitoterápicos são caracterizados pelo conhecimento da sua eficácia e segurança, assim como pela constância da sua qualidade.
A determinação do perfil cromatográfico, prospecção fitoquímica e análise quantitativa do(s) marcador(es) estão entre os testes exigidos pela RDC 26/2014 para o registro de fitoterápicos, os quais devem ser apresentados em laudos de análises da matéria-prima vegetal e do produto acabado. Estes testes também são necessários ao cumprimento das boas práticas de fabricação de medicamentos fitoterápicos, como consta na RDC 17/2010 (BRASIL, 2010).
Segundo a RDC 26/2014, marcador é um composto ou classe de compostos químicos presentes na matéria-prima vegetal que é utilizado como referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do medicamento fitoterápico, possuindo preferencialmente relação com o efeito terapêutico (BRASIL, 2014). Durante o processo de fabricação, os marcadores químicos podem ser utilizados como padrões de referência no controle de qualidade da matéria-prima vegetal e do produto acabado, podendo ser escolhidos com base em estudos que o tenham caracterizado, nos casos de ausência na Farmacopeia Brasileira, ou em outro código reconhecido pela Anvisa (BRASIL, 2010). Baseado nisso, a escolha e determinação de marcadores químicos para a espécie Ziziphus joazeiro Mart. mostra-se muito importante para auxiliar no controle de qualidade da droga vegetal e de seus derivados.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Caracterização dos marcadores químicos e a avaliação das atividades anti-
Candida in vitro e protetora em modelo de colite experimental in vivo a partir do
extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Martius.
3.2 Objetivos específicos
• Identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. e candidatos a marcadores químicos, utilizando reações químicas clássicas, cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos;
• Isolar e caracterizar por técnicas espectroscópicas possíveis marcadores químicos da espécie Z. joazeiro Mart.;
• Avaliar a atividade antifúngica do extrato, frações, e/ou substâncias isoladas mais ativas por meio do ensaio de bioautografia e da determinação da
concentração inibitória mínima e fungicida mínima em microdiluição em caldo, frente a cepas de Candida;
• Isolar e caracterizar os compostos responsáveis pela atividade antifúngica;
• Avaliar o potencial protetor do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a colite experimental utilizando parâmetros clínicos murinométricos;
• Determinar o efeito do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a concentração de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em tecido colônico.
4 JUSTIFICATIVA
Embora a espécie Z. joazeiro Mart. seja amplamente utilizada pela população da região Nordeste do país, pode-se observar que há uma escassez de estudos químicos com a espécie. Com base nos estudos relatados na literatura, sabe-se que as saponinas e triterpenos têm atividades interessantes e que apresentam um altor teor nas cascas de Z. joazeiro Mart., amplamente utilizadas para o preparo de produtos de higiene como shampoo e pasta dental (BARRETO et al., 2005). Entretanto, visto que as folhas da espécie também são utilizadas medicinalmente, não foram encontrados estudos na literatura que envolvam o isolamento e caracterização de substâncias que venham a ser marcadores químicos, o que justifica a proposta deste estudo.
Ainda, pode-se destacar que a utilização das folhas como matéria-prima é mais interessante do ponto de vista ecológico, tendo em vista que dependendo da forma como é retirada a casca de algumas plantas, pode ocasionar a morte do vegetal. Ademais, as folhas geralmente são consideradas um subproduto das indústrias.
A presente proposta vai ao encontro da RDC nº 26, de 13 de maio de 2014, que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de medicamentos fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, em que faz-se necessário caracterizar um marcador, que pode ser ou não a substância ativa, para que em todas as fases da produção e desenvolvimento de um medicamento fitoterápico mantenha-se constante o teor desse metabólito.
Com relação ao potencial antifúngico, alguns estudos foram relatados para a espécie (BRITO et al., 2014; CRUZ et al., 2007; MELO et al., 2012; RIBEIRO et al., 2013), mas nenhum desses apresentou uma investigação mais aprofundada da atividade antifúngica, tampouco a caracterização dos componentes responsáveis por essa atividade.
No que se refere à atividade anti-inflamatória, até o momento não há na literatura estudos que tenham avaliado o potencial anti-inflamatório da espécie em modelos de doença inflamatória intestinal.
Dentro deste contexto, a proposta principal deste trabalho é isolar e caracterizar marcadores químicos do extrato de Z. joazeiro Martius, além da avaliar a atividade antifúngica por meio de um fracionamento biomonitorado, em
colaboração com o Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves (UFRN), e a atividade protetora em modelo de colite experimental, em colaboração com a Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernado Guerra (UFRN).
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Solventes e reagentes
Os solventes e reagentes utilizados para a realização da análise fitoquímica e avaliação da atividade antifúngica foram de origem diversa, incluindo Merk®, Vetec®, Chemis®, Neon®, Synth®, Dinâmica®, Alphatec® e Panreac®. Foram utilizados os solventes acetato de etila, acetona, acetonitrila, água destilada, água ultrapura, clorofórmio, diclorometano, dimetilsulfóxido, etanol, éter de petróleo, hexano, metanol, n-butanol e tolueno; os ácidos e bases incluíram ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico, hidróxido de amônio e amônia. Os solventes utilizados foram de grau analítico, exceto os usados para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), os quais foram de grau espectroscópico.
A água utilizada nos experimentos, incluindo o preparo dos extratos, foi destilada e o etanol foi de procedência variada.
Os reagentes utilizados para a detecção de classes de metabólitos secundários foram: Bertrand (ácido sílico-túngstico), Dragendorff
(tetraiodobismutato de potássio) e Mayer (tetraiodomercurato de potássio) para alcaloides; cloreto férrico para compostos fenólicos; difenilboriloxietilamina e magnésio em pó para flavonoides, KOH 5% (p/v) para a detecção de cumarinas e antraquinonas; vanilina sulfúrica para a detecção universal.