5. RESULTADOS
5.5. Concordância do PCR em Tempo Real com os Testes
Fenotípicos
A concordância entre os testes fenotípicos e PCR em Tempo Real foi avaliada em todas as amostras que apresentaram valores positivos de Ct, incluindo também as amostras que apresentaram resultado de PCR não detectado após considerar o Ct do LoD
5.5.1. Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR em
Tempo Real das Amostras de Frascos de Hemocultura
BACTEC
®Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram realizados com 160 amostras de frascos de hemocultura BACTEC® (Tabela 10). A análise de concordância mostrou coeficiente Kappa 0,482 entre o Gram da hemoculturae a PCR em Tempo Real com sondas Gram negativa (GN) e Gram positiva (GP). A concordância foi considerada moderada segundo os critérios sugeridos por Landis e Koch apud Everitt (1992, p.149). A concordância foi boa, com um Kappa 0,790, entre a identificação automatizada do microrganismo e PCR Tempo Real Espécie-Especifico.
5.5.2. Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR em
Tempo Real das Amostras de tubos de EDTA K2 GEL
Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram realizados com 23 amostras (Tabela 12). A análise de concordância mostrou coeficiente Kappa 0,349 entre a identificação automatizada do microrganismo e aPCR em Tempo Real das amostras dos tubos de EDTA K2 gel. A concordância foi
considerada moderada segundo os critérios sugeridos por Landis e Koch apud Everitt (1992, p.149).
5.5.3. Concordância entre os Frascos de Hemocultura BACTEC
®versus Tubos de EDTA K2 GEL por PCR em Tempo Real
Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram realizados com 23 amostras. A análise de concordância mostrou coeficiente Kappa 0,796. A concordância foi considerada boa segundo os critérios sugeridos por Landis e Koch apud Everitt (1992, p.149).
5.5.4. Concordância entre os Testes Fenotípicos e PCR em Tempo
Real na Detecção de Resistência aos Antimicrobianos
Com relação aos resultados de susceptibilidade à oxacilina liberados pelo sistema automatizado Phoenix® e a detecção do gene mecA pelo método da PCR em Tempo Real, houve concordância em 9 amostras. Seis amostras foram discordantes, três amostras de SCoN com resistência à oxacilina não apresentaram PCR positiva para o gene mecA, enquanto três isolados identificados como sensíveis à oxacilina foram positivos para o gene mecA por PCR em Tempo Real. Para resistência à vancomicina a concordância foi de 100% entre o teste fenotípico e a detecção molecular do gene vanA (Tabela 11).
Das cinco amostras com resultado positivo para os genes que codificam as ESβL, somente uma amostra apresentou resultado concordante pelo método fenotípico (Tabela 11).
5.5.5. Medidas de Eficácia Diagnóstica
Em relação aos resultados entre o método automatizado e a PCR em Tempo Real para as sondas Gram positiva e Gram negativa o VPP, VPN, prevalência e acurácia foram de 51,51%, 92,91%, 16,25% e 84,3%, respectivamente (Tabela 14).
Entre o método automatizado e a PCR em Tempo Real para as sondas espécie-especificas o VPP, VPN, prevalência e acurácia foram de 72,72%, 99,21%, 15,62% e 91,8%, respectivamente. Os resultados estão apresentados na Tabela 14.
Tabela 14: Valores de VPP, VPN, sensibilidade, especificidade, acurácia e prevalência dos PCR em Tempo Real em relação ao sistema automatizado Phoenix®.
PCR GP/GN e Phoenix® PCR Espécie-Especifico e Phoenix®
Sensibilidade 0,6538 0,9600 Especificidade 0,8805 0,9333 VPP 0,5151 0,7272 VPN 0,9291 0,9921 Prevalência 0,1625 0,1562 Acurácia 0,8437 0,9187
GP- Gram positivo; GN – Gram negativo; VPP – valor preditivo positivo; VPN – valor preditivo negativo
5.6. Correlação dos Resultados de Liberação pelo Método
Fenotípico e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso
de Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH
Trinta e três hemoculturas foram positivas pelo sistema automatizado Phoenix®, sendo que 23 foram identificadas como bactérias Gram positivas e 10 como Gram negativas (Tabela 10). Estas amostras positivas foram coletadas de 14 pacientes. Dos 10 casos em que os pacientes receberam tratamento inadequado antes da liberação do Gram, seis foram hemoculturas positivas para Gram positivo e três para Gram negativo. Dois pacientes apresentaram episódios com amostras que apresentaram detecção mista de microrganismos pelo sistema automatizado. Na hemocultura de um paciente foi identificado S.
epidermidis e C. freundii, e no outro S. epidermidis e P. putida.
A adequação do tratamento, de acordo com o tempo de liberação dos resultados do Gram e final da hemocultura podem ser observadas na Tabela 15. Durante o tratamento empírico, isto é, antes da liberação do resultado do Gram, em 66,66% (10/14) dos casos os pacientes recebiam tratamento considerado inadequado. Após o resultado final da hemocultura 33,33% (6/14) pacientes tiveram o tratamento corrigido. Na avaliação final, a terapia antimicrobiana foi considerada inadequada em apenas um caso (6,66%), no qual o microrganismo identificado foi Acinetobacter spp. resistente a carbapenêmicos e o paciente que estava em uso de imipenem que foi trocado para ciprofloxacina.
Dos sete casos de hemoculturas identificadas como Gram positivos em que os pacientes receberam tratamento inadequado antes da liberação do Gram, em três dos pacientes foram identificados SCoN. Em dois pacientes foram identificadas amostras de SCoN resistentes à oxacilina pelo sistema
automatizado. Em três pacientes foram identificadas amostras de SCoN com gene mecA positivo, um desses pacientes estava sem tratamento antimicrobiano e foi introduzida vancomicina, o outro estava em uso de vancomicina. O último paciente apresentou infecção mista e foi associada à amicacina na terapia antimicrobiana.
As amostras 445 e 45 referentes ao paciente 2HSP obtiveram sensibilidade à oxacilina pelo sistema automatizado, porém essas amostras foram PCR positivas para o gene mecA. Neste caso, o paciente recebeu vancomicina no tratamento após o resultado final da hemocultura, sendo assim, a terapia foi considerada adequada.
Em três pacientes foram identificados Enterococcus spp., sendo dois E.
faecium e um E. faecalis. Os pacientes com infecção por E. faecium estavam em
tratamento com vancomicina e tiveram o tratamento corrigido para o uso de linezolida. O paciente no qual foi identificada infecção por E. faecalis sensível à vancomicina pelo sistema automatizado estava sendo tratado com cefepima e a antibioticoterapia foi corrigida para teicoplanina. O gene vanA foi encontrado apenas nas amostras que foram resistentes à vancomicina pelo sistema automatizado. Em um paciente foi identificado S. pneumoniae e este paciente estava sem uso de antimicrobiano, o que foi considerado inadequado e corrigido com a introdução de ceftriaxona.
Dentre os três pacientes em que foram identificados Gram negativos com inadequação antes do resultado do Gram, em dois deles foram identificados bactérias Gram negativas e no outro houve identificação mista de microrganismos pelo sistema automatizado. As amostras foram identificadas como E. cloacae e foram ESβL positiva para o sistema automatizado, e na PCR foi encontrado o gene blaSHV. A terapia após o resultado final da hemocultura foi
trocada de cefepima para imipenem. No outro paciente foi identificado um
Acinetobacter spp. com resistência a carbapenêmicos pelo sistema
automatizado. O paciente estava em tratamento com imipenem e posteriormente foi trocado por ciprofloxacina, e assim a terapia foi considerada inadequada após o resultado final da hemocultura. Não foram encontrados os genes de resistência avaliados no estudo para a amostra de Acinetobacter spp.
Dentre as amostras de Gram negativos, duas amostras com blaSHV eram de pacientes que estavam em uso de cefepima e após resultado do antibiograma pelo sistema automatizado, os pacientes tiveram terapia alterada para imipenem. Três amostras de pacientes que estavam em uso de imipenem/meropenem antes do antibiograma tiveram a terapia mantida. Em uma amostra na qual foi detectada com gene blaSHV o paciente não estava em uso de antibióticoterapia no momento da coleta da hemocultura.
Tabela 15: Resultado do teste de sensibilidade e da PCR em Tempo Real para genes que conferem resistência aos antimicrobianos e terapia antimicrobiana utilizada nos episódios de infecção de corrente sanguínea.
DADOS DO PACIENTE DADOS DA AMOSTRA TRATAMENTO
Nº Paciente e Sigla do Hospital Episódio de bacteremia ou data da amostra Microrganismo isolado (Phoenix®)
Teste de Sensibilidade (Phoenix®)
PCR em Tempo Real para genes de resistência BACTEC® PCR em Tempo Real para genes de resistência EDTA Antibioticoterapia 48h antes da coleta de hemocultura Adequação após GRAM da hemocultura Adequação após resultado final da hemocultura
Análise final da Terapia
02 HSP
09/10/09
S. epidermidis S a Oxacilina mecA ND
CIP + SUL/TRIM + CEFP + VAN NÃO NÃO Adequada
S. epidermidis S a Oxacilina ND ND
S. epidermidis S a Oxacilina mecA ND 20/12/09
C.freundii S Cefalosporinas e Carbapenemicos ND ND
CEFP + VAN Associou AMI NÃO Adequada
S. epidermidis R a Oxacilina mecA ND 05 HSP 04/12/08
E. cloacae R a cefalosporinas ND ND
SUL/TRIM + CEFP Trocou CEFP por
IMI NÃO Adequada
E. cloacae R a cefalosporinas ND ND
E. cloacae R a cefalosporinas bla SHV ND 06 HSP 05/03/09
SCoN R a Oxacilina mecA ND
CIP, IMI, VAN NÃO NÃO Adequada
SCoN R a Oxacilina mecA ND
SCoN R a Oxacilina ND ND
09 HSP 08/05/08
P. putida Não realizado - Não há padronização ND ND
CIP + SUL/TRIM + CEFP + CLARIT Introduziu VAN Modificou CEFP por
IMI Corrigida
S. epidermidis R a Oxacilina mecA ND
DADOS DO PACIENTE DADOS DA AMOSTRA TRATAMENTO Nº Paciente e Sigla do Hospital Episódio de bacteremia ou data da amostra Microrganismo isolado (Phoenix®)
Teste de Sensibilidade (Phoenix®)
PCR em Tempo Real para genes de resistência BACTEC® PCR em Tempo Real para genes de resistência EDTA Antibioticoterapia 48h antes da coleta de hemocultura Adequação após GRAM da hemocultura Adequação após resultado final da hemocultura
Análise final da Terapia
12 HSP 02/08/09
S. pneumoniae - ND ND
Nenhuma VAN Modificado para
CRO Corrigida
S. pneumoniae - ND ND 13 HSP 06/06/09
E. faecium R a Glicopepitídeos vanA ND
POLB, TEI Trocou TEI por LIN Associado GEN Corrigida
E. faecium R a Glicopepitídeos vanA ND
E. faecium R a Glicopepitídeos vanA ND 14 HSP
18/01/09 BGNNF R a Caefalosporinas e Carbapenêmicos ND ND
IMI Trocou IMI por CIP NÃO Inadequada
31/01/09 Acinetobacter spp. R a Caefalosporinas e Carbapenêmicos ND ND
15 HSP 02/03/09 K. pneumoniae R a Caefalosporinas S a Carbapenêmicos ND bla SHV LEV + IMI +VAN NÃO Associado POLB Adequada 20 HSP 28/09/09
E. faecalis S a Glicopeptídeos ND ND
CEFP + IMP Associou LIN Descalonado p/ TEI Corrigida
E. faecalis S a Glicopeptídeos ND ND
21 HSP 12/12/08 E. faecium R a Glicopepitídeos vanA ND VAN + CEFP VAN no CVC VAN por LIN Corrigida
27 HSP 08/04/11
S. epidermidis R a Oxacilina mecA ND
MER + VAN + ANFO NÃO NÃO Adequada
S. epidermidis R a Oxacilina mecA ND
S. epidermidis R a Oxacilina mecA mecA
31 IOP 04/11/10 A. baumannii S a Carbapenêmicos ND ND Nenhuma MER + AMI NÃO Adequada
32 IOP 26/03/11 E. coli S a Cefalosporinas e Cabapenêmicos ND ND MET + CEFP + VAN+ ANFO Suspenso MET e
VAN NÃO Corrigida
33 IOP 31/03/11 S. epidermidis R a Oxacilina mecA ND CEFP NÂO NÃO Considerado contaminação
R: Resistência; S: Sensibilidade; AMI: Amicacina; ANFO: Anfotericina; CEFP: Cefepima; CIP: Ciprofloxacina; CLARIT: Claritromicina; CRO: Ceftriaxona; GEN: Gentamicina; IMI: Imipenem; LEV: Levofloxacina; LIN: LInezolida; POLB: Polimixina B; SUL/TRIM: Sulfa-Trimetropim; TEI: Teicoplanina; VAN: Vancomicina; CVC: Cateter venoso central; HSP – Hospital São Paulo; IOP – Instituto Oncológico Pediátrico.
5.7. Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA
As amostras 445, 446, 450, 440, 23 EDTA, 501, 413 e 3 EDTA K2 GEL foram encaminhadas para o sequenciamento do gene 18S rDNA. Devido à presença de mais de um fungo em uma amostra, não foi possível identificar os fungos com o gene proposto, pois a técnica de sequenciamento não conseguiu discriminar mais de uma espécie de fungo por amostra. As amostras 398 e 410 não puderam ser encaminhadas ao sequenciamento, pois a reação de PCR convencional com os iniciadores 18S rDNA não mostrou produto amplificado. A sensibilidade da PCR convencional foi inferior à sensibilidade da PCR em Tempo Real SYBR Green. As amostras 391 e 397 também não apresentaram produtos amplificados na reação de PCR convencional para posteriormente realizar a reação de sequenciamento de DNA.