Diagnóstico Microbiológico Molecular

2.5.1. Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

A técnica de PCR tornou-se uma ferramenta indispensável nos diagnósticos moleculares após sua idealização pelo cientista Kerry Mullis em 1983. É surpreendente a rapidez com que os avanços tecnológicos baseados nessa metodologia desenvolveram após a sua automação, isolamento e purificação da enzima Taq DNA polimerase a partir da bactéria termofílica

Thermus aquaticus. Na área de diagnóstico por biologia molecular, a PCR

permitiu a detecção de genes alvos com inédita sensibilidade e facilidade. Sua aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas estabeleceu uma nova era na detecção e caracterização de microrganismos e passaram, no presente, a fazer parte da rotina de processamento de algumas amostras clínicas (Saiki et. al., 1988). Na pratica clinica, a PCR pode ser pelo método convencional ou em Tempo Real. Os reagentes utilizados na reação de amplificação do DNA são os iniciadores, dNTPs, enzima como a Taq DNA polimerase, MgCl_2, uma solução tampão e água, além do DNA extraído. Esta reação é composta por uma temperatura de desnaturação, uma de anelamento e uma de extensão do DNA, repetidas vezes (Konenam et. al., 2006).

Importantes avanços tecnológicos, como PCR em Tempo Real e espectrometria de massa, tem revolucionado o diagnóstico clínico. Em particular, o PCR em Tempo Real que tem permitido a técnica maior sensibilidade, robustez e menor contaminação, além da quantificação. Esta técnica combina a amplificação e a quantificação de uma sequência de DNA alvo por meio da detecção de fluorescência utilizando sondas específicas marcadas com fluoróforos, ou com base na determinação da temperatura de desnaturação de uma sequencia de DNA dupla fita (“melting temperature” - Tm) marcada com substância intercalante de DNA fluorescente (Klein, 2002; Kubista et. al., 2006). Os princípios aplicados para detecção de uma sequência alvo são baseados na

mensuração de fluorescência durante a reação por diferentes filtros que capturam a fluorescência conforme o comprimento de onda emitido. A fluorescência é proporcional à quantidade de produto amplificado em cada ciclo e o número de ciclos de amplificação necessários para obter uma determinada quantidade de DNA é registrado como ciclo do threshold (Mackay, 2004; Kubista

et. al., 2006).

Essa evolução tecnológica juntamente com o caráter indispensável da PCR em laboratórios moleculares levou a uma vasta expansão do número de aplicações clínicas. Atualmente, foi desenvolvida uma plataforma que utiliza a espectrometria de massa de produtos de PCR ionizados (incluindo produtos do gene 16S rDNA) que é capaz de integrar, no mesmo sistema, a identificação da espécie do microrganismo, genotipagem, detecção de genes de virulência e de resistência aos antimicrobianos (Ecker et. al., 2006).

Atualmente, a detecção de bactérias de interesse clínico pelos laboratórios de biologia molecular é realizada pela amplificação do gene 16S rDNA, codificador da subunidade menor do RNA ribossomal (rRNA). Este gene apresenta regiões altamente conservadas entre todas as espécies bacterianas e regiões altamente variáveis que permitem a diferenciação entre espécies (Van de Peer et. al., 1996). O gene 16S rDNA, geralmente apresenta nove regiões hipervariáveis, que demonstram diversidade filogenética entre as diferentes espécies bacterianas, a utilização de iniciadores denominados universais, complementares às regiões conservadas que flanqueiam as regiões variáveis do gene, são suficiente para identificação bacteriana em grande parte dos casos.

Análises posteriores, utilizando hibridização com sondas de DNA, restrição dos produtos de PCR por RFLP ou o sequenciamento direto dessas sequências permitem a identificação da espécie bacteriana.

2.5.2. Genes de Resistência aos Antimicrobianos

2.5.2.1. Gene mecA

Os antimicrobianos -lactâmicos agem através da inibição de enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do peptideoglicano, principal componente da parede celular das bactérias Gram positivas (Giesbrecht et. al., 1998). Estas enzimas catalisam a etapa final da síntese da parede celular e, por ser o sítio de ação das penicilinas, passaram a ser chamadas de proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs). Estas PBPs catalisam a reação de transpeptidação necessária para a união das cadeias de peptideoglicano, constituintes da parede celular bacteriana. O mecanismo de resistência ao -lactâmicos está associado à alteração do sítio de ação do mesmo pela produção de uma proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a (também denominada PBP2’).

Esta proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a, é codificada pelo gene mecA, que confere resistência à meticilina em S. aureus e em

Staphylococcus Coagulase Negativo (SCoN). O gene mecA faz parte de um

elemento genético móvel designado cassete estafilocócico do cromossomo mec (“staphylococcal cassette chromosome mec” - SCCmec), integrado ao cromossomo de S. aureus e localizado próximo à sua origem de replicação. (Katayama et. al., 2000). O SCCmec apresenta o complexo do gene mec, que codifica resistência à meticilina, e o complexo do gene ccr (do inglês “cassette chromosome recombinase”), que codifica recombinases responsáveis pela sua mobilidade. Além disso, apresenta uma região denominada J (derivada do termo inglês “junkyard”) que compõe o restante do material genético do complexo SCCmec. Esta região é de grande importância para auxiliar na classificação dos diferentes tipos de SCCmec, atualmente classificados em 11 tipos (Turlej et. al., 2011).

O complexo do gene mecA é composto do gene propriamente dito e de seus genes regulatórios mecI e mecR1, localizados na região posterior ao promotor do gene mecA. O gene mecI codifica uma proteína que se liga ao DNA e reprime a transcrição do gene mecA, enquanto que o gene mecR1 codifica uma proteína que promove a transcrição do gene mecA na presença de  -lactâmicos (Sharma et. al., 1998). São conhecidas quatro classes deste complexo, nomeadas de A a D, que divergem entre si de acordo com a presença de determinadas seqüências de inserção (seqüências de DNA envolvidas com a mobilização de informação genética, de função similar aos plasmídeos) (Katayama et. al., 2001).

Diversos autores relataram alta incidência de infecção de corrente sanguínea por Staphylococcus spp. resistentes à meticilina. (Linares et. al., 2009; Bert et. al., 2010). Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) realizado com 3.907 amostras de bactérias Gram positivas coletadas de centros médicos no mostrou que S.

aureus foi o microrganismos mais prevalente em infecções de corrente

sanguínea seguido por SCoN. Neste mesmo estudo, 31% dos isolados de S.

aureus e 80% dos SCoN apresentaram resistência a meticilina (Gales et. al.,

2009).

2.5.2.2. Genes vanA e vanB

Os antimicrobianos glicopeptídeos (vancomicina) agem no metabolismo de construção da parede celular bacteriana, através da ligação da porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano, principal componente estrutural da parede celular das bactérias Gram positivas (Silveira et. al., 2006; Eggert et. al., 2001).

A resistência bacteriana à vancomicina ocorre pela produção de um dipeptídeo, com terminação D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac), precursor do peptidoglicano. Esse dipeptídio diminui em uma escala superior a 1000 vezes a afinidade da vancomicina com a camada de peptidoglicano, conferindo resistência a este antimicrobiano principalmente em Enterococcus faecium e E.

faecalis (McComas et. al., 2003; Silveira et. al., 2006).

O gene vanA é mediado pelo transposon Tn1546, localizado em plasmídeo ou cromossomo da célula bacteriana. O transposon Tn1546 codifica nove polipeptídeos que atuam em conjunto na conferência da resistência a vancomicina. Estes polipeptídeos podem ser distribuídos em quatro grupos funcionais: Transposição, Regulação, Resistência e Proteínas acessórias (não essenciais).

São descritos sete fenótipos de resistência aos glicopeptídios, A,B,C,D,E,G e L, e os genes mais prevalentes, vanA e vanB estão descritos em espécies E. faecalis e E. faecium, os enterococos com fenótipo vanA apresentam alto grau de resistência a vancomicina e teicoplanina, com resistência induzível à presença de glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina, avorpacina, ristocetina) e por agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e polimixina B. O fenótipo VanB apresenta altos níveis de resistência à vancomicina enquanto a sensibilidade a teicoplanina é mantida. Ambos os genes podem ser encontrados em plasmídeos ou no cromossomo bacteriano e ser transferidos entre espécies enterocócicas (Cetinkaya et. al., 2000).

O surgimento dos primeiros isolados de enterococos resistentes à vancomicina e sua disseminação no ambiente hospitalar contribuiu para a busca de novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et. al., 2006). Em infecções de corrente sanguínea, dentre os Gram

positivos, as espécies de Enterococcus spp. estão entre os microrganismos mais isolados em ICS (Erdem et. al., 2009). No Brasil Gales e colaboradores, em um estudo multicêntrico em 2008, reportaram os Enterococcus spp. como a oitavo espécies mais encontradas, sendo o terceiro entre os Gram positivos, com resistência a vancomicina em 7,7% dos isolados (Gales et. al., 2009).

2.5.2.3. Produção de -Lactamases

Os antimicrobianos -lactâmicos interferem na parede celular de Gram negativos e são frequentemente os mais utilizados no tratamento das infecções bacterianas. A ampla utilização, principalmente, das cefalosporinas de segunda e terceira gerações nos tratamento de infecções causadas por enterobactérias foi acompanhada pelo surgimento e disseminação de cepas bacterianas resistentes produtoras de enzimas do tipo ESβL (Tumbarello et. al., 2006).

As β-lactamases são um grupo de enzimas capazes de inativar antimicrobianos β-lactâmicos, por hidrolisarem a ligação amida do β-lactâmicos, causando a destruição irreversível do antimicrobiano (Livermore, 1995). A atividade enzimática é variável de acordo com o tipo, a quantidade de β-lactamase produzida e os diversos substratos β-lactâmicos existentes. Estas enzimas são capazes de hidrolisar as penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens, e a interação entre estas enzimas e seus substratos resulta em compostos inativos que permitem a sobrevivência da célula bacteriana (Bush, 2001). A quantidade de enzima produzida, a habilidade da enzima em hidrolisar o antimicrobiano e a velocidade com que o -lactâmico penetra pela membrana celular externa são alguns fatores que podem influenciar na capacidade da β-lactamase em conferir resistência (Livermore, 1991).

As β-lactamases constituem um grupo heterogêneo de enzimas produzidas por inúmeras espécies bacterianas, tanto positivas quanto Gram-negativas, porém com diversidades estruturais e localizações diferentes. Nas bactérias Gram-positivas, as β-lactamases são secretadas para o meio extracelular, dessa forma são menos ativas que as β-lactamases produzidas pelas bactérias Gram-negativas. Nesses microrganismos, as β-lactamases estão presentes no espaço periplásmico, podendo assim alcançar maiores concentrações e agirem de uma maneira mais eficaz sobre os antimicrobianos β-lactâmicos (Livermore, 1993).

A codificação para a produção das -lactamases pode ser cromossômica ou mediada por plasmídios e transposons, podendo ser induzida tanto pela presença de -lactâmicos, como de precursores de parede celular no meio extracelular (Livermore, 1991; Livermore, 1993).

Devido à grande diversidade de tipos de β-lactamases, inúmeras tentativas de estabelecer um sistema de classificação para estas enzimas foram propostos ao longo dos anos. Atualmente, dois esquemas de classificações têm sido considerados como de maior importância. A classificação de Ambler, desenvolvida em 1980, foi baseada nas sequências de nucleotídeos e aminoácidos das enzimas e somente quatro classes moleculares de β-lactamases foram descritas: A) β-β-lactamases de espetro ampliado (ESβLs), penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases; C) cefalosporinases cromossomais; e D) oxacilinases (Ambler, 1980). Em 1995, Bush, Jacoby e Medeiros propuseram um esquema baseado nas propriedades bioquímicas, estrutura molecular e sequencia nucleotídica das enzimas, combinando as características estruturais e funcionais das -lactamases, classificando-as em grupos funcionais (Bush et. al. 1995).

2.5.2.3.1. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs)

Atualmente, as enzimas ESLs representam o maior grupo de  -lactamases estudadas (Bradford, 2001; Bush et. al., 1995). As ESLs são da classe molecular A de Ambler (1980) e pertencentes ao grupo dois de Bush, Jacoby e Medeiros (1995). Elas conferem resistência à ampicilina, à carbenicilina, à ticarcilina e às cefalosporinas, no entanto, geralmente mantêm a sensibilidade às cefamicinas, aos carbapenens e aos monobâctamicos. São, geralmente, produzidas por Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mas podem ser produzidas por qualquer bactéria Gram negativa (Bradford, 2001). As ESL apresentam uma serina no seu sítio ativo e são codificadas por genes localizados em plasmídeos que podem também codificar resistência aos aminoglicosídeos, tetraciclina, cloranfenicol e trimetoprim/sulfametoxazol. (Rossolini et. al., 2008; Winokur et. al., 2001).

Outras variantes de ESβL também já foram descritas em diferentes microrganismos. As ESβL BES (Serratia marcescens), FEC-1 (E. coli), CME-1 (Cryseobacterium meningosepticum), PER (P. aeruginosa e Salmonella

enterica), SFO (E. cloacae), TLA (E. coli) e VEB (E. coli), sendo pouco

frequentes (Bradford, 2001) (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1). Essas enzimas também conferem resistência a todas as oximino cefalosporinas, especialmente a ceftazidima e ao aztreonam. No entanto, as enzimas bla_TEM, bla_SHV e bla_CTX-M são as mais prevalentes entre as enterobactérias (Harada et.

2.5.2.3.1.1. -Lactamases TEM

A descrição da primeira β-lactamase, denominada TEM-1 (subgrupo 2b), ocorreu em 1960. A β-lactamases, TEM-1, foi encontrada em Escherichia coli isolada da corrente sanguínea de uma paciente grega chamada Temoniera, origem da sigla da β-lactamase TEM (Turner, 2005). Atualmente, responde por mais de 90% da resistência a ampicilina em amostras de E. coli, sendo também responsável pela resistência a ampicilina e penicilina em amostras de

Haemophilus influenza e Neisseria gonorrhoeae (Paterson & Bonomo 2005;

Livermore, 2008). Esta enzima é codificada por genes localizados, usualmente, em elementos genéticos móveis, plasmídios e transposons, que podem ser transferidos para diferentes plasmídios entre microrganismos da mesma espécie ou de espécies diferentes. Devido à grande facilidade de disseminação, esta enzima tem sido descrita em diversas espécies de Enterobactérias, e em outras espécies bacterianas (Paterson & Bonomo 2005).

Atualmente existem mais de 190 derivados de TEM (http://www.lahey.org/Studies/temtable.asp) sendo algumas resistentes aos inibidores de β-lactamase e a grande maioria apresenta o fenótipo ESβL (Bradford, 2001). As substituições de aminoácidos que ocorrem em determinadas posições da enzima TEM resultam em leves alterações nos fenótipos de ESβL, com a habilidade de hidrolisar oximino-cefalosporinas específicas como ceftazidima e cefotaxima, ou alterar seus pontos isoelétricos de 5,2 para 6,5. (Bradford, 2001). Estudos laboratoriais de indução de mutações para a β-Lactamase TEM-1 (Blazquez et. al., 2000; Huang et. al., 1996; Vakulenko et. al., 1995) demonstraram que essas mutações, ocorridas naturalmente em ESβL do tipo TEM, são resultado da pressão seletiva de vários agentes β-lactâmicos utilizados em uma determinada instituição (Blazquez et.

E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, e Salmonella spp. (Bonnet et. al., 1999; Marchandin et. al., 1999; Morosini et. al., 1995; Palzkill et. al., 1995; Perilli et. al., 2000; Tessier et. al., 1998), tem sido, também, reportadas entre bactérias Gram negativas não

Enterobacteriaceae. As β-lactamases TEM-21 (Dubois et. al., 2005) e TEM-42 (Mugnier et. al., 1996) foram descritas em uma cepa de P. aeruginosa e a TEM-17 em uma cepa de Capnocytophaga ochracea (Rosenau et. al., 2000).

2.5.2.3.1.2. -Lactamases SHV

A denominação da sigla SHV vem de uma propriedade bioquímica da enzima variável sulfidrila (“sulphydryl variable”) (Tzouvelekis & Bonomo, 1999). Em muitas cepas de K. pneumoniae o gene bla_SHV-1, ou outro gene relacionado, apresenta-se integrado ao cromossomo bacteriano (Livermore, 1995). O fenótipo ESβL é caracterizado a partir de substituições de aminoácidos que ocorrem no gene bla_SHV-1, e estas alterações assemelham-se as que acontecem com as ESβL do tipo TEM (Huletsky et. al. 1993). Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro ampliado, denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K. pneumoniae, K. ozaenae e Serratia marcescens (Knothe

et. al., 1983).

Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro ampliado, denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K. pneumoniae, K.

ozaenae e Serratia marcescens (Knothe et. al. 1983). Em 1988, SHV-3 e SHV-4

foram descritas por Jarlier e colaboradores (Jarlier et. al., 1988) e Bure e colaboradores (Bure et. al., 1988), respectivamente. Ambas foram encontradas em amostras clínicas de K. pneumoniae recuperadas de hospitais franceses. SHV-5 foi descrita na Grécia e Tailândia (Chanawong et. al., 2001; Neonakis et.

al., 2003; Poirel et. al., 2004a), enquanto SHV-12 foi identificada, até o momento,

somente na Tailândia (Chanawong et. al., 2001).

Apesar de grande parte das -lactamases do tipo SHV apresentar fenótipo ESβL, as beta-lactamases SHV-10 e SHV-11, possuem fenótipo de resistência aos inibidores das -lactamases e apesar de hidrolisar as penicilinas, essa enzima apresenta uma hidrólise reduzida para as cefalosporinas e, dessa forma, não é classificada como ESβL (Bradford, 2001). Até o presente momento, foram descritas mais de 145 variantes da β-lactamase da classe SHV (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV).

Os genes do tipo bla_TEM e bla_SHV possuem propriedades bioquímicas parecidas, conservando, assim, um grau de similaridade entre si. A diferença estrutural entre estas enzimas é discreta, e está relacionada com mudanças de aminoácidos junto ao sítio ativo da enzima (Bradford, 2001).

2.5.2.3.1.3. -Lactamases CTX-M

A β-lactamase tipo CTX-M pode ter sido originada da enzima cromossômica AmpC de Kluyvera ascorbata, devido ao seu alto grau de homologia (Bonnet, 2004).

As ESβL do tipo cefotaximase (CTX-M) são codificadas por genes, bla

CTX-M, localizados em plasmídeos, que normalmente abrigam outros genes que conferem resistência aos aminoglicosídeos, ao cloranfenicol, às sulfonamidas, ao trimetoprim e à tetraciclina. Estas enzimas conferem resistência a todas as cefalosporinas de espectro ampliado, entretanto, apresentam como substratos preferenciais a cefotaxima e a ceftriaxona (Bonnet, 2004; Cartelle et. al., 2004; Rossolini et. al., 2008). Apresentam apenas 40% de similaridade com as β-lactamases TEM e SHV (Tzouvelekis et. al., 2000).

Os primeiros casos de infecções causadas por isolados de E. coli e K.

pneumoniae produtores de CTX-M foram relatados no final dos anos 80 no

Japão, Europa e Argentina. Desde então, essas enzimas vêm se disseminando mundialmente em diferentes gêneros de enterobactérias (Bonnet, 2004; Rossolini et. al., 2008). Atualmente, encontram-se descritos na literatura mais de 130 tipos de CTX-M diferentes (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1). As enzimas pertencentes ao mesmo grupo diferem umas das outras por apenas um, ou por pouquíssimos aminoácidos (Rossolini et. al., 2008). Embora tenha sido descrito na literatura a ocorrência de β-lactamases do tipo CTX-M com maior atividade hidrolítica contra a ceftazidima que a cefotaxima, esse achado tem sido justificado devido ao uso extensivo de ceftazidima na prática médica (Bonnet, 2004; Cartelle et. al., 2004; Rossolini et. al., 2008).

No início da década de 1990, a β-lactamase CTX-M-2 disseminou-se rapidamente na Argentina e em países vizinhos (Rossolini et. al., 2008). Outros membros da família CTX-M estão distribuídos em diversos lugares do mundo; CTX-M-9 e CTX-M-14 predominantemente na Ásia e na Espanha (Hernandez et.

al., 2005; Munday et. al., 2004), CTX-M-3 e CTX-M-15 na Europa. Apesar de não

ter sido isolada no Reino Unido antes de 2001, a enzima CTX-M-15 é atualmente a ESβL mais prevalente em amostras bacterianas de E. coli e K. pneumoniae nesta região (Livermore & Hawkey 2005).

Durante muitos anos, a identificação da enzima CTX-M esteve restrita aos membros da família Enterobacteriaceae. Porém em isolados clínicos de P.

aeruginosa já foram descritas as enzimas CTX-M-1, CTX-M-43 (Al Naiemi et. al.,

2006; Celenza et. al., 2006) e CTX-M-2 (Picão et. al., 2009a; Picão et. al., 2009b). A disseminação das β-lactamases do tipo CTX-M está causando importantes e imprevisíveis mudanças na epidemiologia da resistência aos antibióticos β-lactâmicos (Rossolini et. al., 2008).

2.5.2.3.2. -Lactamases KPC

A enzima KPC foi primariamente descrita em uma cepa de K. pneumoniae isolada na Carolina do Norte, EUA, em 1996, durante o estudo de vigilância ICARE (Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology). As carbapenemases do tipo KPC (sigla para “Klebsiella pneumoniae carbapenemase”), incluídas na classe A (Ambler, 1980) ou grupo 2f de Bush (Bush et. al., 1995) são enzimas que são capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (Queenan & Bush 2007). A descoberta da KPC-1 foi seguida por várias publicações de outra variante, a KPC-2, identificada em 2003, de isolados de provenientes de Baltimore, coletados durante os anos de 1998 e 1999. No entanto, uma recente correção na sequência de nucleotídeos do gene bla_KPC-1 indicou que as enzimas KPC-1 e KPC-2 são idênticas (Yigit et. al., 2001). A partir de então, relatos de KPC-2 tornaram-se frequentes na Costa Leste dos Estados Unidos e rapidamente expandiu-se, sendo descrito em diversas partes do mundo (Queenan & Bush 2007). Até o momento, 12 variantes de KPC foram descritas (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).

As enzimas do tipo KPC são as mais prevalentes entre as enzimas da classe A de Ambler. Estas enzimas encontram-se disseminadas mundialmente, com relatos na América do Sul, Canadá, Israel, China, em mais de oito países da Europa; entretanto, a frequência destes isolados é endêmica somente nos Estados Unidos, em Israel e na Grécia. Isolados produtores de KPC estão amplamente disseminados no nordeste dos Estados Unidos, sendo detectados em cerca de dez estados americanos. Em Tel Aviv, Israel, foi descrito o primeiro surto de E. coli produtora de KPC-2 fora dos Estados Unidos. Na Grécia, um estudo de vigilância revelou a predominância de um clone de K. pneumoniae

produtor de KPC-2 distribuído em 18 hospitais representativos de todo o território grego (Navon-Venezia et. al., 2006; Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007; Giakoupi et. al., 2009).

A enzima KPC-2 foi primeiramente descrita no Brasil por Monteiro e colaboradores (2009), em quatro amostras de K. pneumoniae isoladas entre setembro e novembro de 2006 em um hospital de Recife. Desde então, isolados de K. pneumoniae e E. cloacae produtores de KPC-2 também foram descritas no Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, mostrando que a emergência deste mecanismo de resistência em hospitais brasileiros vem ocorrendo desde, pelo menos, desde o ano de 2005 (Pavez et. al., 2009; Peirano et. al., 2009; Zavascki et. al., 2009).

2.5.2.3.3. Metalo-β-lactamases

As metalo-β-lactamases são um grupo de enzimas que possuem a capacidade de hidrolisar todos os β - lactâmicos, exceto monobactâmicos. Não são inibidas pelos inibidores das serino-β-lactamases como ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Queenan & Bush 2007), entretanto, são inibidas por agentes quelantes, como o EDTA, derivados de tiol e do ácido dipicolínico (Payne et. al., 1997a; Payne et. al., 1997b; Laraki et. al., 1999; Bebrone, 2007). Estas enzimas são pertencentes ao grupo três de Bush (Bush et. al., 1995) e na classe molecular B de Ambler (Ambler, 1980), e necessitam do Zn+² ou outros cátions divalentes como cofatores no sítio ativo.

As MLs foram inicialmente codificadas por genes cromossomais em