5.8.1 Animais
Ratas (180-250g), da espécie Rattus norvegicus albinus foram obtidas do biotério da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura controlada de 25 ± 2°C, ciclo claro- escuro, com acesso à comida e água ad libitum, sendo submetidos a jejum somente 12 horas antes do experimento. Todos os procedimentos visaram minimizar o número de animais empregados nos testes e qualquer desconforto que possa a provir desses. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFRN sob o número de protocolo 067/2015.
5.8.2 Modelo de colite aguda
As ratas (n = 7/ grupo) foram distribuídas aleatoriamente em grupos de indução da doença inflamatória intestinal (DII) com tratamento por administração do extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Mart. ou sulfassalazina, e grupos controles. A DII foi induzida pelo ácido 2,4 dinitrobenzóico (DNBS), com duração de 4 dias.
A indução da colite aguda foi realizada pelo método descrito por Morris et al., (1989) e Gálvez et al. (2000) com pequenas modificações. Os animais foram submetidos a um período de jejum de 24 horas e, posteriormente, anestesiados com 10% de ketamina (70 mg/Kg, Quetamina, Sintec, São Paulo) e 2% de xilazina (10 mg/Kg, Sintec, São Paulo). O DNBS foi preparado numa concentração de 120 mg/mL, dissolvidos em uma solução a 50 % de etanol v/v. A solução hidroetanólica de DNBS foi administrada por via retal, num volume de 0,25 mL, com o auxílio de um catéter de teflón (diâmetro de 2 mm) acoplado a uma seringa de 1 mL. O catéter foi introduzido no ânus das ratas até uma distância de 8 cm. Os animais do grupo controle negativo foram submetidos ao mesmo procedimento, porém com a administração de solução salina em substituição ao DNBS. Após a administração do hapteno, os animais foram
mantidos em posição vertical, com a cabeça voltada para baixo, por 15 minutos de modo a evitar o extravasamento do agente indutor.
Os tratamentos receberam, por gavagem, 1 mL de uma suspensão do extrato em solução salina (0,9 %, v/v), uma vez ao dia em três doses: 50 mg/kg (dose baixa), 100 mg/Kg (dose média) e 200 mg/kg (dose alta). Outro grupo recebeu 1 mL de sulfassalazina a 250 mg/Kg por via oral. Os tratamentos foram realizados às 72, 48, 24 e 2 horas antes da indução de colite, assim como 4 dias após. Como padrão de comparação, foi utilizado o grupo controle, ao qual foi induzida a colite, mas sem tratamento farmacológico (controle positivo) e um grupo saudável (controle negativo), ao qual não foi induzido o processo inflamatório colônico. Os animais dos grupos controle positivo e negativo receberam 1 mL de solução salina, por via oral. Todos os animais foram eutanasiados 4 dias após a indução da colite por overdose de tiopental associado a lidocaína. (Quadro 5)
Quadro 5 - Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da atividade do EHF de Z. joazeiro Mart.
Grupos Tratamento via oral
Grupo 1 (7 animais) Salina 0,9% v/v Grupo 2 (7 animais) Salina 0,9 % v/v
Grupo 3 (7 animais) EHF 50 mg/kg
Grupo 4 (7 animais) EHF 100 mg/kg
Grupo 5 (7 animais) EHF 200 mg/kg
Grupo 6 (7 animais) sulfassalazina 250 mg/kg - oral Grupo 1: controle negativo; Grupo 2: controle positivo
5.8.3 Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal
5.8.3.1 Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal
A severidade clínica do modelo murino de inflamação intestinal foi avaliada com base no exame diário da perda de peso, consistência fecal e presença macroscópica de sangue nas fezes. O peso e o aspecto das fezes dos animais foram determinados no primeiro dia do experimento, antes da administração dos tratamentos, até o último dia, antes da eutanásia dos animais. A perda de peso foi calculada como a diferença entre o peso corporal no dia anterior ao da indução e qualquer dia após a indução. Para cada parâmetro (perda peso, consistência fecal, presença de sangue) foi atribuído um escore, cujo valor baseou-se nos critérios apresentados no Quadro 6. O Índice de Atividade da Doença (IAD) foi calculado para cada animal por meio da média dos três parâmetros já mencionados. Quanto maior o valor do IAD, mais severa é a condição clínica apresentada pelo animal ou grupo de animais.
Quadro 6 - Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença inflamatória intestinal.
Pontuação Critérios
Perda de Peso Consistencia das fezes Sangramento
0 0 Normal Normal
1 1--10 Pouco branda -
2 11--15 Fezes brandas Sangue oculto
3 15 - 20 Pastosa -
4 >20 Diarreia Sangue
5.9.3.2 Determinação do dano macroscópico
Para a determinação do dano macróscopico, os animais foram primeiramente eutanasiados através da injeção de uma overdose de tiopental sódico (90 mg/kg) por via intraperitoneal, associado com lidocaína (10 mg/mL). Subsequentemente, o seguimento colônico foi extraído na sua totalidade, lavado com solução fisiológica e, em seguida, colocado sobre uma placa de Petri com gelo para a remoção das aderências mesentéricas.
Posteriormente, foi verificado o seu peso, em balança eletrônica digital, e medido o seu comprimento total para determinação da relação peso/longitude (P/L). O cólon foi então aberto longitudinalmente para que fosse avaliada a extensão da área inflamada e o Índice de Dano Macroscópico (IDM). O IDM de cada animal foi determinado com base na presença de parâmetros de inflamação, na quantidade de úlceras e na extensão do dano tissular, medida com o auxílio de uma régua (BELL; GALL; WALLACE, 1995) (Quadro 7)
Quadro 7 - Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995).
Pontuação Critério
0 Cólon normal (sem dano)
2 Ulceração sem hiperemia nem engrossamento da parede 3 Ulceração com ponto de inflamação
4 Dois ou mais sítios de ulceração e/ou inflamação
5 Zonas grandes de inflamação e ulceração com uma extensão maior que 1 cm
6-10 Zonas grandes de dano tissular com uma extensão maior que 2 cm, adicionando-se 1 (até 10) ponto a cada 1 cm adicional de extensão.
Em seguida, o colón foi cuidadosamente seccionado em cortes longitudinais, os quais foram armazenados a -20 °C para uma posterior avaliação histopatológica e para a determinação de marcadores do processo inflamatório e estresse oxidativo tecidual.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO