5. RESULTADOS
5.1. Casuísticas
Amostras Clínicas
Um total de 193 amostras foi estudado, das quais 160 amostras de frascos de hemocultura BACTEC® e 33 amostrasde sangue periférico coletados em tubos de EDTA K2 gel. Desse total, 154 amostras de frascos de BACTEC® e 29 amostras de sangue periférico em tubos de EDTA K2 gel foram provenientes de pacientes do Hospital São Paulo (HSP), seis amostras de BACTEC® e quatro de tubos de EDTA K2 gel do Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC).
No HSP, as amostras dos frascos de hemocultura BACTEC® foram coletadas de 28 pacientes e as amostras de tubos de EDTA K2 gel foram provenientes de 17 pacientes. As amostras de frascos BACTEC® do IOP/GRAACC foram provenientes de cinco pacientes e as de EDTA K2 gel foram de quatro pacientes diferentes e estão apresentados na Tabela 16 em anexo II.
5.2. Variáveis Clínicas
Para a análise das variáveis clinicas foram avaliadas 160 amostras de frascos de hemocultura BACTEC®. Deste total foram identificadas 127 negativas e 33 positivas pelo sistema automatizado BACTEC®. Estas amostras foram provenientes de 33 pacientes na fase de mobilização pré-transplante de células-tronco hematopoiéticas, pacientes submetidos ao transplante e também todos os pacientes internados com intercorrências clínicas pós-transplante. Dos 33 pacientes, 28 (85,3%) foram admitidos na enfermaria da Hematologia do HSP e
cinco (14,7%) no serviço de transplantados de medula óssea do IOP/GRAACC. Em relação ao sexo, 45,45% (15/33) dos pacientes eram do sexo feminino e 54,54% (18/33) do sexo masculino. A idade média foi de 36,78 anos, sendo a idade máxima de 69 anos e a mínima de um ano. Nove dos 33 pacientes estavam na fase de mobilização pré-transplante. Todos os pacientes do presente estudo estavam fazendo uso de drogas imunossupressoras e apresentaram febre ou hipotermia, sendo que 15 deles (75%) estavam neutropênicos no momento em que foram coletadas as culturas (Tabela 10).
Em relação à doença hematológica de base, o diagnóstico mais prevalente foi Leucemia Mielóide Aguda (7/33); seguido de Mieloma Múltiplo (6/33) e Linfoma não – Hodgkin (6/33); Leucemia Linfocítica Aguda (4/33); Síndrome Mielodisplásica (2/33) e Linfoma Hodgkin (2/33); Leucemia Linfocítica Crônica (1/33), Adenodistrofia (1/33), Síndrome de Ewing (1/33); Carcinoma de Pineal (1/33), Aplasia medular (1/33) e Tumor de testículo (1/33) (Figura 1).
Nos 14 pacientes com hemocultura positiva foram observados 15 episódios de infecção de corrente sanguínea. Em 10 dos episódios (53,3%) estavam presentes apenas bactérias Gram positivas; em sete (33,3%) apenas bactérias Gram negativas e em dois episódios (13,4%) estavam presentes dois tipos de bactérias. Entre as bactérias Gram positivas, Staphylococcus coagulase negativa foi o mais prevalente. A prevalência de cada microrganismo está apresentada nas Figuras 2 e 3. Nenhuma cultura pelo sistema automatizado BACTEC® foi positiva para fungos.
Figura 1 - Distribuição das doenças hematológica de base.
5.3. Diagnóstico Microbiológico
5.3.1. Identificação Bacteriana Fenotípica e Teste de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos
No presente estudo foram avaliadas 160 amostras de frascos de hemocultura BACTEC®. Desse total, 127 amostras foram identificadas como negativas e 33 amostras como positivas pelo sistema automatizado Phoenix® apresentados na Tabela 10.
Das 33 hemoculturas positivas pelo sistema automatizado BACTEC®, 23 bactérias Gram positivas e 10 Gram negativas foram identificadas. Dentro das 23 amostras identificadas como Gram positivas foram identificadas: quatro
Enterococcus faecium, dois Enterococcus faecalis, 15 SCoN e dois Streptococcus pneumoniae (Figura 2). Das 10 amostras Gram negativas foram
Enterobacter cloacae, uma Klebsiella pneumoniae, uma Escherichia coli, um
Bacilo Gram Negativo não Fermentador (BGNNF) e um Citrobacter freundii (Figura 3).
O teste de sensibilidade quantitativo foi realizado pelo sistema automatizado Phoenix® para todas as amostras que foram detectadas como positivas pelo sistema automatizado BACTEC®. Para as amostras Gram positivas, 12 dos 15 SCoN identificados apresentaram resistência à oxacilina Quatro E. faecium foram resistentes à vancomicina (Tabela 10).
Entre os Gram negativos, as amostras de E. cloacae com fenótipo ESβL exibiram diminuição da sensibilidade para todos os agentes antimicrobianos testados, exceto para os carbapenens. Um dos isolados de Acinetobacter spp. mostrou resistência à todos os antimicrobianos testados. O perfil geral de sensibilidade aos antimicrobianos podem ser avaliados na Tabela 16 do anexo II.
Figura 2 - Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema automatizado (Phoenix®).
Figura 3 - Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema automatizado (Phoenix®).
5.4. Diagnóstico Microbiológico Molecular
5.4.1. Padronização PCR em Tempo Real
5.4.1.1. Amplificação por PCR em Tempo Real
As temperaturas de desnaturação (Tm) obtidas na detecção do gene HFE (controle interno), gene 18S rDNA de fungo, Enterobacter cloacae, Aspergillus spp., Fusarium spp. e dos genes que conferem resistências aos antimicrobianos para cada controle positivo (ATCC ou amostra bem caracterizada) testado foram avaliadas, permitindo o estabelecimento de um intervalo experimental de Tm
possíveis. O Tm, a média e o desvio padrão observados para os genes avaliados estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Resultados da Temperatura de melting e desvio padrão da Tm dos produtos amplificados de amostras controles ATCC para os genes de resistência.
Genes Tm
Menor Maior Media Desvio Padrão
mecA
71,37 72,54 71,92 0,29
vanA85,32 85,67 85,48 0,08
vanB74,28 74,61 74,41 0,14
blaSHV91,04 91,82 91,67 0,22
blaTEM85,53 86,01 85,85 0,22
blaCTX88,80 88,96 88,85 0,09
blaKPC91,19 91,35 91,31 0,07
blaIMP76,15 76,33 76,27 0,10
blaSPM84,73 84,91 84,85 0,10
blaVIM89,37 89,55 89,43 0,10
18S rDNA Lev82,01 84,20 83,33 0,69
18S rDNA Filam85,50 86,16 85,13 0,24
HFE81,05 82,16 81,72 0,30
E. cloacae79,50 80,70 80,27 0,41
Aspergillus spp.84,16 86,40 85,59 0,86
Fusarium spp.90,60 91,20 90,86 0,22
Lev – Levedura; Filam – Filamentoso; Tm – Temperatura de melting
5.4.1.2. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real
5.4.1.2.1. SYBR Green
A eficiência das reações por SYBR Green apresentados na Tabela 5 foram de 81,487% para blaSHV, 81,96% para blaTEM, 86,40 para blaCTX, 81,233% para blaKPC, 100% para blaIMP, 80,07% para blaSPM, 128,765% para blaVIM, 93,772% para vanA, 116,911% para vanB e 108,939% para mecA. Para o gene
HFE (controle interno) a eficiência foi de 89,47% e para o gene 18S rDNA foi de
100,923% para leveduras e 106,80% para fungos filamentosos. Para E. cloacae foi de 129%, Aspergillus spp. 108,5% e Fusarium spp. de 97,34%.
A reação do gene HFE foi avaliada por três ensaios em dias diferentes. A regressão linear foi construída com o mínimo de três pontos e foram avaliadas as diferenças inter e intra-ensaio, com intervalo de confiança de 95%. Para os genes que conferem resistência aos antimicrobianos foram avaliados por um ensaio com as amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de cinco pontos e foram avaliadas as diferenças intra-ensaio, com intervalo de confiança de 95%.
Para calcular a especificidade foram testados os iniciadores e sondas para amplificar o DNA dos genes apresentados na Tabela 2. Todos os genes apresentaram capacidade de positivar as amostras controles por PCR em Tempo Real utilizando o fluoróforo SYBR Green. As amostras controles foram testadas e foram amplificadas para o gene HFE. Todas as amostras foram PCR positivas para os seus respectivos genes de resistência, e os controles negativos apresentaram resultados negativos.
A detecção da última diluição foi calculada a partir da diluição seriada de amostras controles para cada gene avaliado. Para o gene HFE, o controle utilizado foi uma amostra de sangue periférico com concentração de DNA de 100 pg/µL. A diluição seriada variou de 10-1 a 10-7 e a menor diluição detectada foi a 10-4 e a menor concentração de DNA foi de 100 fg/µL. Para os genes blaSHV,
blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB, mecA e as menores diluições foram de 10-6, 10-7, 10-6, 10-6, 10-7, 10-7, 10-7, 10-7, 10-6 e 10-7 respectivamente (Tabela 5).
Tabela 5: Eficiência da reação de PCR em Tempo Real, Ct e Tm da última diluição, concentração em UFC/mL do microrganismo detectado na última diluição de amplificação dos genes de resistência.
HFE blaSHV blaTEM blaCTX blaKPC blaIMP blaSPM blaVIM vanA mecA vanB 18S rDNA
Levedura Filamentoso Controle 100 pg/µL escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF escala 0,5 MF 50 ng/uL Eficiência% 89,47 81,49 81,96 86,40 81,23 100,00 80,07 128,77 93,77 108,94 116,91 100,92 106,80 “Slope” -3,60 3,86 3,85 3,70 -3,87 -3,30 -3,92 -2,78 3,48 -3,13 -2,97 -3,3 -3,16 Sensibilidade diluiçao 10-4 10-6 10-7 10-6 10-6 10-7 10-7 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 Ct diluição 35,91 38,21 37,41 30,92 36,84 36,50 35,72 36,13 30,74 35,93 36,94 36,96 36,1 Tm diluição 81,05 91,04 85,54 88,80 91,20 76,15 84,73 89,43 85,32 71,37 74,45 84,02 86,02
UFC/mL por reação 100 fg/µL 15,0 1,50 15,00 15,0 1,50 1,50 1,50 15,0 1,50 15,0
5.4.1.2.2. TaqMan
A reação de amplificação do gene 16S rDNA com sondas para diferenciar entre Gram positivo e Gram negativas foram avaliadas por um ensaio com as amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de 5 pontos e foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança de 95%. As sondas Gram especificas foram testadas quanto à sua capacidade em diferenciar as bactérias Gram positivas e Gram negativas com cepas controles e amostras bem caracterizadas (Tabela 6). Estas sondas foram capazes de positivar as amostras controles de S. aureus (ATCC 43300), E. coli (ATCC 25922) e P. aeruginosa (ATCC 27853) por PCR e todas as amostras controles foram PCR positivas para as suas respectivas sondas, e os controles negativos apresentaram resultados negativos. Houve exceção para as sondas Gram negativas, pois os controles negativos utilizados em uma reação contendo todos os reagentes sem a adição do DNA extraído da amostra apresentaram resultados positivos devido à presença de DNA contaminante da E. coli em um dos reagentes.
A presença de contaminantes de DNA proveniente do processo de produção dos reagentes dificulta a interpretação dos resultados das amostras positivas realizadas por PCR em Tempo Real utilizando iniciadores universais (Klaschik et. al., 2002a). As preparações de Taq DNA polimerase contêm uma quantidade pequena de DNA contaminante proveniente de E. coli ou Thermus
aquaticus (Carroll et. al., 1999), e também de Pseudomonas spp., Sphingomonas spp., Moraxella spp. e Acinetobacter spp. nas preparações para
utilização em PCR em Tempo Real (Mühl et. al., 2008). Para eliminar a interferência destes resultados na reação foi calculado o Ct do LoD e Ct do
Tabela 6: Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo Real utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram específicas.
Microrganismo Linhagem PCR TaqMan Multiplex Sonda Gram
Positiva
Sonda Gram Negativa
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Positivo Negativo
Staphylococcus aureus ATCC 43300 Positivo Negativo
Staphylococcus haemolyticus ATCC 29968 Positivo Negativo
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Positivo Negativo
Staphylococcus warneri Amostra clínica Positivo Negativo
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Positivo Negativo
Enterococcus faecalis ATCC 700802 Positivo Negativo
Enterococcus faecium ATCC 93011 Positivo Negativo
Streptococcus pyogenes ATCC 18615 Positivo Negativo
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Positivo Negativo
Streptococcus viridans Amostra clínica Positivo Negativo
Streptococcus mitis Amostra clínica Positivo Negativo
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo Positivo
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Negativo Positivo
Serratia marcescens Amostra clínica Negativo Positivo
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Negativo Positivo
Pseudomonas aeruginosa Controle blaSPM (P1088) Negativo Positivo
Pseudomonas aeruginosa Controle blaIMP Negativo Positivo
Pseudomonas aeruginosa Controle blaVIM Negativo Positivo
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Negativo Positivo
Klebsiella pneumoniae Controle blaTEM, SHV, CTX, KPC (A28005)
Negativo Positivo
Acinetobacter baumannii ATCC 19606 Negativo Positivo
Salmonella spp. Amostra clínica Negativo Positivo
A eficiência da reação de PCR em Tempo Real multiplex para Gram positivos foi de 115% para S. aureus, 134% para SCoN, 78,49% para S.
pneumoniae. Para os Gram negativos foi de 93,68% para E. coli, 103,29% para Salmonella spp., 178% para Serratia marcescens, 114% para S. maltophilia,
99,66% para A. baumannii e em torno de 70% P. aeruginosa. Para os genes espécie-especificos avaliados no presente estudo a eficiência da reação de PCR em Tempo Real pode ser observada na Tabela 7, estes apresentaram resultados que variaram de 83,845 a 157,601%.
Tabela 7: Resultados de “slope”, R2, eficiência e última diluição detectada das
reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan e SYBR Green para os genes espécie-específicos dos principais patógenos que causam infecção de corrente sanguínea.
Padronização Real Time - TaqMan
Microrganismo Controle puro
Eficiência da
reação (%) R2 “Slope”
Última diluição detectada
1 S. aureus escala 0,5 McFarland 123.447 0.996 -2.864 D 10-6
2 S. pneumoniae escala 0,5 McFarland 103.367 0.998 -3.244 D 10-7
3 S. haemoliticus escala 0,5 McFarland 125,59 0.96 -2.83 D 10-7
4 Serratia marcescens escala 0,5 McFarland 83.845 0.971 -3.781 D 10-5
5 Salmonella spp. escala 0,5 McFarland 105.003 0.977 -3.208 D 10-7
6 P. mirabilis escala 0,5 McFarland 104.246 0.946 -3.224 D 10-6
7 K. pneumoniae escala 0,5 McFarland 121,922 0.983 -2.888 D 10-7
8 E. faecalis/faecium escala 0,5 McFarland 135.443 0.942 -2.689 D 10-7
8 E. faecalis escala 0,5 McFarland 114.535 0.951 -3.017 D 10-7
8 E. faecium escala 0,5 McFarland 157.601 0.972 -2.433 D 10-7
9 E. coli escala 0,5 McFarland 121.052 0.985 -2.903 D 10-7
10 P. aeruginosa escala 0,5 McFarland 99.457 0.993 -3.335 D 10-7
11 S. maltophilia escala 0,5 McFarland 136.653 0.96 -2.673 D 10-7
12 A. baumannii escala 0,5 McFarland 124.039 0.994 -2.854 D 10-7
13 C. albicans 30 ng/µL 105.371 0.994 -3.2 D 10-6
14 Candida spp. escala 0,5 McFarland 116.917 0.941 -2.974 D 10-5
14 C. albicans escala 0,5 McFarland 121 0.948 -2.901 D 10-4
14 C. tropicalis escala 0,5 McFarland 113.54 0.935 -3.035 D 10-5
14 C. parapsilosis escala 0,5 McFarland 106.685 0.989 -3.172 D 10-5
15 M. tuberculosis 200 ng/ µL 128.867 0.991 -2.781 D 10-7
16 Enterobacter cloacae* escala 0,5 Mc Farland 129.4 0.998 -2.77 D 10-6
17 Aspergillus spp.* 9,3 ng/ µL 108.50 0.98 -3.134 D 10-6
18 Fusarium spp.* 8,9 ng/ µL 97.34 0,998 - 3.38 D 10-6
5.4.2. Validação de Novos Métodos de Diagnóstico
5.4.2.1. Determinação do Limite do Branco (LoB)
O Ct de ponto de corte, “cutoff”, foi calculado para os genes
espécie-específicos de cada microrganismo, para as sondas Gram específicas e para os genes de resistência aos antimicrobianos . De acordo com o número de amostras negativas, este número variou de microrganismo para microrganismo e estão apresentados na Tabela 8. O menor Ct de “cutoff” foi de 31,9 para S. maltophilia, e 33,1 para E. coli. O maior Ct de “cutoff” foi de 40 para os
microrganismos Enterococcus spp., K. pneumoniae, S. marcescens, P.
aeruginosa, A. baumannii e Gram positivo.
5.4.2.2. Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade)
O Ct de LoD foi calculado a partir de amostras com baixa concentração para os genes espécie-específicos de cada microrganismo, para as sondas Gram específicas e para os genes de resistência aos antimicrobianos . O Ct LoD de cada gene avaliado apresenta-se na Tabela 8. O menor Ct foi de 30,9 para SCoN e o maior foi de 38,92 para A. baumannii .
Tabela 8: Resultados de “cutoff” de amostras negativas e LoD de amostras positivas baixas para os genes avaliados.
Microrganismo Amostras Negativas (n) “Cutoff” LoD
GP 62 40 38,6 GN 66 36,6 34,4 S. aureus 26 38 36,9 SCoN 25 34 30,9 Enterococcus spp. 10 40 37,1 S. pneumoniae 31 39,1 37,4 E. coli 72 33,1 32,6 K. pneumoniae 57 40 33,9 P. mirabilis 18 38,1 37 S. marcescens 23 40 38,58 Salmonella spp. 15 36,3 33 P. aeruginosa 46 40 38,8 S. maltophilia 15 31,9 33,38 A. baumannii 65 40 38,9 C. albicans 30 39 36 Candida spp. 31 39 36,5 M. tuberculosis 33 39 34 mecA 37 34,9 33,91 vanA 41 35,5 33,67 vanB 54 33,3 32,29 blaKPC 51 37,9 36,67 blaTEM 25 36,4 34,53 blaSHV 39 34,1 33,26 blaCTX 35 33,7 32,62 blaIMP 58 33,23 28,49 blaSPM 58 33,23 30,99 blaVIM 58 33,23 31,82 Fungo 18S rDNA 32 36,1 34,4 E. cloacae 37 37,47 36,2 Aspergillus spp. 42 38,0 37,2 Fusarium spp. 38 36,9 33,01
GP – Gram positivo; GN –Gram negativo; SCoN – Staphylococcus coagulase negativo; n – número de amostras.
5.4.2.3. Acurácia Clínica
A acurácia clínica foi determinada com todas as amostras clínicas de frascos de hemocultura e amostras clínicas controles negativas de 30 profissionais da saúde sem a doença. Para os genes estudados foi realizada a curva ROC com um intervalo de confiança de 95% (Figuras 4 e 5). A área sob a curva ROC apresentado na Tabela 9 ficou acima de 0,70 para a maioria dos genes estudados mostrando um desempenho satisfatório.
A sensibilidade, especificidade e falsos positivos para cada gene variou de acordo com o Ct do LoD determinado conforme o documento EP17-A (CLSI, 2004) e pode ser observado na Tabela 9. A sensibilidade calculada pela curva ROC para resistência aos antimicrobianos foi acima de 80% para os genes
blaKPC, e abaixo de 60% para os genes blaTEM, blaSHV e vanB. A especificidade foi próxima a 100% para todos os genes avaliados.
A sensibilidade pela curva ROC para os genes espécie-específicos foi abaixo de 50% para E. coli, K. pneumoniae, Salmonella spp., SCoN e Gram negativo considerando o LoD do Ct determinado conforme o EP17-A (CLSI, 2004), a especificidade foi próxima a 100% para todos os genes avaliados. Os PCR em Tempo Real para detecção de A. baumannii, Enterococcus spp. e P.
mirabilis apresentaram 41,2%, 15% e 35% respectivamente, de serem
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade clínica determinada pela curva ROC de acordo com o Ct do LoD para os genes espécie-especificos, fungo 18S rDNA, para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo e genes de resistência aos antimicrobianos.
Gene N° de amostras positivas N° de amostras negativas Área sob a curva ROC Sensibilidade Sensibilidade (%) Especificidade -1 Falsos positivos (%) Especificidade (%) Ct do LoD A. baumannii 37 17 0,973 1 100,00 0,412 41,2 99,59 38,92 C. albicans 30 20 0,983 0,800 80,00 0,000 0,0 100,00 36,03 Candida spp. 33 20 0,985 0,727 72,7 0,000 0,0 100,00 36,5 E. coli 47 20 0,734 0,404 40,40 0,000 0,0 100,00 32,6 Enterococcus spp. 55 20 0,957 0,891 89,10 0,150 15,0 99,85 37,15 Fungo 18S rDNA 95 20 0,953 0,768 76,8 0,050 5,0 99,95 36,1 GN 16S rDNA 222 20 0,998 0,315 31,50 0,000 0,0 100,00 34,47 GP 16S rDNA 107 21 0,995 0,813 81,30 0,000 0,0 100,00 38,68 K. pneumoniae 48 20 0,961 0,5 50,00 0,000 0,0 100,00 33,97 M. tuberculosis 20 21 1 100 0,00 0,000 0,0 100,00 34,0 P. aeruginosa 82 20 0,994 0,976 97,60 0,000 0,0 100,00 38,8 P. mirabilis 23 20 0,843 0,826 82,60 0,350 35,0 99,65 37,07 S. maltophilia 28 28 0,997 0,714 71,4 0,000 0,0 100,00 33,38 S. aureus 66 21 1 0,803 80,30 0,000 0,0 100,00 36,96 S. marcescens 27 20 0,893 0,815 81,50 0,200 20,0 99,80 38,58 S. pneumoniae 48 20 0,99 0,917 91,70 0,000 0,0 100,00 37,47 Salmonella spp. 34 20 0,825 0,412 41,20 0,100 10,0 99,90 33,01 SCoN 109 21 0,872 0,486 48,60 0,000 0,0 100,00 30,9 E. cloacae 24 24 1 0,958 95,8 0,000 0,0 100,00 37,47 Fusarium spp. 20 22 1 0,70 70,0 0,000 0,0 100,0 33,01 Aspergillus spp. 19 20 1 0,947 94,7 0,000 0,0 100,00 38,0 blaTEM 55 25 0,996 0,673 67,3 0,040 4 99,96 34,53 blaCTX-M 24 35 0,896 0,708 70,8 0,029 3 99,97 32,62 blaSHV 35 39 0,863 0,257 25,7 0,000 0 100,00 33,26 blaKPC 52 51 0,984 0,827 82,7 0,039 4 99,96 36,67 mecA 83 37 0,976 0,771 77,1 0,054 5 99,95 33,91 vanA 51 40 0,990 0,745 74,5 0,000 0 100,00 33,67 vanB 19 54 0,961 0,579 57,9 0,037 4 99,96 32,29 blaSPM 19 58 0,981 0,737 73,7 0,017 0 98,30 30,99 blaVIM 18 58 0,938 0,722 72,2 0,017 0 98,30 31,82 blaIMP 34 58 0,954 0,676 67,6 0 0 100,00 28,49
Figura 4 - Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos A- blaTEM; B -
vanA; C - vanB; D - blaCTX; E- blaSHV; F - mecA; G - blaKPC; H- blaIMP; I- blaVIM; J-
Figura 5 - Curva ROC para genes estudados espécie especifico, fungo 18S rRNA e 16S rDNA Gram positivo e Gram negativo.
5.4.3. Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de
Hemocultura de Pacientes Submetidos à TCTH.
5.4.3.1. Detecção do gene HFE de Controle Interno da Extração de
DNA gene.
Todas as amostras de hemoculturas, sendo elas negativas ou positivas pelo aparelho BACTEC®, foram submetidas à extração de DNA e a reação de PCR em Tempo Real para o gene HFE. O Tm dos controles positivos variou de 81,076 a 81,245. As amostras foram consideradas positivas quando a Tm encontrava se neste intervalo. Somente quando o resultado de PCR foi positivo para esta reação, é que as mesmas foram encaminhadas para realizar a PCR em Tempo Real para os demais genes em estudo. Todas as amostras incluídas foram positivas para o gene HFE indicando que houve extração e evitando a possibilidade de falso negativo para os demais genes. Após isso, todas essas amostras foram submetidas à detecção dos genes 16S rDNA, 18S rDNA, genes de resistência aos antimicrobianos e genes espécie-específicos por PCR em Tempo Real.
5.4.3.2. Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA
A PCR em Tempo Real para o gene 16S rDNA com as sondas Gram positiva e Gram negativa foram realizadas nas 193 e detectou 26 amostras positivas, destas, duas amostras foram amplificadas pelas duas sondas. Foram detectadas 19 amostras como Gram positivas e 12 amostras como Gram negativas. Dentre as 26 amostras PCR positivas, nove amostras foram negativas pelo sistema BACTEC®. Os resultados dos frascos de hemocultura BACTEC®
podem ser avaliados na Tabela 10 e os resultados dos tubos de EDTA k2 gel na Tabela 12.
Das 23 amostras identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como espécies de bactérias Gram positivas, 12 amostras foram positivas para a sonda Gram positiva e 11 não foram amplificadas por PCR para o gene 16S rDNA (Tabela 10). Das 10 amostras identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como espécies de bactérias Gram negativas, cinco amostras foram detectadas por PCR em Tempo Real para o gene 16S rDNA (Tabela 10). A média de Ct apresentada pelas amostras positivas para sonda Gram positiva foi 28,46 e para Gram negativa foi 25,75 e estão apresentados na Tabela 16 em anexo II. Nas 33 amostras de tubos de EDTA K2 gel foi detectada apenas uma amostras contendo o gene 16S rDNA com valor de Ct de 33,6 para sonda Gram positiva (Tabela 16).
5.4.3.3. Detecção do Gene 18S rDNA para Fungos
A detecção do gene 18S rDNA por PCR em Tempo Real com o fluoróforo
SYBR Green foi realizada na 193 amostras em estudo. Vinte e duas amostras
obtiveram valores de Ct positivos pelo PCR em Tempo Real para o gene 18S rDNA. Após considerar o Ct do LoD de 34,4 apenas 11 amostras foram consideradas PCR detectadas. Os resultados dos frascos de hemocultura BACTEC® estão na Tabela 10 e os dos tubos de EDTA K2 gel na Tabela 12.
5.4.3.4. Detecção dos Genes Espécie-específicos
A reação de PCR em Tempo Real com iniciadores espécie-especificos foi realizada em todas as amostras que apresentaram valores de Ct positivos, nas amostras que obtiveram identificação pelo sistema automatizado Phoenix® e nas amostras que apresentaram resultados negativos, na qual uma das amostra coletadas na mesma data mostrou resultado positivo tanto para fenotípico quanto para molecular.
A PCR em Tempo Real com genes espécie-especificos para detecção de bactérias foi capaz de detectar 24 amostras das 33 amostras positivas pelo sistema automatizado BACTEC®. Para as Gram positivas, seis amostras identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como Enterococcus spp. (dois
E. faecalis e quatro E. faecium) somente três amostras foram detectadas como Enterococcus spp. pela sonda espécie-especifica por PCR em Tempo Real. Das
15 amostras identificadas como SCoN pelo sistema automatizado Phoenix®, apenas duas amostras não foram detectadas pela sonda espécie-especifica de SCoN. Das duas amostras de S. pneumoniae identificadas fenotipicamente, apenas uma foi detectada pela sonda espécie-especifica de S. pneumoniae por PCR em Tempo Real (Tabela 10).
Dentre as espécies Gram negativas identificadas pelo sistema automatizado, BGNNF e A. baumannii foram detectadas por PCR Tempo Real pela sonda espécie-especifica de A. baumannii, porém a amostra de
Acinetobacter spp. não foi detectada por esta sonda, pois não foi desenhada
sonda para Acinetobacter spp.. A amostra de E. coli foi detectada pela sonda espécie-especifica. As amostras de Citrobacter freundii e P. putida não puderam ser detectadas, já que não foram desenhadas sondas espécie-especificas para estas duas espécies. As três amostras de Enterobacter cloacae foram
detectadas pelos iniciadores espécie-específicos utilizando o sistema SYBR
Green (Tabela 10).
Nas 33 amostras de tubos de EDTA K2 gel dos pacientes com episódios de infecção de corrente sanguínea foi realizada a PCR em Tempo Real para genes espécie-específicos e 10 amostras apresentaram valores de Ct, porém após considerar o Ct do LoD apenas sete amostras foram PCR positivas. Dentre estas sete amostras, cinco amostras tiveram PCR positiva para SCoN, duas para
Enterococcus spp. As espécies consideradas negativas foram para A. baumannii, SCoN e E. cloacae estes dados podem ser encontrados na Tabela
12. Estas 33 amostras não foram encaminhadas para cultura e apenas para duas amostras de tubos de EDTA K2 gel não foram coletados frascos de hemocultura BACTEC®.
A PCR em Tempo Real com iniciadores espécie-específicos para a