Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato hidroetanólico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória intestinal

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO. Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTICandida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL. NATAL-RN 2016.

(2) MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO. Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTICandida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner Co-orientadores: Guilherme Maranhão Chaves Gerlane Coelho Bernardo Guerra. NATAL-RN 2016.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Universidade Federaldo doCentro Rio Grande do Norte - UFRN Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Ciências da Saúde - CCS Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde Souza Neto, Manoel André de. Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato Souza Neto, fracionamento Manoel André bioguiado de. hidroetanólico das folhas, anti-Candida Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória hidroetanólico das Neto. folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida intestinal / Manoel André de Souza - Natal, 2016. 262f.: il. e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória intestinal / Manoel André de Souza Neto. - Natal, 2016. Orientador: Silvana Maria 262f.: il. Zucolotto Langassner. Coorientadores: Guilherme Maranhão Chaves, Gerlane Coelho Bernardo Guerra. Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner. Dissertação (Mestrado) - ProgramaGuilherme de Pós-Graduação Ciências Coorientadores: MaranhãoemChaves, Gerlane Coelho Farmacêuticas. Centro de Guerra. Ciências da Saúde. Universidade Federal Bernardo do Rio Grande do Norte. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Ziziphus joazeiro - Dissertação. 2. Fitoquímica Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria- Zucolotto. II.2.Chaves, 1. Ziziphus joazeiro Dissertação. Fitoquímica Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV. Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida Título. Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Chaves, RN/UF/BS-CCS. Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV. CDU 634.662 Título. RN/UF/BS-CCS. CDU 634.662.

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(5) AGRADECIMENTOS. Primeiramente, à minha família, especialmente aos meus pais, Margarida e Francisco, e ao meu irmão, Francisco Júnior, por todo carinho, suporte e incentivo durante essa jornada inicial na área acadêmica. À Profa. Silvana Maria Zucolotto Langassner, pela orientação, paciência, confiança e principalmente por apoiar as minhas ideias, por vezes mirabolantes, que surgiram durante a realização deste trabalho. Muito obrigado pela oportunidade. Ao meu co-orientador micologista, Prof. Guilherme Maranhão Chaves, por todo auxílio, orientação e ensinamentos, fundamentais para a realização da etapa de atividade antifúngica deste trabalho. A todos do laboratório de Microbiologia Clínica e Micologia Médica e Molecular (LMMM), principalmente ao doutorando Plínio Rocha, pelo auxílio na realização dos experimentos de atividade antifúngica. A minha co-orientadora, Profa. Gerlane Coelho Bernardo Guerra, pela orientação, apoio e, por assim dizer, otimismo na realização dos experimentos in vivo de doença inflamatório intestinal. A todos do laboratório de Farmacologia do CB pela enorme ajuda prestada na realização dos experimentos de doença inflamatório intestinal, incluindo os técnicos Flávio, Carla, César e Dona Neida, além dos alunos de IC Valéria, Iuri e Cássio. Agradeço especialmente a doutoranda Daline por todo o auxílio e aprendizado proporcionados. Ao Prof. Freddy Alejandro Ramos e ao Geison Modesti Costa pela orientação, essencial suporte e ensinamentos fornecidos durante a realização dos experimentos na Universidade Nacional de Colombia (UNAL), Laboratório de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia. A operadora do equipamento de RMN da UNAL, Katherine Jaramillo, por todo cuidado e atenção na obtenção dos espectros. A todas as pessoas da UNAL e Bogotá que me ajudaram e contribuíram, de alguma forma, para a realização deste trabalho. Aos colegas do laboratório de Farmacognosia da UFRN/PNBio pela ajuda e amizade. Em especial, ao meu “ex” IC Jordan, pelo auxílio na realização dos experimentos, e a Samara, por ter me ensinado boa parte do que sei sobre fitoquímica, pelas dicas, trocas de ideias e ajuda nos experimentos de isolamento. Aos professores Josean Fechine Tavares e Norberto Peporine Lopes, assim como aos técnicos Evandro Ferreira e José Carlos Tomaz, pela colaboração nas análises de RMN e espectrometria de massas, respectivamente. À UFRN, Faculdade de Farmácia e Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela oportunidade de formação. À CAPES e ao CNPq pelo auxílio financeiro a essa pesquisa..

(6) RESUMO A espécie Ziziphus joazeiro é uma planta da Caatinga do Nordeste brasileiro, utilizada como antiséptico, dentifrício, anticaspa, anti-inflamatório e antimicrobiano. A maioria dos estudos químicos relatou a presença de triterpenos nas cascas da espécie. Quanto às folhas, os estudos fitoquímicos são escassos, envolvendo apenas a triagem fitoquímica. Até o momento não foram caracterizadas as substâncias responsáveis pela atividade antifúngica das folhas e não foi encontrado nenhum estudo que tenha avaliado o seu efeito anti-inflamatório em modelo de doença inflamatória intestinal. Portanto, o trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar os marcadores químicos do extrato hidroetanólico das folhas (EHF) e desenvolver um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantifica-los. Em paralelo a isso, objetiva-se avaliar a atividade antiCandida do extrato, frações e substâncias isoladas de Z. joazeiro, por meio de um fracionamento bioguiado, além de avaliar o efeito protetor do EHF em modelo de doença inflamatória intestinal (colite) induzida por DNBS. O EHF foi preparado por meio de maceração, o qual foi posteriormente particionado com solventes de polaridade crescente. O extrato e as frações foram analisados por reações químicas clássicas, Cromatografia em Camada Delgada, CLAE e CLAE acoplada a espectrômetro de massas (CLAE-EM), sendo observada a presença de saponinas, ácidos fenólicos, cumarinas, e flavonoides glicosilados derivados de quercetina, canferol e isormanetina ou o seu isômero, tamarixetina. Por meio das análises por CLAE-EM foi possível identificar glicosídeos de quercetina (quercetina-3-Orutinosídeo, quercetina-3-O-galatosídeo, quercetina-3-O-glicosídeo), canferol (canferol-3-O-rutinosídeo) e isoramnetina ou tamarixetina (isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-galactosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-glicosídeo). Para o isolamento dos flavonoides majoritários, a fração acetato de etila foi submetida à técnica de Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade aliada ao refinamento por zona de pH, seguido de cromatografia em coluna de fase reversa e CLAE semipreparativa. Desse processo, foram isolados 3 flavonóis (ZJF1, ZJF2 e ZJF3), os quais foram identificados, pela análise conjunta de dados cromatográficos e RMN de 1H, como quercetina-3-O-rutinosídeo, canferol-3-O-rutinosídeo e isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, respectivamente. A partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo, aliada a bioautografia, observou-se que a fração butanólica apresentou maior atividade antifúngica frente à Candida glabrata ATCC2001 (CIM = 0,625 mg/mL), e que o processo de concentração das substâncias hipoteticamente bioativas permitiu obter frações com maior atividade anti-Candida in vitro frente a cepas de referência e clínicas. Foi observado que as principais substâncias responsáveis são as saponinas, e a partir de uma dessas frações isolou-se a saponina bacopasídeo X, presuntivamente identificada por análises mono e bidimensionais de RMN. A atividade anti-inflamatória do EHF foi avaliada em modelo de doença inflamatória intestinal nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, não sendo observado efeito protetor do EHF em relação ao grupo controle positivo. Os resultados obtidos são inéditos para a espécie e o estudo abre perspectivas para a realização de novas investigações envolvendo o uso de flavonoides e saponinas no controle de qualidade e avaliação da sazonalidade, além do estudo do mecanismo de ação das saponinas das folhas sobre as leveduras do gênero Candida. Palavras-chave: Ziziphus joazeiro, flavonoides, saponinas Candida, colite.

(7) ABSTRACT The species Ziziphus joazeiro is a Caatinga plant from Northeast Brazil, used as an antiseptic, dentifrice, anti-dandruff, anti-inflammatory, and antimicrobial. Most chemical studies reported the presence of triterpenes in the bark of the species. Regarding the leaves, the phytochemical studies are scarce, only involving phytochemical screening. The substances responsible for the antifungal activity of leaves have not yet been characterized and no study has evaluated its antiinflammatory effect in inflammatory bowel disease model. Therefore, this study aims to isolate and characterize the chemical markers of hydroethanolic extract of the leaves (HEL), and develop an analytical method by high-performance liquid chromatography (HPLC) to quantify them. Parallel to this, the study aims to evaluate the anti-Candida activity of the extract, fractions and isolated substances from Z. joazeiro through a bioguided fractionation, and to evaluate the HEL protective effect in a DNBS induced model of inflammatory bowel disease (colitis). The HEL was prepared by maceration, which was further partitioned with increasingly polar solvents. The extract and the fractions were analyzed by classical chemical reactions, Thin Layer Chromatography, HPLC and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), being observed the presence of saponins, phenolic acids, coumarins and flavonoid glycosides derived from quercetin, kaempferol and isorhamnetin or its isomer, tamarixetin. Through HPLC-MS analysis it was identified quercetin glycosides (quercetin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-galatosídeo, quercetin3-O-glycoside), kaempferol (kaempferol-3-O-rutinoside) and isorhamnetin or tamarixetin (tamarixetina-3-O-rutinoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-Ogalactoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-glucoside). For the isolation of the major flavonoids, the ethyl acetate fraction was subjected to a pH-zone-refining high speed countercurrent chromatography, followed by reversed phase column chromatography and semi-preparative HPLC. In this process, 3 flavonols were isolated (ZJF1, and ZJF2 ZJF3), which were identified by the joint analysis of chromatographic data and 1 H NMR as quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-rutinoside and isorhamnetin or tamarixetin-3-O-rutinoside, respectively. From the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by broth microdilution, coupled with bioautography, it was observed that the butanol fraction had higher antifungal activity against Candida glabrata ATCC2001 (MIC = 0.625 mg / mL), and the process of concentration of the hypothetically bioactive substances afforded fractions which had more anti-Candida activity in vitro against clinical and reference strains. It was observed that the main substances involved are saponins, and through a saponin rich fraction it was isolated bacopaside X, presumptively identified by one and two-dimensional NMR analyzes. The anti-inflammatory activity of EHF was evaluated in a model of inflammatory bowel disease in doses of 50, 100 and 200 mg / kg and it was not observed protective effect of the HEL compared to the positive control group. The results are novel for the species and the study opens perspectives for new investigations involving the use of flavonoids and saponins in quality control and evaluation of seasonality, besides the study of the mechanism of action of leaves saponins on the Candida genus. Key-words: Ziziphus joazeiro, flavonoids, saponins Candida, colitis.

(8) LISTA DE FIGURAS Figura 1 -. Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius. ............................................ 31. Figura 2 -. Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius. .................................... 32. Figura 3 -. Representação do teste de microdiluição em caldo. ........................ 72. Figura 4 -. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para glicosídeos ....................................................................................... Figura 5 -. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para agliconas. ......................................................................................... Figura 6 -. 94. Cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e frações. ................................................................... Figura 12 -. 90. Espectros de UV (210-450 nm) dos 25 picos observados na análise por CLAE-UV-DAD do EHF de Z. joazeiro Mart. .................. Figura 11 -. 90. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da partição líquido-líquido .................................................... Figura 10 -. 88. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da partição líquido-líquido. ................................................... Figura 9 -. 86. Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de rutina e isoquercetina. ................................................................. Figura 8 -. 85. Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de quercetina e canferol ................................................................... Figura 7 -. 83. 97. Comparação entre os cromatogramas obtidos para a fração AcOEt-PLL01 nos equipamentos de CLAE-UV-DAD e CLAE-EMTOF, sob o comprimento de onda de 340 nm. ................................ 105. Figura 13 -. Análise por CCD das fases dos testes em tubos para os sistemas contendo acetato de etila-butanol-água........................................... 108. Figura 14 -. Análise por CCD das frações da separação CCCAV1..................... 110. Figura 15 -. Análise por CCD das frações da separação CCCAV4..................... 110. Figura 16 -. Análise por CCD das frações da separação CCCAV5..................... 110. Figura 17 -. Análise por CCD das frações da separação CCCAV6..................... 111. Figura 18 -. Análise por CCD das frações da separação CCCAV11................... 111. Figura 19 -. Análise por CCD dos flavonoides ZJF1, ZJF2, ZJF3 e das misturas ZJFM1 e ZJFM2................................................................ 112. Figura 20 – Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF1. .................... 114.

(9) Figura 21 -. Representação estrutural do flavonol quercetina. ............................ 115. Figura 22 -. Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF1 (400 MHz, metanol-d4). .................................................................................... 118. Figura 23 -. Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF2. .................... 120. Figura 24 -. Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF2 (400 MHz, metanol-d4). .................................................................................... 123. Figura 25 -. Possibilidades estruturais para o flavonoide ZJF3. .......................... 126. Figura 26 -. Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF3. .................... 128. Figura 27 -. Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF3 (400 MHz, metanol-d4) ..................................................................................... 129. Figura 28 -. Ensaio de microdiluição em caldo para as frações da fração BuOH-PLL01. .................................................................................. 135. Figura 29 -. Bioautografia e análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e da fração BuOH-PLL01. ....................................................................... 137. Figura 30 -. Bioautografia e análise por CCD das subfrações da fração BuOHPLL01. ............................................................................................ 138. Figura 31 -. Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07.......... 141. Figura 32 -. Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração 07-CCFR07. .................................................................................... 142. Figura 33 -. Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans ATCC90028. ................................................................................... 144. Figura 34 -. Valores de CIM observados para a fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência e cepas clínicas. .............................................. 147. Figura 35 -. Análise por CCD das frações da CFG03. ........................................ 151. Figura 36 -. Análise por CCD das frações da CGF04. ........................................ 152. Figura 37 -. Análise por CCD das frações da cromatografia em coluna de fase reversa 12. ...................................................................................... 153. Figura 38 -. Representação estrutural do núcleo damarano (A) e da saponina bacopasídeo X (B). ......................................................................... 155. Figura 39 -. Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 156. Figura 40 -. Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 157.

(10) Figura 41 -. Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 157. Figura 42 -. Espectro ampliado de. RMN. 13. C da saponina ZJS1(DMSO-d6;. 125 MHz). ....................................................................................... 159 Figura 43 -. Representação estrutural da aglicona jujubogenina. ....................... 160. Figura 44 -. Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 161. Figura 45 -. Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 162. Figura 46 -. Espectro ampliado de HMQC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 163. Figura 47 -. Espectro ampliado de COSY da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz). .............................................................................................. 164. Figura 48 -. Principais correlações de HMBC e COSY observadas para ZJS1... 168. Figura 49 -. Monitorização do peso corporal das ratas durante o período experimental.................................................................................... 171. Figura 50 -. Índice de atividade da doença (IAD) relativo aos grupos tratatos e controle durante o período de pós-indução da doença. ................... 172. Figura 51 -. Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os grupos controle, sobre o escore de dano macroscópico do cólon. .. 173. Figura 52 -. Cólons representativos dos tratamentos e grupos controle. ........... 173. Figura 53 -. Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os grupos controle, sobre a relação peso/longitude (mg/cm) do cólon. 174.

(11) LISTA DE FLUXOGRAMAS. Fluxograma 1 - Fracionamento do EHF por partição líquido:líquido com solventes de polaridade crescente. ............................................ 56. Fluxograma 2 - Isolamento dos flavonoides ZJF1, ZJF2 e ZJF3. ........................ 63. Fluxograma 3 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 09CCFR05, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................. 64. Fluxograma 4 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 07CCFR07, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................. 65. Fluxograma 5 - Esquema do processo de fracionamento por partição líquidolíquido das frações BuOH-PLL01 e 02-PLL02. ........................... 67. Fluxograma 6 - Esquema de isolamento da saponina ZJS1, a partir da fração 02-PLL03. .................................................................................. 69.

(12) LISTA DE TABELAS. Tabela 1 -. Redimento das frações obtidas após a partição líquido-líquido do EHF de Ziziphus joazeiro Martius. .................................................... Tabela 2 -. Sistemas de solventes testados e proporção (v/v) dos seus respectivos componentes. ................................................................ Tabela 3 -. 66. Gradiente utilizado na separação da fração por cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12). ................................................... Tabela 7 -. 62. Rendimento das principais frações obtidas após o fracionamento por partição líquido-líquido da fração BuOH-PLL01. ........................ Tabela 6 -. 60. Gradiente utilizado na separação da fração 12-CCCAV11 por coluna de C18 (CCFR02). ................................................................ Tabela 5 -. 58. Condições cromatográficas das separações realizadas por Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade. ................... Tabela 4 -. 55. 68. Amostras testadas pelo método de microdiluição em caldo e suas respectivas concentrações iniciais e faixa de concentração após a diluição seriada. ............................................................................... Tabela 8 -. 71. Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para glicosídeos. ...................................................................................... Tabela 9 -. 82. Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para agliconas. ......................................................................................... 84. Tabela 10 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart.utilizando os padrões de quercetina e canferol. ....................................................................... 86. Tabela 11 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando os padrões de rutina e isoquercetina. ...................................................................... 87. Tabela 12 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise do EHF de Ziziphus joazeiro Mart.por CLAE-UV-DAD. .................... 93.

(13) Tabela 13 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração CH2Cl2-PLL01 por CLAE-UV-DAD. ................................... 98. Tabela 14 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-UV-DAD. .................................. 100 Tabela 15 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração BuOH-PLL01 por CLAE-UV-DAD. ................................... 101 Tabela 16 - Dados. cromatográficos,. espectroscópicos. (UV). e. de. espectrometria de massas dos principais flavonoides encontrados na fração AcOEt-PLL01. ................................................................. 104 Tabela 17 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide ZJF1. ............................................................................................... 117 Tabela 18 -. Dados espectrais de RMN. 1. H (400 MHz, metanol-d4) do. flavonoide ZJF2............................................................................... 122 Tabela 19 - Dados espectrais de RMN. 1. H (400 MHz, metanol-d4) do. flavonoide ZJF3 e literatura. ............................................................ 127 Tabela 20 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. frente a cepas de referência de leveduras de importância clínica. ......................................................................... 130 Tabela 21 - CIM das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOHPLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de Candida. .............................. 132 Tabela 22 - CIM de frações da fração BuOH-PLL01 frente à levedura Candida glabrata ATCC 2001........................................................................ 135 Tabela 23 - Estatística descritiva das áreas relativas aos halos de inibição observados após o teste de bioautografia. ...................................... 138 Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de Candida........................................................................................... 140 Tabela 25 - Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas clínicas. ....................................................... 146 Tabela 26 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN. 13. C (125 MHz) da. saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a aglicona, em comparação com a literatura. .......................................................... 165.

(14) Tabela 27 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN. 13. C (125 MHz) da. saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a glicona, em comparação com a literatura. .......................................................... 166.

(15) LISTA DE QUADROS. Quadro 1 -. Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart. ............................ Quadro 2 -. Metabólitos isolados de diferentes espécies já estudadas no. 34. gênero Ziziphus. ............................................................................... 36. Quadro 3 -. Códigos dos processos de separação utilizados .............................. 55. Quadro 4 -. Cepas clínicas utilizadas no teste de suscetibilidade........................ 73. Quadro 5 -. Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da atividade do EHF de Z. joazeiro Mart. .............................................. Quadro 6 -. Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença inflamatória intestinal. ....................................................................... Quadro 7 -. 77. 78. Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995). ....... 79.

(16) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AcOEt. acetato de etila. ASD. Ágar Sabourand Dextrose. ATCC. American Type Culture Collection. BuOH. n-butanol. CC. Cromatografia em coluna de vidro. CCCAV. Cromatografia em contra-corrente de alta velocidade. CCD. Cromatografia em Camada delgada analítica. CCFR. Cromatografia em coluna de fase reversa. CFM. Concentração Fungicida Mínima. CGF. Cromatografia em coluna de gel de filtração. CIM. Concentração Inibitória Mínima. CLAE. Cromatografia líquida de alta eficiência. CLAESP. Cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa. CNCA. Candida não-Candida albicans. COSY. Correlation Spectroscopy. CVC. Cateter venoso central. DAD. Detector de arranjo de diodos. DMSO. dimetilsulfóxido. DNBS. ácido 2,4-dinitrobenzóico. EHF. Extrato hidroetanólico das folhas. HMBC. Heteronuclear Multiple-Bond Correlation. HMQC. Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation. IAD. Índice de Atividade da Doença. IDM. Indice de Dano Macroscópico. MeOH. metanol. MHC. Caldo Mueller-Hinton. MMA. Ministério do Meio Ambiente. RMN 13C 1. Ressonância magnética nuclear de carbono 13. RMN H. Ressonância magnética nuclear de hidrogênio. SIDA. Síndrome da Imunodeficiência Adquirida. SISBIO. Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade. UFC. Unidades Formadoras de Colônia.

(17) UTI. Unidade de Terapia Intensiva. UV. Ultravioleta. YPD. Yeast peptone dextrose.

(18) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 22. 2. REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................... 24. 2.1. O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes antifúngicos .......................................................................................... 2.2. 24. As plantas medicinais como alternativa no tratamento de doenças inflamatórias intestinais ....................................................... 28. 2.3. Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais .................................... 30. 2.4. Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius........................ 32. 2.5. Constituintes químicos de Ziziphus joazeiro Martius........................ 35. 2.6. Atividades biológicas descritas para a espécie Ziziphus joazeiro Martius .................................................................................................. 39. 2.6.1. Atividade antifúngica .............................................................................. 39. 2.6.2.. Atividade antibacteriana ......................................................................... 39. 2.6.3. Atividade larvicida .................................................................................. 41. 2.6.4. Atividade antioxidante ............................................................................ 41. 2.6.5. Avaliação toxicológica ............................................................................ 41. 2.6.6. Avaliação do potencial genotóxico .......................................................... 42. 2.6.7. Atividade anti-inflamatória do gênero Ziziphus e da espécie Ziziphus joazeiro Mart........................................................................................... 2.7. 42. Marcadores químicos e controle de qualidade de plantas medicinais ............................................................................................. 43. 3. OBJETIVOS ........................................................................................... 45. 3.1. Objetivo geral........................................................................................ 45. 3.2. Objetivos específicos ........................................................................... 45. 4. JUSTIFICATIVA ..................................................................................... 46. 5. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 48. 5.1. Solventes e reagentes .......................................................................... 48. 5.2. Equipamentos e sistemas cromatográficos utilizados no estudo fitoquímico ............................................................................................ 48. 5.3. Material vegetal: coleta, secagem e moagem ..................................... 50. 5.4. Preparação dos extratos ...................................................................... 50. 5.5. Estudo fitoquímico ............................................................................... 51.

(19) 5.5.1. Análise fitoquímica preliminar ................................................................. 5.5.1.1. Identificação das classes de metabólitos secundários por reações. 51. químicas clássicas.................................................................................. 51. 5.5.1.1.1 Compostos fenólicos .............................................................................. 51. 5.5.1.1.2 Taninos .................................................................................................. 51. 5.5.1.1.3 Flavonoides ............................................................................................ 51. 5.5.1.1.4 Alcaloides ............................................................................................... 52. 5.5.1.1.5 Saponinas .............................................................................................. 52. 5.5.1.2. Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ....................................................................................... 5.5.2. 52. Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquidolíquido por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .................. 53. 5.5.3. Análise da fração AcOEt-PLL01 por espectrometria de massas ............. 54. 5.5.3.1. Partição líquido-líquido ........................................................................... 55. 5.5.3.2. Análise por cromatografia em contracorrente de alta velocidade ............ 56. 5.5.3.2.1 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por cromatografia em contra-corrente de alta velocidade ............................ 5.5.3.3. 57. Isolamento dos flavonoides por cromatografia em coluna e CLAE semipreparativa ...................................................................................... 62. 5.5.3.4. Obtenção das frações para o teste de atividade antifúngica ................... 64. 5.7. Avaliação da atividade antifúngica do EHF e frações ....................... 70. 5.7.1. Determinação da CIM do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações ................. 70. 5.7.1.1. Reativação das leveduras e triagem fenotípica ...................................... 70. 5.7.1.2. Preparo do inóculo ................................................................................ 70. 5.7.1.3. Triagem com micro-organismos de referência ........................................ 71. 5.7.1.4. Determinação da CIM conforme o método do CLSI (CLSI, 2008)........... 73. 5.7.1.5. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ....................... 74. 5.7.1.6. Ensaio de bioautografia .......................................................................... 74. 5.8. Avaliação do efeito protetor do EHF de Z. joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal .......................................... 76. 5.8.1. Animais .................................................................................................. 76. 5.8.2. Modelo de colite aguda .......................................................................... 76. 5.8.3. Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal ................... 78. 5.8.3.1. Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal .......................... 78.

(20) 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 80. 6.1. Análise fitoquímica preliminar............................................................. 80. 6.1.1. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para glicosídeos ..................................................................................... 6.1.2. 80. Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para agliconas ........................................................................................ 84. 6.1.3. Análise por co-cromatografia .................................................................. 85. 6.2. Análise por CCD das frações da partição líquido-líquido do EHF de Z. joazeiro Mart. ................................................................................ 6.3. Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquidolíquido por CLAE-UV-DAD ................................................................... 6.3.1. 89. 91. Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquidolíquido..................................................................................................... 91. 6.4. Análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-IES-EM (TOF) ................ 102. 6.5. Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por cromatografia. em. contra-corrente. de. alta. velocidade. e. isolamento de flavonoides.................................................................. 108 6.5.1. Análise estrutural do flavonoide ZJF1 .................................................... 113. 6.5.2. Análise estrutural do flavonoide ZJF2 .................................................... 119. 6.5.3. Análise estrutural do flavonoide ZJF3 .................................................... 124. 6.6. Avaliação da atividade anti-Candida do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e frações ..................................................................................... 130. 6.6.2. Atividade das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de referência ........................ 132. 6.6.3. Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOHPLL01 .................................................................................................... 133. 6.6.4. Ensaio de bioautografia para o EHF, fração BuOH-PLL01 e respectivas subfrações ativas .......................................................... 136. 6.6.5. Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10CCFR12 frente a cepas de referência segundo o método do CLSI ....... 139. 6.6.6. Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a isolados clínicos segundo o método do CLSI ........................................ 145. 6.7. Isolamento da saponina ZJS1 ............................................................ 151. 6.8. Análise estrutural por RMN da saponina ZJS1 ................................. 154.

(21) 6.9. Avaliação do efeito protetor do extrato hidroetanólico das folhas de Z. joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal ... 170. 7. CONCLUSÕES ..................................................................................... 176 REFERÊNCIAS ..................................................................................... 177 APÊNCIDE A – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO ......................... 192 APÊNDICE B - ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS MENCIONADAS NA DISSERTAÇÃO................................................... 216 ANEXO A .............................................................................................. 262.

(22) 22 1 INTRODUÇÃO. O uso de plantas medicinais acompanha a humanidade desde a pré-história, as quais, ao longo dos anos, formaram a base de sistemas terapêuticos de várias civilizações antigas, como os astecas, incas, chineses, egípcios e gregos. Substâncias obtidas de plantas, como nicotina, muscarina e reserpina, além de terem contribuído significativamente para o avanço da farmacologia e patofisiologia, compõem parte do arsenal terapêutico atualmente utilizado na clínica (PASQUALE, 1984; GILANI; RAHMAN, 2005; FABRICANT; FARNSWORTH, 2001). Apesar da atual predominância, na indústria farmacêutica, de técnicas de química combinatória como estratégia para a descoberta de fármacos, o número de fármacos produzidos e aprovados para uso clínico não aumentou proporcionalmente ao número de compostos sintéticos gerados com base nessas técnicas. Assim, observa-se ainda que as plantas e outros produtos naturais continuam a participar, direta ou indiretamente, desse processo (NEWMAN, 2008; NEWMAN; CRAGG, 2012). Um exemplo da atual utilidade dos vegetais e de outros produtos naturais na obtenção de fármacos é que, em 2010, de todas as moléculas pequenas e inovadoras reportadas (que contem grupos farmacofóricos inéditos), cerca da metade consistia em produtos naturais ou compostos derivados desses (NEWMAN; CRAGG, 2012). De acordo com trabalhos envolvendo compilação de dados, entre 2000 e 2013 foram aprovados 38 medicamentos cujos fármacos derivam de substâncias de espécies vegetais (BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014; SAKLANI; KUTTY, 2008). Além disso, até dezembro de 2013, vinte e um fármacos antineoplásicos derivados de plantas estavam sendo submetidos a ensaios clínicos (BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014). O país que possui a maior variedade dessas fontes de compostos bioativos é o Brasil, as quais estão distribuídas em 6 biomas continentais e um marinho, encerrando cerca de 20% da biodiversidade mundial. Igualmente extensa é a flora brasileira, estimada em cerca de 55.000 espécies vegetais (IBGE, 2004; DIAS, 1995). Diante disso, percebe-se o importante potencial do Brasil como terreno para a bioprospecção sustentável e a consequente geração de emprego, renda e produtos para a saúde, como os medicamentos fitoterápicos (VILLAS BÔAS; GADELHA, 2007)..

(23) 23 Apesar da imensa biodiversidade do Brasil, esta foi pouco explorada, pois estima-se que a busca por compostos bioatlivos foi realizada em apenas cerca de 8% da flora do país (GUERRA; NODARI, 2001). Portanto, considerando a relevância das plantas na descobertcoa de fármacos e a grande diversidade vegetal no país, é de suma importância que as suas espécies vegetais sejam caracterizadas quanto ao seu perfil fitoquímico e atividade biológica. Ziziphus joazeiro Mart. destaca-se como uma das plantas da região semiárida, nativa e endêmica do Brasil e de grande importância para a população do Nordeste (LIMA, 2013a; LORENZI; MATOS, 2008). A árvore, cuja folhagem mantemse verde durante a seca, é usada tanto como forragem quanto como planta medicinal, sendo a casca e as folhas tradicionalmente empregadas na higiene bucal e capilar, no alívio de problemas estomacais (LORENZI; MATOS, 2008), no tratamento de infecções fúngicas (CRUZ et al., 2007) e como anti-inflamatório (OLIVEIRA, 2005). De acordo com a literatura, um extrato concentrado em saponinas extraídas da casca de Z. joazeiro Mart. inibiu o crescimento fúngico de Candida albicans (RIBEIRO et al., 2013), um importante patógeno oportunista de infecções fúngicas invasivas (SARDI et al., 2013).. Logo, o uso popular da casca e da folha em. infecções fúngicas possivelmente tem relação com a presença de saponinas nesses farmacógenos. A partir de análises iniciais realizadas no presente trabalho, observou-se que as folhas possuem, além de saponinas, uma grande variedade de flavonoides glicosilados. Os flavonoides tem apresentado atividade anti-inflamatória em diferentes modelos de inflamação (CHIBLI et al., 2015) e os glicosídeos destacamse por sua atividade anti-inflamatória em modelos de doença inflamatória intestinal (COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE et al., 2014). Portanto, baseando-se no contexto explicitado e considerando a sua importância etnofamacológica, neste trabalho foi realizado um estudo fitoquímico de Z. joazeiro Mart. com o objetivo de isolar e caracterizar marcadores químicos, bem como a avaliação da atividade antifúngica in vitro e protetora em modelo in vivo de colite experimental do extrato hidroetanólico das folhas e suas respectivas frações.

(24) 24 2 REFERENCIAL TEÓRICO. 2.1 O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes antifúngicos. As infecções fúngicas, apesar de serem frequentemente subestimadas e negligenciadas por pesquisadores e entidades governamentais, têm acometido e causado a morte de milhares de pessoas ao redor do mundo (BROWN et al., 2012). Recentemente, foram realizados estudos epidemiológicos no Brasil, México, Espanha, Bélgica e Rússia, acerca da prevalência de infecções fúngicas graves, e a soma de todos os casos estimados nesses países totalizou 18 047 381 milhões (CORZO-LEÓN; ARMSTRONG-JAMES; DENNING, 2015; GIACOMAZZI et al., 2015; KLIMKO et al., 2015; LAGROU et al.; RODRIGUEZ-TUDELA et al., 2015). É importante mencionar que 52% de todos esses casos foram originados por espécies do gênero Candida e, no Brasil, para o ano de 2011, de todos os casos de infecções fúngicas graves estimados, 74% foram igualmente ocasionados por espécies do gênero Candida (GIACOMAZZI et al., 2015) O gênero Candida é constituído por leveduras que habitam diferentes sítios anatômicos da espécie humana, assim como de outros animais e o meio ambiente (água, solo, plantas). Candida albicans é a única espécie que sobrevive unicamente no organismo humano e de outros animais de sangue quente, sendo portanto comensal, fazendo parte da microbiota humana normal da cavidade oral, trato gastrintestinal e vagina de indivíduos saudáveis. Em decorrência deste fator, podese explicar a sua alta prevalência em infecções dos mais variados sítios anatômicos (REISS; SHADOMY; LYON, 2011). As espécies do gênero são patógenos oportunistas e atingem principalmente indivíduos. debilitados. por. outras. doenças. ou. imunocomprometidos.. São. responsáveis por causar um amplo espectro de efermidades, como candidíase oral, vulvovaginal, infecções de pele, mucosa, onicomicose, assim como infecções invasivas, incluindo a candidemia, que está associada a uma elevada taxa de mortalidade (REISS; SHADOMY; LYON, 2011). A patogenicidade das espécies do gênero Candida é resultante dos seus fatores de virulência, os quais estão relacionados à adesão a células epiteliais e endoteliais do hospedeiro, formação de uma comunidade microbiana envolvida em.

(25) 25 matriz exopolimérica, denominada de biofilme, produção de enzimas hidrolíticas, fosfolipases e aspartil-proteases secretadas, além da filamentação, ou seja, a transição de blastoconídio para hifa verdadeira, fenômeno este comum em Candida albicans (O’DONNELL; ROBERTSON; RAMAGE, 2015) A espécie Candida glabrata não é capaz de produzir hifas, porém é a segunda ou terceira mais reportada em estudos da América do Norte e Norte da Europa, que envolvem o isolamento de leveduras nos mais variados sítios. Este achado pode ser justificado devido aos mecanismos de resistência aos antifúngicos que essa espécie apresenta (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014). Candida spp. têm emergido principalmente no ambiente hospitalar na forma de candidíase invasiva, resultando sobretudo do aumento no número de pacientes debilitados ou imunocomprometidos, como indivíduos com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA),. aqueles submetidos a quimioterapia em. decorrência de neoplasias malígnas ou transplantes, indivíduos submetidos a procedimentos invasivos ou que permanecem longos períodos de tempo em unidades de terapia intensiva (UTI) (YAPAR, 2014). A candidíase invasiva comumente está associada a um aumento da mortalidade e custos hospitalares e, possivelmente, esse fator explica a maior atenção fornecida a essa doença no que se. refere. a. estudos. epidemiológicos,. aspecto. que. pode. ser. observado. principalmente nos Estados Unidos e países da Europa (MORGAN et al., 2005; YAPAR, 2014). Existem mais de 150 espécies de Candida conhecidas, porém cerca de 95% da infecções invasivas são causadas por apenas 5 espécies: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C. krusei. A espécie C. albicans é frequentemente reportada como a espécie mais prevalente nos estudos epidemiológicos acerca de candidíase invasiva, sendo variável a sua proporção em relação às outras espécies de acordo com a região (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014). No entanto, ao longo dos últimos anos, tem-se observado uma tendência caracterizada por uma redução gradativa na prevalência de C. albicans isoladas de pacientes com candidíase invasiva. Apesar de C. albicans ainda ser a espécie mais prevalente nos mais variados estudos, o número de casos de candidíase invasiva por essa espécie tem diminuído, enquanto que a candidíase invasiva ocasionada por espécies de Candida não-Candida albicans (CNCA) tem aumentado, a um ponto em que, quando consideradas em conjunto, superam a prevalência de C. albicans em.

(26) 26 muitos estudos mundiais. Atualmente não se sabe as causas dessa mudança, porém supõem-se que os principais fatores que a impulsionaram foram o uso excessivo do fluconazol como terapia empírica e a implementação de cateteres venosos centrais (CVCs) em pacientes graves (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014). Na América do Norte e em muitos países da Europa, o declínio de C. albicans foi acompanhado por um aumento na prevalência de C. glabrata. Enquanto isso, na América Latina, a segunda espécie mais prevalente pertence ao complexo C. parapsilosis, que afetava principalmente neonatos e indivíduos portadores de CVCs internados em UTIs, porém atualmente tem sido isolada de todas as faixas etárias. A Espanha, assim como os países da América Latina, também possui como segunda espécie mais prevalente C. parapsilosis em estudos de infecções fúngicas invasivas (YAPAR, 2014). No Brasil, C. glabrata tem emergido como a segunda espécie mais prevalente em alguns hospitais públicos e principalmente em hospitais privados (COLOMBO et al., 2013; MORETTI et al., 2013). Segundo Colombo et al. (2013), alguns hospitais privados apresentam um perfil semelhante ao de países desenvolvidos devido ao uso do fluconazol como agente profilático. Outro importante gênero envolvido em infecções fúngicas é Trichosporon, constituído por espécies causadoras principalmente de infecções superficiais de pele e fâneros em pacientes imunocompetentes, destacando-se casos de piedra branca e, em menor frequência, episódios de onicomicose (CHAGAS-NETO et al., 2009; COLOMBO et al., 2011). O gênero Trichosporon é considerado o segundo ou terceiro agente mais comumente isolado de infecções fúngicas invasivas por leveduras não-Candida spp., em pacientes com câncer. Em um estudo realizado durante 8 anos pala rede ARTEMIS, envolvendo 134 grupos de pesquisas de 40 países, incluindo o Brasil, Trichosporon spp. responderam por 10,7% das 8.821 cepas de leveduras não pertencentes ao gênero Candida (PFALLER E DIEKEMA, 2007) No Brasil, em cerca de 68% dos casos de infecções sistêmicas, foram isoladas cepas de T. asahii, seguida de T. asteroides (CHAGAS-NETO et al., 2009). O prognóstico para os pacientes é relativamente pobre. As infecções invasivas tendem a ser graves e apresentam elevada taxa de mortalidade, da ordem de 53%, podendo chegar até 83% em pacientes com câncer (FLEMING et al., 2002; CHAGAS-NETO et al., 2008)..

(27) 27 O atual arsenal terapêutico para o tratamento de infecções fúngicas é limitado, se restringido a poucas classes. Dentre elas, destacam-se os azólicos, poliênicos, equinocandinas e análogos de nucleosídeos. Os azólicos, incluindo miconazol, fluconazol, voriconozol e posaconasol, atuam causando danos à membrana celular fúngica ao inibir uma enzima envolvida na biossíntese do ergosterol (14-α-demetilase). Os poliênicos, como a nistatina e a anfotericina B, também atuam no ergosterol, porém ligam-se diretamente a esse componente e causam a formação de poros na membrana. As equinocandinas, incluindo a caspofungina e a micafungina, impedem a formação da parede celular fúngica por meio da inibição de uma enzima envolvida na síntese de glucana (β-1-3-D-glucanosintase). Por último, os análogos de nucleosídeos, como flucistosina e pirimidina, impedem a síntese do DNA ao inibir uma enzima envolvida na sua biossíntese, a timidilato sintase (SPAMPINATO; LEONARD, 2013). O surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos sintéticos disponíveis comercialmente torna ainda mais limitado o arsenal terapêutico disponível. Embora a prevalência de resistência em C. albicans seja baixa e permaneça relativamente constante, em espécies de CNCA ela tem emergido, sendo C. glabrata uma espécie em destaque por apresentar menor susceptibilidade intrínseca aos azólicos, além ter sido reportado um aumento no número de cepas resistentes às equinocandinas (ALEXANDER et al., 2013; LOCKHART, 2014). Portanto, considerando a já mencionada substituição gradativa de C. albicans por espécies de CNCA, a situação passa a ser ainda mais preocupante. A resistência aos antifúngicos envolve basicamente os mecanismos de bomba de efluxo, perda de afinidade ao receptor e compensação do efeito do fármaco (SPAMPINATO; LEONARD, 2013). O mecanismo de bomba de efluxo consiste na expulsão do agente antifúngico do meio intracelular para o extracelular. Em Candida, existem bombas de efluxo do tipo ABC (ATP-binding cassette), responsáveis por expulsar todos os antifúngicos azólicos do meio intracelular, assim como bombas específicas para o fluconazol, que utilizam um gradiente de prótons como energia propulsora. No primeiro tipo de bomba, os genes codificantes são o CDR1 e o CDR2, e no último o gene MDR1 é o responsável (SPAMPINATO; LEONARD, 2013). A diminuição da afinidade do antifúngico ao alvo resulta de mutações pontuais no gene ou genes que o codificam. Para os azólicos, podem ocorrer mutações no.

(28) 28 gene ERG11 que codifica a enzima 14-α-demetilase. Por outro lado, para as equinocandinas, o mecanismo de resistência envolve mutações nos genes FKS1 e/ ou FKS2, os quais codificam o complexo enzimático β-1-3-D-glucano-sintase (SPAMPINATO; LEONARD, 2013). O mecanismo compensatório envolve o aumento na quantidade do alvo, por consequência do aumento na sua expressão gênica ou ausência do alvo devido a mutações. Para os antifúngicos azólicos, pode ocorrer uma superexpressão do gene ERG11, levando a um aumento na proteína alvo. No caso dos antifúngicos poliênicos, ocorre uma diminuição no conteúdo de ergosterol da membrana em virtude de mutações nos genes ERG3 ou ERG6 que codificam enzimas envolvidas na biossíntese do ergosterol (SPAMPINATO; LEONARD, 2013). Portanto, conforme o contexto anteriormente apresentado, são necessárias novas alternativas que venham a complementar os agentes antifúngicos disponíveis, e as plantas medicinais, por apresentarem a capacidade de produzir metabólitos diversos, constituem uma dessas alternativas.. 2.2 As plantas medicinais como alternativa no tratamento de doenças inflamatórias intestinais. A inflamação consiste numa cascata de eventos, envolvendo uma variedade de mediadores e tipos celulares, quel é eliciada em resposta a um estímulo nocivo. Essa resposta é pré-programada e inespecífica quanto ao tipo tecidual e seu objetivo final é a remoção do agente agressor e reparo do local afetado. No entanto, o alcance desse objetivo requer uma drástica alteração da homeostase tecidual, que envolve a dilatação dos vasos e consequente aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade capilar, formação de exsudato, infiltração leucocitária e lesão tecidual (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012). Em consequência disso, pode-se inferir que a resposta inflamatória é essencial para a sobrevivência da espécie humana, por ser capaz de tratar condições severas, causadas por diferentes estímulos, porém, ao mesmo tempo é potencialmente danosa. O custo sobrepõe o benefício quando a resposta inflamatória não atinge o seu objetivo final e torna-se exacerbada e persistente. Em consequência disso, a inflamação atua como elemento-chave na patofisiologia de diversas doenças, como artrite reumatóide, diabetes, hipertensão e distúrbios.

(29) 29 intestinais (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012). De particular interesse para esta pesquisa são as doenças inflamatórias intestinais, que possuem etiologia pouco conhecida e cuja patogênese envolve uma complexa interação entre fatores relacionados ao ambiente, componentes genéticos, microbiota intestinal e sistema imune. Neste contexto, as duas principais doenças inflamatórias intestinais são a colite ulcerativa e a doença de Crohn (ZHANG e LI, 2014). Especificamente, a colite ulcerativa é uma doença inflamatória recidivante e restrita à mucosa do colon. As pessoas acometidas por essa doença apresentam dores abdominais, evacuação de pus, muco e diarreias sanguinolentas. Essas podem ocorrer em torno de quatro vezes ao dia, nos casos clinicamente classificados como leves, até mais de 10 vezes ao dia, nos casos considerados fulminantes (BAUMGART; SANDBORN, 2007). O tratamento medicamentoso das doenças inflamatórias intestinais objetiva amenizar o processo inflamatório e promover a remissão da doença. A terapia envolve o uso de aminosalicilatos, corticosteróides, agentes imunossupressivos e antimicrobianos. No entanto, o uso crônico desses medicamentos é frequentemente limitado devido a eventos adversos a medicamentos, incluindo náusea, vômito, cefaleia, dislipidemia, osteoporose, hiperglicemia, hipertensão e nefrotoxicidade (HEMSTREET, 2014). Diante desse contexto, é de fundamental importância buscar alternativas eficazes, seguras e que possam ser usadas cronicamente. Uma dessas alternativas são as plantas medicinais. Na literatura há muitos trabalhos que têm como objetivo avaliar o potencial de extratos vegetais como agente anti-inflamatório e protetor em modelos de colite experimental, os quais geralmente apresentam compostos fenólicos, principalmente os flavonoides, como os metabólitos secundários majoritários. Por exemplo, foi reportado que os extratos de Bryophyllum pinnatum e Jasminum sambac, os quais possuem polifenóis como componentes majoritários, apresentaram atividade antiinflamatória em modelos de edema de pata e de orelha, enquanto que o extrato de Prunus dulcis apresentou atividade em um modelo de colite induzida por ácido trinitrobenzenosulfônico (CHIBLI et al., 2014; SENGAR et al., 2015; ZORILLA et al., 2014). Os flavonoides, na forma isolada, também tem apresentado considerável potencial na modulação da inflamação, apresentando atividade em modelos in vivo.

(30) 30 de edema de pata e de orelha (CHIBLI et al., 2015) e in vitro frente à produção de óxido nítrico por macrógagos (CUONG et al., 2015). Com relação à atividade de flavonoides em modelos de colite, foi reportado que a miricitrina apresentou atividade anti-inflamatoria sobre a colite experimental induzida em ratos por sulfato sódico de dextrana (SCHWANKE et al., 2013), enquanto que o flavonoide rutina apresentou atividade em modelos de colite induzida por sulfato sódico de dextrana e de indução por transferência de células T (COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE et al., 2014). Uma constatação relevante que alguns estudos têm enfatizado é a de que os glicosídeos de quercetina, como rutina e quercitrina, apresentam atividade antiinflamatória em modelos de inflamação intestinal, enquanto que a aglicona apresenta-se inativa. Essa informação é aparentemente contraditória, pois a forma livre possui o maior efeito anti-inflamatório in vitro. A hipótese mais reforçada é a de que a aglicona é absorvida no intestino delgado e, em contrapartida, a forma glicosilada funciona como um pró-fármaco, carreando a aglicona até intestino grosso, onde é liberada na forma livre por glicosidases bacterinanas (COMALADA et al., 2005; KIM et al., 2005; KWON et al., 2005, MASCARAQUE et al., 2014). Essa informação é de extrema relevância para o presente trabalho, pois, de acordo com os resultados observados neste estudo, as folhas de Ziziphus joazeiro possuem uma grande variedade de flavonoides glicosilados.. 2.3 Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais. O gênero Ziziphus pertence à família Rhamnacea, encontrada nas regiões temperadas, tropicais e subtropicais de todo o mundo e possui aproximadamente 900 espécies distribuídas em 58 gêneros (BARROSO, 2002). Os representantes desta família, no Brasil, podem ser encontrados em todas as cinco regiões do país e, consequentemente, em todos os domínios fitogeográficos (Amazônico, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Pampa e Pantanal). No país, a família compreende 14 gêneros, sendo três endêmicos. Os gêneros possuem 47 espécies representativas, das quais 16 são endêmicas. Na região Nordeste, 20 das 47 espécies podem ser encontradas (LIMA, 2013b). No Nordeste, as espécies da família são utilizadas na ornamentação, na medicina popular, na fabricação de cosméticos, cremes dentais antissépticos e.

(31) 31 doces, na alimentação de animais e no trabalho artesanal. As espécies do gênero Ziziphus estão entre as mais conhecidas pelos habitantes da região, destacando-se, como comentado anteriormente, Z. joazeiro, cuja as raspas da casca são comercializadas para o uso na higiene capilar (QUEIROZ, 2006). Entre as nove espécies do gênero que ocorrem no país, seis são encontradas na região Nordeste: Ziziphus cinnamomum Triana & Planch; Ziziphus cotinifolia Reissek; Ziziphus guaranítica Malme; Ziziphus platyphylla Reissek; Ziziphus undulata Reissek; Ziziphus joazeiro Mart (LIMA, 2013c). A espécie Z. joazeiro possui vários nomes populares, sendo os mais comuns juá e juazeiro. A planta (Figura 1) é típica da Caatinga e ocorre em oito dos nove estados do Nordeste e também em Minas Gerais, sendo encontrada no ambiente de forma isolada, longe das matas secas (CARVALHO, 2007).. Figura 1 - Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius.. Fonte: autor. É uma espécie que, ao contrário de outras plantas da Caatinga, consegue manter-se perenifolia durante o ano todo. Isto porque a planta possui raízes amplas e profundas, capazes de captar a pouca umidade presente na terra semi-árida,.

(32) 32 podendo perder por completo a sua folhagem apenas quando a água do solo tornase quase inexistente (OLIVEIRA, 1976). As árvores do juazeiro podem atingir até 16 metros de altura quando adultas e formam uma copa ampla e densa. O tronco pode ser reto ou tortuoso, sendo bem ramificado a partir da base e com galhos dotados de espinhos. A casca externa é rígida e de cor cinza escuro a levemente castanha; a casca interna é amarelada, a qual libera um exsudato transparente e amargo após uma incisão (CARVALHO, 2007). As folhas medem de 2 a 6 cm de largura por 5 a 10 cm de comprimento. São lustrosas, de consistência membranácea a coriácea, com disposição alternada nos ramos. Possuem formato oval ou elíptico, ápice acuminado e 3 a 5 nervuras que emergem da base e se reúnem no ápice. As flores são pequenas, de coloração amarelo-esverdeada. Os frutos são uma drupa amarela de formato esférico, medindo de 1,5 a 2 cm de diâmetro (CARVALHO, 2007).. Figura 2 - Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius.. Fonte: autor. 2.4 Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius. Ao longo dos anos, as civilizações e tribos humanas construíram um extenso conhecimento acerca de plantas medicinais, as quais foram selecionadas de forma.

(33) 33 empírica com base nos seus efeitos. Como exemplo do acúmulo dessa sabedoria, tem-se a medicina tradicional Chinesa e a Ayurveda. É este tipo de conhecimento que. constitui. o. alvo. da. pesquisa. etnofarmacológica,. que. visa. validá-lo. cientificamente através de estudos fitoquímicos e farmacológicos não-clínicos e clínicos (FABRICANT; FARNSWORTH, 2001; ELISABETSKY, 2001). Pode-se dizer que a pesquisa etnodirigida apresenta vantagens em relação à pesquisa randômica de plantas e às técnicas de química combinatória. Isto porque as espécies que foram utilizadas pelo homem por um longo período provavelmente passaram. por. uma triagem inicial e,. consequentemente,. possuem. maior. probabilidade de conter compostos eficazes tanto farmacologicamente quanto biofarmaceuticamente (ELISABETSKY, 2001). Baseando-se nessa ideia, foi realizado, na década de 1980, um levantamento de todos os fármacos derivados de plantas utilizados na clínica e observou-se que a maioria foi descoberta com base em dados etnobotânicos (FARNSWORTH et al. 1985). Além disso, outros estudos forneceram evidências da maior eficácia da abordagem etnofarmacológica em relação à abordagem aleatória na seleção de plantas promissoras (SLISH et al., 1999; KHAFAGI; DEWEDAR, 2000). Portanto, a tradição popular mostra-se muito útil para nortear pesquisas que envolvam a descoberta de fármacos, o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos ou apenas a validação do uso popular. Diante deste contexto, é de grande importância que os estudos científicos da espécie Z. joazeiro Mart. também sejam direcionados pelo conhecimento popular, sobretudo porque, de acordo com a literatura, esta é uma das plantas do Nordeste brasileiro mais utilizadas na região da Caatinga (ALBUQUERQUE et al., 2007) e uma das 100 plantas com maior diversidade de usos medicinais do Brasil (MEDEIROS; LADIO; ALBUQUERQUE, 2013). Desta forma, foi realizado um levantamento bibliográfico da etnobotânica da espécie Z. joazeiro Mart. (Quadro 1)..

(34) 34. Quadro 1 - Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart. Partes Usadas. Modo de preparo. Uso popular/indicação. Entrecasca do fruto. In natura. Sabão e dentifrício. Entrecasca do fruto. Infusão ou maceração. Tônico capilar Xampu, anticaspa e tônico capilar. Casca ND. Referências BRAGA, 1960 apud OLIVEIRA, 1978. LIMA, 1985 apud CARVALHO, 2007. Casca e folha. Detergente. Folha e casca. Extrato aquoso. Alívio de problemas gástricos, clareamento da pele do rosto, tônico capilar, dentifrício, doenças de pele.. Entrecasca(pó). Pó. Dentifrício. Raspas da casca deixadas em água. Cicatrizante. Xarope. Tosse. Casca/folhas. ND. Anti-inflamatório, antitussígeno, higiene bucal. ND. ND. Gripe. Casca. Banho. Reações alérgicas. TEIXEIRA; MELO, 2006. Casca do caule. Adição de raspas da casca na água. Cicatrização. ALBUQUERQUE, 2006. Casca. BRAGA, 1960; SOUSA et al., 1991; MATOS, 2002 apud LORENZI; MATOS, 2008. ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002. OLIVEIRA, 2005 PINTO et al., 2006. Xarope ND. ND. Tosse. ALBUQUERQUE, OLIVEIRA, 2007. Casca (pó). ND. Dentifrício, anticaspa. AGRA et al., 2007. Folhas. Decocção. Micoses superficiais. Casca. Infusão. Candidíase. Madeira. In natura. Fitocombustível. Fruto. In natura. Alimento. Folha. In natura. Forrageira (dieta de bovinos, caprinos e ovinos).. Casca (raspa). Maceração, banho e xarope. Queimaduras, verminose, higiene bucal, gripe, caspa, cicatrizante em geral.. ND. ND. Dentifrício. SANTOS et al., 2009. ND. ND. Mau hálito, doenças bucais. CAVALCANTE, 2010. CRUZ et al., 2007. RAMOS, 2007. ROQUE, 2009.