Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos
de Patógenos Causadores de Infecção de Corrente
Sanguínea pela Técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à
Transplantes de Células-Tronco Hematopoiéticas
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutora em Ciências.
São Paulo
2012
Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos
de Patógenos Causadores de Infecção de Corrente
Sanguínea pela Técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à
Transplantes de Células-Tronco Hematopoiéticas
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutora em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari
Co-orientadora: Paola Cappellano
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Processo 2008/04761-8 e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Processo 141636/2008-4
São Paulo
2012
MENEZES, Liana Carballo
Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos de Patógenos Causadores de Infecção de Corrente Sanguínea pela Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à Transplantes de Células-Tronco Hematopoiéticas – Liana Carballo Menezes - São Paulo, 2012. xviii, 228 p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Bacterial identification and antimicrobial resistance of the pathogens causing bloodstream infections by real-time polymerase chain reaction of patients undergoing hematopoietic stem cells transplant.
Palavra chave: 1. Identificação bacteriana; 2. Infecção de corrente sanguínea; 3. PCR em Tempo Real; 4. Resistência a antimicrobianos; 5. Transplante de células-tronco hematopoiética.
iii
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobieh Diaz
São Paulo
2012
i
LIANA CARBALLO MENEZES
Identificação Bacteriana e Resistência aos
Antimicrobianos de Patógenos Causadores de
Infecção de Corrente Sanguínea pela Técnica da
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
de Pacientes Submetidos à Transplantes de
Células-Tronco Hematopoiéticas
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Profa. Dra. Elsa Massae Mamizuka
Titular: Profa. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
Titular: Profa. Dra. Silvia Figueiredo Costa
Titular: Dr. Carlos Alberto Pires Pereira
Suplente: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
ii
“Não se pode ensinar tudo a alguém, pode-se apenas ajudá-lo a
encontrar por si mesmo o caminho.”
Galileu Galilei
iii
Dedico este trabalho
À minha família, meus pais Luiz e Zulma, à minha amada filha Giovanna e
ao meu marido Wilson, aos meus irmãos, Daniela e José Luiz, às minhas
sobrinhas Gabriela e Rafaela, por tornarem possível essa grande
conquista, por toda dedicação, companheirismo e amor. Todos vocês
foram importantes para a realização deste trabalho e sempre serão a
inspiração da minha vida!!!
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, sempre com muita competência e profissionalismo. Agradeço pelo grande entusiasmo dedicado a este estudo, pela orientação e pela disponibilidade em todos os momentos. Meu respeito e admiração pelo exemplo de ética profissional. Muito obrigada pela confiança depositada no meu trabalho e pelas oportunidades concedidas ao longo destes anos no LEMC.
À minha co-orientadora Paola Cappellano pelos valiosos ensinamentos durante o convívio, pela orientação e pela disponibilidade em todos os momentos em que precisei, sempre com muita competência.
À Profª Dra. Ana Cristina Gales, pelas constantes ensinamentos, pelo exemplo de caráter e por ter me concedido o privilégio de fazer parte da equipe LEMC/ALERTA. Muito obrigada também, pela oportunidade do grande desenvolvimento profissional e pessoal, como sua aluna de mestrado.
Aos professores da Disciplina de Doenças Infecciosas da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, pelos ensinamentos enriquecedores que contribuíram muito para a minha formação profissional.
Aos médicos e enfermeiros da unidade de hematologia e transplante de medula óssea do Hospital São Paulo, em especial ao Dr. José Salvador Rodrigues de Oliveira pela oportunidade de realizar este estudo.
Às minhas eternas amigas, Andrea Pereira e Jussimara Monteiro Nürmberger, pelo amor, pela parceria em tantos projetos desenvolvidos juntas ao longo da nossa história acadêmica.
Aos amigos, Paulo Bispo, Luiz Roberto Chiorotto, Karen Bauab e Milene Quiles pelo auxílio prestado com muita competência durante a realização dos testes
v laboratoriais. A colaboração de vocês foi fundamental para o desenvolvimento deste estudo. Em especial à Talita Trevizani Rocchetti, você foi essencial para a realização e finalização deste projeto.
À Eliete Aguiar e André Doi, supervisores do LEMC, pela gentileza e vasta experiência microbiológica.
À amiga e secretária do LEMC, Rosana Capecce, pela dedicação e valioso apoio em todos os momentos.
À secretária da DIPA, Tereza Cristina, pela presteza e competência. À secretária da Pós- Graduação, Patrícia pela colaboração ao longo destes anos.
A todos que passaram pelo LEMC/Alerta nestes últimos anos e que eu tive a alegria e o privilégio de conviver. Em especial Rodrigo Cayô, Raquel Girardello, Adriana Nicoletti, Renata Picão, Adryella, Loren, Kelly, Martha, Zonta, Fernanda Inoue, Fernanda Marques, Thaís, Vinicius, Thomas, Eloiza, Danilo, Lorena, Jéssica, Cecília Cergole, Cecília Godoy, Paula Peraro, Paula Ignez, Paula Koga, Rafaela, Katia e Amilton pelo convívio agradável e carinho demonstrado durante a realização deste trabalho.
À minha família, minha especial referência, cunhadas (o), sogra, sobrinhas (o) e em especial aos meus irmãos, que mesmo distantes fisicamente, sempre estiveram presentes nas minhas decisões, escolhas e conquistas. Agradeço o amor, o apoio e a amizade fundamentais a nossa união.
A todos que participaram diretamente ou indiretamente do meu trabalho, o meu muito obrigada!
vi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ... xi
LISTA DE FIGURAS ... xiii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xiv
RESUMO ... xvii
1.
INTRODUÇÃO ... 1
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5
2.1.
Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas ... 5
2.2.
Infecções de Corrente Sanguínea em TCTH ... 6
2.3.
Epidemiologia das Infecções em TCTH ... 8
2.4.
Diagnóstico Microbiológico ... 13
2.4.1.
...Hemoculturas ... 13
2.4.2.
...Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos ... 15
2.5.
Diagnóstico Microbiológico Molecular ... 16
2.5.1.
...Reação em Cadeia da Polimerase - PCR ... 17
2.5.2.
...Genes de Resistência aos Antimicrobianos ... 19
2.5.2.1.
...Gene mecA ... 19
2.5.2.2.
...Genes vanA e vanB ... 20
2.5.2.3.
...Produção de
-Lactamases ... 22
2.5.2.3.1.
.
-Lactamases de Espectro Ampliado (ES
Ls) ... 24
2.5.2.3.1.1.
-Lactamases TEM ... 25
2.5.2.3.1.2.
-Lactamases SHV ... 26
2.5.2.3.1.3.
-Lactamases CTX-M ... 27
2.5.2.3.2.
.
-Lactamases KPC ... 29
vii
2.5.3.
...Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico ... 33
2.5.4.
...Validação de Novos Métodos Diagnósticos ... 37
3.
OBJETIVOS ... 39
4.
MATERIAIS E MÉTODOS ... 40
4.1.
Casuística ... 40
4.2.
Variáveis Clínicas ... 40
4.3.
Diagnóstico Microbiológico ... 41
4.3.1.
...Hemoculturas ... 41
4.3.1.1.
...Coleta de Sangue ... 41
4.3.1.2.
...Processamento das Hemoculturas ... 41
4.3.2.
...Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos ... 42
4.4.
Diagnóstico Microbiológico Molecular ... 43
4.4.1.
...Padronização da PCR em Tempo Real ... 43
4.4.1.1.
...Preparação das Amostras Controles e Amostras Clínicas ... 43
4.4.1.2.
...Extração de DNA ... 44
4.4.1.2.1.
.Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura ... 44
4.4.1.2.2.
.Extração do DNA Direto dos Tubos com EDTA K2 Gel ... 45
4.4.1.3.
...Iniciadores e Sondas TaqMan-MGB ... 47
4.4.1.4.
...Amplificação por PCR em Tempo Real ... 50
4.4.1.5.
...Eficiência da PCR em Tempo Real ... 51
4.4.2.
...Validação de Novos Métodos de Diagnóstico ... 53
4.4.2.1.
...Especificidade Analítica ... 53
4.4.2.2.
...Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff” ... 53
4.4.2.3.
...Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) . 54
4.4.2.4.
...Acurácia Clínica ... 54
viii
4.4.2.5.
...Concordância entre Testes Fenotípicos e PCR em Tempo
Real ... ... 56
4.4.2.5.1.
.Concordância da Identificação Bacteriana entre Teste
Fenotípico e PCR em Tempo Real ... 56
4.4.2.5.2.
.Concordância da Resistência aos Antimicrobianos entre
Teste Fenotípico e PCR em Tempo Real... 57
4.4.2.5.3.
.Medidas de Eficácia Diagnóstica ... 57
4.5.
Correlação dos Resultados de Liberação pelo Método Fenotípico
e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso de
Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH ... 58
4.6.
Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA ... 58
5.
RESULTADOS ... 61
5.1.
Casuísticas ... 61
5.2.
Variáveis Clínicas ... 61
5.3.
Diagnóstico Microbiológico ... 63
5.3.1.
...Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos ... 63
5.4.
Diagnóstico Microbiológico Molecular ... 65
5.4.1.
...Padronização PCR em Tempo Real ... 65
5.4.1.1.
...Amplificação por PCR em Tempo Real ... 65
5.4.1.2.
...Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ... 66
5.4.1.2.1.
.SYBR Green ... 66
5.4.1.2.2.
.TaqMan ... 69
5.4.2.
...Validação de Novos Métodos de Diagnóstico ... 72
5.4.2.1.
...Determinação do Limite do Branco (LoB) ... 72
5.4.2.2.
...Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) . 72
5.4.2.3.
...Acurácia Clínica ... 74
5.4.3.
...Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de
Hemocultura de Pacientes Submetidos à TCTH. ... 78
ix
5.4.3.1.
...Detecção do gene HFE de Controle Interno da Extração de
DNA gene. ... 78
5.4.3.2.
...Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA ... 78
5.4.3.3.
...Detecção do Gene 18S rDNA para Fungos ... 79
5.4.3.4.
...Detecção dos Genes Espécie-específicos ... 80
5.4.3.5.
...Detecção de Genes que Conferem Resistência aos
Antimicrobianos ... 87
5.5.
Concordância do PCR em Tempo Real com os Testes
Fenotípicos ... 96
5.5.1.
...Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR
em Tempo Real das Amostras de Frascos de Hemocultura BACTEC
®96
5.5.2.
...Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR
em Tempo Real das Amostras de tubos de EDTA K2 GEL ... 96
5.5.3.
...Concordância entre os Frascos de Hemocultura BACTEC
®versus Tubos de EDTA K2 GEL por PCR em Tempo Real ... 97
5.5.4.
...Concordância entre os Testes Fenotípicos e PCR em
Tempo Real na Detecção de Resistência aos Antimicrobianos ... 97
5.5.5.
...Medidas de Eficácia Diagnóstica ... 98
5.6.
Correlação dos Resultados de Liberação pelo Método Fenotípico
e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso de
Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH ... 99
5.7.
Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA ... 104
6.
DISCUSSÃO ... 105
7.
CONCLUSÕES ... 128
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 129
9.
ABSTRACT ... 171
10.
ANEXOS ... 173
ANEXO I – Ficha médica preechida pelo serviço de racionalização de
antimicrobianos de vigilância de hemoculturas do HSP e
IOP/GRAACC ... 173
x
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Relação dos microrganismos controles positivos utilizados na padronização das reações de PCR em Tempo Real. ... 46 Tabela 2: Lista de iniciadores e sondas TaqMan para amplificação da região codificadora dos genes de resistência aos antimicrobianos, controle interno e genes espécie-especificos para a identificação dos microrganismos. ... 48 Tabela 3: Categorias do Índice Kappa ... 57 Tabela 4: Resultados da Temperatura de melting e desvio padrão da Tm dos
produtos amplificados de amostras controles ATCC para os genes de resistência. ... 66 Tabela 5: Eficiência da reação de PCR em Tempo Real, Ct e Tm da última diluição, concentração em UFC/mL do microrganismo detectado na última diluição de amplificação dos genes de resistência. ... 68 Tabela 6: Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo Real utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram específicas... 70 Tabela 7: Resultados de “slope”, R2, eficiência e última diluição detectada das reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan e SYBR Green para os genes espécie-específicos dos principais patógenos que causam infecção de corrente sanguínea. ... 71 Tabela 8: Resultados de “cutoff” de amostras negativas e LoD de amostras positivas baixas para os genes avaliados. ... 73 Tabela 9: Sensibilidade e especificidade clínica determinada pela curva ROC de acordo com o Ct do LoD para os genes espécie-especificos, fungo 18S rDNA, para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo e genes de resistência aos antimicrobianos. ... 75 Tabela 10: Dados clínicos dos pacientes, resultado fenotípico e da PCR em Tempo Real para identificação dos microrganismos dos 160 frascos de hemocultura BACTEC®. ... 82 Tabela 11: Resultado do teste de sensibilidade pelo método automatizado e da PCR em Tempo Real para genes e resistência aos antimicrobianos dos frascos de BACTEC®. ... 89 Tabela 12: Resultados da identificação fenotípica pelo sistema automatizado Phoenix® e da PCR em Tempo Real dos frascos de hemocultura BACTEC® e dos tubos de EDTA K2 gel coletados pareados. ... 94 Tabela 13: Resultados da detecção fenotípica pelo sistema automatizado Phoenix® e da PCR em Tempo Real para detecção de resistência aos antimicrobianos dos frascos de hemocultura BACTEC® e tubos de EDTA K2 gel coletados pareados. ... 95
xii Tabela 14: Valores de VPP, VPN, sensibilidade, especificidade, acurácia e prevalência dos PCR em Tempo Real em relação ao sistema automatizado Phoenix®. ... 98 Tabela 15: Resultado do teste de sensibilidade e da PCR em Tempo Real para genes que conferem resistência aos antimicrobianos e terapia antimicrobiana utilizada nos episódios de infecção de corrente sanguínea. ... 102 Tabela 16: Resultados das técnicas de PCR para 160 amostras dos frascos de hemocultura e 33 amostras de sangue total, identificação pela cultura e antibiograma pelo sistema automatizado, PCR em Tempo Real para os genes estudados. ... 175
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição das doenças hematológica de base. ... 63 Figura 2 - Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema automatizado (Phoenix®). ... 64 Figura 3 - Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema automatizado (Phoenix®). ... 65 Figura 4 - Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos A- blaTEM; B - vanA; C - vanB; D - blaCTX; E- blaSHV; F - mecA; G - blaKPC; H- blaIMP; I- blaVIM; J- blaSPM. ... 76
Figura 5 - Curva ROC para genes estudados espécie especifico, fungo 18S rRNA e 16S rDNA Gram positivo e Gram negativo. ... 77
xiv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Cuture Collection
CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute Ct – Ciclo do threshold
CVC – Cateter Venoso Central
Cutoff – Ponto de Corte
DNA - Ácido desoxirribonucléico E – Eficiência
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético ESL - Extended Spectrum -Lactamase
FFP – Fração Falso Positivo FVP – Fração Verdadeiro Positivo GN – Gram Negativo
GP – Gram Positivo HSP – Hospital São Paulo
ICS – Infecção de Corrente Sanguínea
IOP/GRAACC – Instituto de Oncologia Pediátrica IS - Insertion Sequence
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
xv LH – Linfoma Hodgkin
LMA – Leucemia Mielóide Aguda LNH – Linfoma Não Hodgkin LoB – Limite do Branco LoD – Limite de Detecção ML - Metalo--Lactamase MM – Mieloma Múltiplo
MRSA – Staphylococcus Resistente à Meticilina OMP - Outer Membrane Protein
PBP - Penicillin Binding Protein PCR - Polymerase Chain Reaction PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis RNA – Ácido Ribonucléico
ROC - Receiver Operating Characteristic
SCCmec - Staphylococcal Cassette Chromosome SD – Desvio Padrão
SCoN – Staphylococcus coagulase negativo
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBE - Tris-Borato-EDTA
TCTH – Transplante de Células-tronco Hematopoiética Tm – Temperatura de melting
TMO – Transplante de Medula Óssea TSB - Tryptone Soy Broth
xvi UFC - Unidade Formadora de Colônia
UTI - Unidade de Terapia Intensiva UV – Ultravioleta
VPP – Valor Preditivo Positivo VPN – Valor Preditivo Negativo
xvii
RESUMO
A identificação rápida de patógenos e da resistência antimicrobiana em infecções da corrente sanguínea (ICS) diminui a morbidade e mortalidade, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Este estudo foi desenhado para detectar 17 patógenos e 10 genes de resistência a antimicrobianos direto de frascos de hemocultura e sangue periférico pela reação em cadeia da polimerase em Tempo Real. Métodos: O limite de detecção (LoD) e limite de corte (“cutoff”) foram realizados de acordo com “Clinical and Laboratory
Standards Institute” (CLSI). A sensibilidade e a especificidade clínica foram
calculadas pela curva “relative operating characteristic” (ROC). Um total de 160 frascos de hemocultura e 33 sangue periférico de paciente de transplante de células-tronco hematopoiética (TCTH) foram triadas por sondas Gram especificas por PCR em Tempo Real. Dezessete sequencias gênero específico foram avaliadas utilizando sondas TaqMan e para os genes de resistência
blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA foi
utilizado o método com SYBR Green. Resultados: Os ensaios de PCR em Tempo Real foram capazes de detectar os genes alvo nas diluições correspondente 15 a 1,5 UFC por reação. Os menores valores de Ct do LoD foram apresentados pelos microrganismos Staphylococcus coagulase negativo (SCoN), Stenotrophomonas maltophilia e Escherichia coli, 30,9; 31,6 e 32,6 respectivamente. A área sob a curva ROC mostrou um desempenho satisfatório acima de 0,70 para a maioria dos genes estudados. A sensibilidade pela curva ROC foi superior a 80% para os genes blaKPC e 16S rDNA Gram positivos, e
abaixo de 60% para blaSHV, blaTEM e vanB. Vinte e quatro das 33 amostras
positivas foram concordantes entre hemocultura e qPCR. A identificação de patógenos foi discordante em treze amostras. O gene mecA foi detectado em 12 dos 15 SCoN e 4 Enterococcus spp. foram positivos para o gene vanA. Foram
xviii detectados duas amostras com o gene blaCTX e três blaSHV por PCR em Tempo
Real. Os genes para metalo-β-lactamase e blaKPC e não foram detectados. Cinco
espécies de fungos foram identificados apenas por PCR em Tempo Real. O tratamento empírico considerando os resultados dos testes fenotípicos foi inadequado em 66,6 % dos casos de ICS, 33,3% mantendo-se inadequados após o resultado da coloração de Gram, e 6,66% mantiveram-se inadequados após o resultado final da hemocultura com o antibiograma. Conclusão: A PCR em Tempo Real pode ser uma ferramenta complementar útil na identificação precoce de agentes patogênicos e genes de resistência a antimicrobianos na ICS em pacientes submetidos à TCTH.
1. INTRODUÇÃO
Uma das mais importantes funções do laboratório de microbiologia clínica é obter um diagnóstico microbiológico, geralmente, através da cultura de fluidos corporais e tecidos. A identificação correta é crucial para determinar o agente patogênico, a escolha e duração do antibiótico terapia, e os procedimentos adequados no controle da infecção (Woo et. al., 2008). A triagem para patógenos multirresistentes, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Enterococcus resistente à vancomicina (VRE), e patógenos Gram negativos multirresistentes são recomendados para o controle de infecção. Os isolados microbiológicos positivos devem ser todos submetidos aos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Já para as infecções fúngica, os testes de susceptibilidade ainda precisam ser clinicamente interpretados e correlacionados com desfechos clínicos (Freifeld et. al., 2011).
A acurácia da identificação é importante nas análises epidemiológicas, na determinação dos padrões de resistência aos antimicrobianos e para um antibióticoterapia adequada. Tradicionalmente, a identificação de bactérias nos laboratórios de microbiologia clínica é realizada com testes fenotípicos. No entanto, estes métodos apresentam algumas limitações. Primeiramente, os microrganismos com características bioquímicas, que não se enquadram nos padrões de qualquer gênero e espécies são ocasionalmente encontrados. Em segundo lugar, estes métodos não podem ser utilizados para microrganismos não cultiváveis. Em terceiro lugar, a identificação de alguns grupos específicos de bactérias, como anaeróbios e micobactérias, requerem equipamentos e expertise adicionais, que não estão disponíveis na maioria dos laboratórios de microbiologia clínica (Woo et. al., 2008).
A avaliação laboratorial para investigação das infecções em pacientes de TCTH incluem hemograma, exames bioquímicos (funções hepática e renal) e dois conjuntos de culturas de sangue. No entanto, vários marcadores inflamatórios foram propostos para diferenciar entre as causas infecciosas e não infecciosas de uma resposta inflamatória sistêmica, orientando assim, os episódios febris em pacientes com neutropenia (Sakr et. al., 2008). Durante a avaliação, é imprescindível dar devida atenção à identificação da fonte de sepsis, entretanto, a causa da infecção pode não ser sempre aparente (Freifeld,
et. al., 2011). Para o diagnóstico de ICS relacionada ao cateter venoso central
(CVC) nos pacientes submetidos à TCTH, além de um conjunto de culturas coletadas das veias periféricas, em seguida, a partir de cada lúmen do CVC coleta-se um conjunto de cultura. No entanto, embora não seja essencial, um tempo diferencial de positividade entre as culturas de sangue periférico e central de mais de duas horas é fortemente sugestivo de ICS relacionada ao cateter (Fätkenheuer et. al., 2003). As infecções de corrente sanguínea estão associadas com altas taxas de mortalidade variando de 20% a 70%. Especialmente, em pacientes pós-transplantados e pacientes com leucemia (pacientes neutropênicos) a taxa de mortalidade para sepsis e choque séptico varia de 28% a 50% (Angus et. al., 2001; Martin et. al., 2003).
As técnicas moleculares que detectam os ácidos nucleicos para a identificação de patógenos tornaram-se cada vez mais disponíveis. Estas técnicas são sensíveis na detecção do DNA bacteriano e fúngico no sangue periférico, mas não está claro, se isto indica microrganismos patogênicos viáveis que circulam na corrente sanguínea. Entre as técnicas moleculares mais promissores está a reação em cadeia da polimerase (PCR). No entanto, os médicos devem estar cientes do potencial de resultados falso positivo e falso
negativo, e do fato de que estes testes não substituem a avaliação clínica e microbiológica (Chen & Kontoyiannis, 2010).
Nas últimas décadas, as técnicas de biologia molecular e suas aplicações no diagnóstico de doenças infecciosas estabeleceu uma nova era na detecção e identificação de microrganismos. O uso disseminado da técnica de PCR e sequenciamento de DNA, do gene 16S rDNA, tem desempenhado um papel fundamental na correta identificação de isolados bacterianos, como também na descoberta de novas bactérias. Para a identificação de microrganismo regiões conservadas dos genomas microbianos, como regiões dos genes 16S-23S rRNA, são utilizadas como alvo nessas reações. Muitos protocolos foram desenvolvidos para identificar uma única espécie (Espy et. al., 2006) ou várias espécies, utilizando regiões conservadas dentro do genoma, tais como ensaios genéricos para detecção bacteriana e fúngica (Van Burik et. al., 1998). As técnicas de PCR baseadas na detecção de fluorescência automatizada de fragmentos amplificados por PCR em Tempo Real são geralmente mais robustas, menos trabalhosas e menos propensas à contaminação do que as técnicas de PCR convencional (Klouche & Schröder, 2008).
A principal vantagem da aplicação da técnica de PCR no diagnóstico microbiológico é devido a sua sensibilidade e capacidade de detectar o DNA do patógeno, apresentando a possibilidade de detecção de microrganismos fastidiosos, de crescimento lento, não cultiváveis ou de difícil detecção por métodos convencionais de microbiologia. Outra vantagem está na otimização dos resultados, reduzindo a liberação do mesmo para os clínicos (Speers, 2006). As hemoculturas levam em média 24 a 36 h após a coleta para positivar e a completa identificação do microrganismo e perfil de susceptibilidade normalmente não está disponível antes de 24 às 72h. O uso da PCR tem sido sugerido em diagnóstico molecular, pois além de ser uma técnica sensível
também diminui o tempo de liberação dos resultados quando comparado com o método fenotípico (Valones et. al., 2009).
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.
Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas
Na década de 1950 iniciou-se, com grande dificuldade, a história do transplante de medula óssea (TMO). Em 1957, Thomas et. al. realizaram infusões endovenosas de células da medula óssea de indivíduos normais em pacientes portadores de doença hematológica terminal submetidos à radioterapia e apenas uma paciente obteve recuperação medular transitória. Outros estudos também não obtiveram grandes resultados, o que causou um descontentamento com os transplantes nas décadas de 50 e 60. Em 1968, Gatti
et. al. realizaram com sucesso o primeiro TMO alogênico em uma criança
portadora de imunodeficiência (Thomas et. al., 2004; Cutler & Antin, 2005). O termo “transplante de medula óssea” (TMO) passa a ser substituído pelo termo transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH), devido ao desenvolvimento de novas fontes de células progenitoras para o transplante (Vogelsang et. al., 2005).
O Transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) é definido como a transferência das células, a partir de um individuo para outro, definido como TCTH alogênico. Ou o retorno de células previamente coletadas para o mesmo individuo após a manipulação das células e ou do destinatário, TCTH autólogo (Baron & Sandmaier, 2006; Huss et. al., 1996; Welniak, et. al., 2007). O TCTH alogênico é uma importante modalidade para melhorar ou curar uma grande variedade de doenças, incluindo leucemia, linfomas, doenças mieloproliferativas, síndromes mielodisplásicas, síndrome da insuficiência da medula óssea, imunodeficiências congênitas, deficiências enzimáticas e hemoglobinopatias (Giralt, 2007; Oliansky et. al., 2007; Dreger et. al., 2007; Witte et. al., 2007 e Davies & Guinan, 2007). No entanto, o TCTH está associado com uma
significante morbidade e mortalidade devido ao regime relacionado à toxicidade, infecção e enxerto versus doença do hospedeiro. O TCTH autólogo pode melhorar os resultados em doenças neoplásicas e doenças autoimunes, e continua a ser investigado como plataforma para a terapia gênica (Sadelain et.
al., 2004). Os regimes relacionados à toxicidade e as infecções contribuem para
morbidade e mortalidade associadas com TCTH autólogo, apesar de todos os avanços, a infecção é reportada como a causa primária da morte em 8% dos pacientes TCTH autólogos e 17 a 20% dos receptores de TCTH alogênico.
Atualmente, existe uma ampla disponibilidade de ferramentas para o diagnóstico das infecções permitindo assim o desenvolvimento de estratégias de vigilância para um melhor conhecimento da epidemiologia, fatores de risco e prognósticos de infecções adquiridas em centros de câncer nos últimos anos. Esta consciência epidemiológica é fundamental para definir estratégias de prevenção que pode ser adaptada para as várias categorias de pacientes com diferentes riscos de infecção, e escolher protocolos de tratamento que possam conter o fenômeno de resistência aos antimicrobianos (Girmenia et. al., 2011).
2.2.
Infecções de Corrente Sanguínea em TCTH
Infecção de Corrente Sanguínea (ICS) é causada pela presença de bactérias ou fungos em uma ou mais amostras de hemoculturas associada a um quadro clínico compatível com sepse (Bone et. al., 1992).
A ICS é a complicação infecciosa mais comum em TCTH (Poutsiaka et.
al., 2007). Como consequência da imunodeficiência que acompanha o TCTH, as
complicações infecciosas persistem como uma importante causa de morbidade e mortalidade, embora existam todas as melhorias nos cuidados de manutenção dos pacientes. A recuperação imunológica após o transplante e o os agentes
infecciosos mais relevantes orientam a instituição para a profilaxia antibacteriana, antiviral e antifúngica nesta população (Walter & Bowden, 1995). A incidência de infecção em transplantados é determinada pela interação entre a exposição a agentes infecciosos e a terapia imunossupressora. Esta varia devido a inúmeros fatores, a quantidade de medicamento imunossupressor usado, a necessidade do uso de terapia adicional contra rejeição e complicações pós-cirúrgicas (Patel & Paya, 1997).
Em 1966, Bodey e colaboradores começa a incorporar o conceito de neutropenia como risco para infecção, demonstrando que o risco de complicações infecciosas em pacientes portadores de leucemia, submetidos à quimioterapia, está relacionado diretamente ao grau e à duração da neutropenia. O aumento de infecções graves ocorre à medida que o número de granulócitos está abaixo de 1000 células/mm3, chegando a 12% de incidência; e 28% de incidência quando este número está abaixo de 100 células/mm3. A incidência de infecção chegou a 100% quando a neutropenia foi mantida por cinco semanas ou mais (Bodey et. al., 1966).
A maioria dos pacientes submetidos à TCTH como outros pacientes neutropênicos apresentam febre como sinal indicativo de infecção. Em um estudo realizado por Quental e colaboradores no Hospital São Paulo, da Universidade Federal de São Paulo, entre janeiro de 2003 a dezembro de 2006 de 149 pacientes submetidos à TCTH, 39 desenvolveram 56 episódios de ICS. A incidência geral de ICS, ao longo dos quatro anos de seguimento, aumentou 340% (Quental et. al., 2006).
ICS é definida como o isolamento de bactérias, que não são normalmente conhecidas por colonizar a pele, tais como bacilos Gram negativos, ou patógenos, como S. aureus ou fungos, a partir de, pelo menos, uma cultura de sangue (Horan & Gaynes, 2004). Para as bactérias, que tipicamente colonizam a
pele, como Staphylococcus coagulase negativa, Propionibacterium spp.,
Streptococcus do grupo viridans e Corynebacterium não-Jk, são consideradas
ICS a positividade de duas hemoculturas consecutivas, ou duas hemoculturas positivas dentro de 72 horas, ou uma hemocultura positiva e uma positiva da ponta de cateter intravascular dentro de 72 horas (DesJardin et. al., 1999).
2.3.
Epidemiologia das Infecções em TCTH
Nas últimas décadas, a epidemiologia de isolados bacterianos nas infecções da corrente sanguínea em paciente neutropênico febris tem passado por constante mudança. A partir da evolução dos pacientes neutropênicos febris durante a década de 70, observou-se que os microrganismos mais prevalentes das infecções no início da década eram 70% compostos por Gram negativos (Viscoli et. al.,1994).
Durante os anos 1980 e 1990, os microrganismos Gram positivos, surgem demonstrando um aumento na prevalência de bactérias Gram positivas, provavelmente devido ao aumento do uso de cateteres venosos, que permitiu assim a colonização e a infecção pela microbiota da pele, como Staphylococcus spp., e o uso de profilaxia sistêmica por fluoroquinolonas, que facilitaram a entrada da flora intestinal (Viscoli et. al.,1994; Zinner, 1999; Wisplinghoff et. al., 2003). Outro fator envolvido é o uso de agentes quimioterápicos com maior ação citotóxica, o que leva a um dano extenso das mucosas e permite a translocação bacteriana de agentes como Streptococcus viridans e Enterococcus spp. (Picazo, 2004; Bodey et. al., 1966; Ramphal, 2004; Viscoli et. al., 2002; Pizzo, 1999).
No decorrer destas décadas, o panorama dos agentes etiológicos responsáveis pelas infecções modifica-se e passam a predominar as bactérias
Gram positivas como os principais agentes isolados nestes pacientes (Pizzo, 1984; Schimpff, 1985; Pizzo et. al., 1986; Rubin et. al., 1988).
Atualmente, os Staphylococcus coagulase negativo, continuam sendo o isolado mais comum em hemocultura. No entanto, tem sido observado em vários centros o surgimento de infecções por Enterobacteriaceae, principalmente
Escherichia coli e Klebsiella spp., e patógenos Gram negativos não
fermentadores, como Pseudomonas aeruginosa e S. maltophilia. Em particular, espécies Gram negativas resistentes aos antimicrobianos estão causando um número crescente de infecções em pacientes neutropênicos febris. As espécies de Klebsiella spp. e E. coli com aquisição de genes codificadores de enzimas β-lactamase de espectro ampliado (ESβL), frequentemente mostram uma ampla resistência a uma gama de β-lactâmicos. Esses produtores de ESβL são susceptíveis aos carbapenens, porém, o seu uso pode induzir a seleção de bactérias com padrões de resistência ainda maiores. Dessa forma, a utilização de carbapenens aumenta o risco de infecções por espécies de Klebsiella spp. e
P. aeruginosa produtoras de carbapenemases, que são resistentes aos
carbapenens e a outras classes de antibióticos. Este fenômeno pode representam um problema devastador, com a disseminação de infecções por espécies Gram negativas multirresistentes, considerando-se também que as drogas recentemente adicionadas ao arsenal antibacteriano são orientadas principalmente contra bactérias Gram positivas (Cattaneo et. al., 2008; Oliveira
et. al., 2007; Aubron et. al., 2005; Morris et. al., 2008; Weinstock et. al., 2007;
Wang et. al., 2011; Chong, et. al., 2011; Gudiol, et. al., 2011; Arnan, et. al., 2011; Gudiol, et. al., 2010; Trecarichi, et. al., 2009 e Trecarichi, et. al., 2011).
Um estudo realizado por Cordonnier e colaboradores (2003) relacionou os fatores de risco associados à infecção por cocos Gram positivos em pacientes neutropênicos febris e identificou que os fatores relacionam-se com terapias com
altas doses de citarabina, uso de inibidores de bomba de prótons, descontaminação do trato gastrintestinal com antibiótico colimicina e a presença de calafrios. Os autores concluíram que as infecções por cocos Gram positivos devem originar-se do trato gastrintestinal, e assim o uso de drogas que modificam o pH gástrico, favorece o crescimento e aumento do risco de translocação bacteriana no paciente com prévia alteração na integridade da mucosa.
A bacteremia por cocos Gram positivos, também foi correlacionada por outros autores com a colonização das mucosas e mucosite, e os principais patógenos são Staphylococcus coagulase negativo (SCoN) e Streptococcus
viridans (Paganini et. al., 2003; Bochud et. al., 1994; Costa et. al., 2006). A
mucosite é também descrita como fator de risco para ICS causadas por
Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em pacientes com câncer
(Kuehnert et. al., 1999).
Recentemente alguns centros observaram um aumento na proporção de bactérias Gram negativas como causadoras de ICS em pacientes neutropênicos, talvez pela suspensão da profilaxia por quinolonas ou pelo aparecimento de resistência aos antimicrobianos entre estes agentes (Collin et. al., 2001; Ramphal, 2004; Viscoli & Castagnola, 2002).
Um estudo prospectivo em um centro de câncer espanhol realizado em adultos durante o período de 2006-2009 mostrou que cerca de 50% das bacteremias eram causadas por bacilos Gram negativos e 14% deles eram bactérias multirresistente. O mecanismo de resistência mais frequente foi produção ESβL (45%), principalmente em E. coli, seguido de hiperprodução de cefalosporinase tipo AmpC (24%) (Gudiol et. al., 2011). Os pacientes com bacteremias por bacilos Gram negativos multirresistente receberam
antibióticoterapia inicial inadequada (69% versus 9%, p <0,001), e o tempo para terapia adequada (após 48 horas) foi maior neste grupo (Gudiol et. al., 2011).
Uma taxa muito elevada de bactérias Gram negativas resistentes isoladas em pacientes com doenças hematológicas malignas foi observada em um estudo italiano (Trecarichi et. al., 2009). Guidol e colaboradores observou que dos 62 episódios de bacteremia causadas por E. coli, a produção de ESBL e resistência às fluoroquinolonas foram 41,9% e 62,9%, respectivamente. A taxa global de mortalidade de 30 dias foi de 21%, e os preditores significativos de mortalidade foram para terapia antimicrobiana inicial inadequada, na infecção por isolados produtores de ESβL isolados e neutropenia prolongada (Gudiol et. al., 2011).
Um estudo prospectivo de infecções em centros italianos realizados em os pacientes adultos com diagnóstico de doenças hematológicas malignas iniciadas em 2009 mostrou que as bacteremias por P. aeruginosa foram 71% multirresistentes. Em particular, a percentagens de resistência aos carbapenens (Imipenem e meropenem), anti-pseudomonas cefalosporinas (Ceftazidima e cefepime), amicacina e ciprofloxacina foram 60%, 42%, 50% e 66%, respectivamente. Enquanto, que a percentagem de resistência à piperacilina foi de 24%. A mortalidade em até 30 dias após a primeira hemocultura positiva ocorreu em 40% das bacteremias por P. aeruginosa multirresistentes e em 9% dos não multirresistentes. Em uma análise multivariada, a terapia antibacteriana inicial inadequada foi independentemente associada com a mortalidade (p=0,006) (Trecarichi et. al., 2011).
Em um estudo realizado por Quental e colaboradores (2006) em um Hospital São Paulo, de julho de 2003 à de julho de 2005, foram observados 167 episódios de ICS em 107 pacientes. A maioria (67,3%) apresentou apenas um episódio de ICS. Sessenta e três (58,9%) pacientes pertenciam ao sexo
masculino. Em relação à doença hematológica de base, o diagnóstico mais prevalente foi Leucemia Mielóide Aguda (LMA), seguido de Mieloma Múltiplo (MM) e Linfoma não Hodgkin (LNH). Em 31 episódios (18,6%) os pacientes haviam sido submetidos ao TMO.
O estudo reportou que em 93 (55,7%) dos episódios de ICS os pacientes apresentavam neutropenia. Em 82% dos episódios de ICS os pacientes apresentaram febre ou hipotermia, e 70,7% mostrou sepse clinicamente comprovada. Leucocitose ou leucopenia estavam presentes em 68,3% dos episódios. A mortalidade após uma semana da última hemocultura positiva foi 31,8% (34 pacientes) e após 30 dias foi 59.8% (64 pacientes). A maior mortalidade foi relacionada à Pseudomonas spp. com 29 episódios, 13 (44,8%) foram a óbito em sete dias, sendo todos resistentes a carbapenens, e cinco foram a óbito em 30 dias (17%), sendo dois resistentes a carbapenens (Quental
et. al., 2006).
Um estudo clínico prospectivo e de vigilância microbiológica realizado no hospital do câncer do Rio de Janeiro avaliou pacientes pós TCTH em 859 episódios de ICS. A mortalidade geral foi de 25% e a idade média foi de 43 anos. Os doentes com neoplasias hematológicas malignas subjacentes foram responsáveis por 38,2% dos episódios. No total de 1039 microrganismos foram isolados 56% de bacilos Gram negativos, 32% de Gram positivos e 10% de fungos. Os microrganismos Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli foram produtoras de β-lactamase ESβL 37,8% e 8,9%, respectivamente. Altas taxas de resistência a ceftazidima foram detectados em Acinetobacter spp. (40%) e
Enterobacter spp. (51,2%). Os microrganismos E. coli, K. pneumoniae e P.
aeruginosa foram isoladas, mais frequentemente, em pacientes com
neutropenia. Os SCoN predominaram em 73,2% das ICS por Gram positivos. A resistência à oxacilina foi detectada em 18,7% dos Staphylococcus aureus e em
77,5% dos SCoN. Entre os isolados de Candida spp, 79% foram Candida não
albicans, principalmente Candida tropicalis e Candida parapsilosis. (Velasco et. al., 2004).
Em infecções fúngicas, especialmente aquelas causadas por espécies de
Candida spp. e Aspergillus spp., historicamente representam uma das principais
causas de morte em pacientes com câncer, especialmente após a quimioterapia intensiva e recebimento de TCTH (Maschmeyer, 2011; Pagano et. al., 2007; Pagano et. al., 2006). Estudos reportaram episódios de candidemia em 33% dos pacientes submetidos a cirurgias não transplante e 17% em doenças hematológicas malignas (9,8%) e em receptores de TCTH (2,9%). As Candida não-albicans representaram a grande maioria dos isolados, sendo que 72,6% dos isolados foram provenientes de pacientes com malignidades hematológicas, 77,6% em TCTH e 52,4% em tumores sólidos (Horn et. al., 2009; Neofytos et.
al., 2009). Outros estudos reportaram que os microrganismos mais frequentes
em infecções fúngicas em TCTH foram Aspergillus spp. causando na maioria a aspergilose invasiva (59%), seguido por Candida spp. (25%) e outros (14%) (Neofytos et. al., 2009).
2.4.
Diagnóstico Microbiológico
2.4.1. Hemoculturas
Atualmente a hemocultura é o "padrão ouro" no diagnóstico das ICS, estes métodos são baseados na detecção de microrganismos viáveis presentes no sangue. As hemoculturas, além de detectar agentes patogênicos viáveis, apresentam a vantagem de permitir a avaliação da susceptibilidade antimicrobiana, demonstrando um fator importante na terapia antimicrobiana adequada. (Leibovici et. al., 1998; Weinstein et. al. 1997).
Em 1970 ocorreu à introdução da automação da hemocultura no laboratório de microbiologia com o primeiro sistema semi-automatizado. E em 1990 estes sistemas foram aprimorados e, atualmente, as hemoculturas são realizadas com monitoramento contínuo ·por sistemas totalmente automatizados, que permitem a incubação ·das amostras de sangue na temperatura de 37º C. Esses instrumentos detectam o crescimento microbiano pela análise da libertação de CO2, usando sensores fluorescentes (BACTEC® 9240, Becton
Dickinson) ou sensores colorimétricos (BacT/Alert®; BioMérieux, França) ou, alternativamente, medindo as mudanças de pressão no espaço superior do frasco, gerada pelo consumo dos nutrientes e a produção de gases (VersaTREK®; TREK Sistemas de Diagnóstico).
Vários desenvolvimentos técnicos, incluindo o aprimoramento dos meios de cultura e a detecção automática de crescimento, melhoraram muito as performances de diagnóstico deste método de diagnóstico (Cockerill et. al., 2004; Weinstein, 1996). No entanto, vários fatores podem ainda reduzir a sensibilidade global de hemoculturas. O volume de sangue inoculado no frasco é um dos fatores mais importantes que influenciam no diagnostico (Tenney et. al., 1982). Vários estudos com adultos e em doentes pediátricos confirmaram que a taxa de isolamento de microrganismo a partir das hemoculturas aumentam com a quantidade de sangue inoculado (Bouza et. al., 2007; Cockerill et. al., 2004; Kaditis et. al., 1996). Outra variável importante é o tempo para incubar o frasco dentro do equipamento, o ideal é que sejam imediatamente colocadas no monitoramento contínuo para minimizar o tempo de detecção e reduzir o número de falsos negativos (Sautter et. al., 2006; Schwetz et. al., 2007). Uma limitação intrínseca as culturas automatizadas é a baixa sensibilidade para microrganismos fastidiosos e de crescimento lento como Bartonella spp.,
não cultiváveis como Rickettia spp., Coxiella burnetti, Chlamydophila
pneumoniae e Tropheryma whipplei são melhores diagnosticados por teste
imunológicos ou técnicas moleculares (Fenollar & Raoult, 2007).
A detecção do crescimento do microrganismo é feita após o sinal positivo indicado pelo equipamento, e então, é realizado diretamente do frasco a pesquisa do microrganismo por coloração utilizando o método de Gram. A seguir é realizada a semeadura em meios seletivos e enriquecedores para o isolamento do microrganismo permitindo, assim a identificação e realização dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos.
Atualmente, o potencial das técnicas moleculares baseadas na detecção dos ácidos nucleicos foi apenas parcialmente explorado na rotina do laboratório de microbiologia, principalmente quando comparada com a revolução que alterou radicalmente os laboratórios de virologia nas ultimas duas décadas. No entanto, vários estudos estão avaliando as metodologias moleculares no diagnostico das infecções de corrente sanguínea e sepse aplicados aos frascos de hemoculturas positivas (Mancini et. al., 2010).
2.4.2. Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos
A identificação de bactérias nos laboratórios de microbiologia clínica pode ser realizada manualmente ou através de métodos automatizados, que realizam testes fenotípicos, incluindo esfregaços de Gram e testes bioquímicos, considerando os requisitos da cultura e características de crescimento (Woo et.
Os métodos automatizados fornecem maior precisão nos resultados e proporcionam uma rapidez na identificação. Os sistemas automatizados mais utilizados são: Vitek®; Vitek-2® (BioMérieux, Hazelwood, MO); Walk-Away® (DADE, West Sacramento, CA); Phoenix® (Becton Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md).
O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos tem o objetivo da avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e definir o fenótipo de resistência. As amostras testadas são classificadas em sensíveis, intermediárias ou resistentes, empregando-se os limites de sensibilidade preconizados pelo “Clinical Laboratory Standards Intitute” (CLSI). A metodologia manual baseia-se na técnica de Kirby-Bauer de disco difusão, e os halos de inibição são interpretados de acordo com as recomendações vigentes do documento
“Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing” do CLSI. Outro
método, o Etest (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra), também pode ser utilizado para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano.
A maioria dos métodos automatizados que avaliam o perfil de sensibilidade baseia-se na técnica de microdiluição em caldo, na qual diversas concentrações de antimicrobianos são utilizadas para determinar a CIM. Estas concentrações são interpretadas pelos equipamentos de acordo com as recomendações vigentes do documento “Methods for dilution antimicrobial
susceptibility tests for bacteria that grow aerobically” do CLSI.
2.5.1. Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
A técnica de PCR tornou-se uma ferramenta indispensável nos diagnósticos moleculares após sua idealização pelo cientista Kerry Mullis em 1983. É surpreendente a rapidez com que os avanços tecnológicos baseados nessa metodologia desenvolveram após a sua automação, isolamento e purificação da enzima Taq DNA polimerase a partir da bactéria termofílica
Thermus aquaticus. Na área de diagnóstico por biologia molecular, a PCR
permitiu a detecção de genes alvos com inédita sensibilidade e facilidade. Sua aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas estabeleceu uma nova era na detecção e caracterização de microrganismos e passaram, no presente, a fazer parte da rotina de processamento de algumas amostras clínicas (Saiki et. al., 1988). Na pratica clinica, a PCR pode ser pelo método convencional ou em Tempo Real. Os reagentes utilizados na reação de amplificação do DNA são os iniciadores, dNTPs, enzima como a Taq DNA polimerase, MgCl2, uma solução
tampão e água, além do DNA extraído. Esta reação é composta por uma temperatura de desnaturação, uma de anelamento e uma de extensão do DNA, repetidas vezes (Konenam et. al., 2006).
Importantes avanços tecnológicos, como PCR em Tempo Real e espectrometria de massa, tem revolucionado o diagnóstico clínico. Em particular, o PCR em Tempo Real que tem permitido a técnica maior sensibilidade, robustez e menor contaminação, além da quantificação. Esta técnica combina a amplificação e a quantificação de uma sequência de DNA alvo por meio da detecção de fluorescência utilizando sondas específicas marcadas com fluoróforos, ou com base na determinação da temperatura de desnaturação de uma sequencia de DNA dupla fita (“melting temperature” - Tm) marcada com substância intercalante de DNA fluorescente (Klein, 2002; Kubista et. al., 2006). Os princípios aplicados para detecção de uma sequência alvo são baseados na
mensuração de fluorescência durante a reação por diferentes filtros que capturam a fluorescência conforme o comprimento de onda emitido. A fluorescência é proporcional à quantidade de produto amplificado em cada ciclo e o número de ciclos de amplificação necessários para obter uma determinada quantidade de DNA é registrado como ciclo do threshold (Mackay, 2004; Kubista
et. al., 2006).
Essa evolução tecnológica juntamente com o caráter indispensável da PCR em laboratórios moleculares levou a uma vasta expansão do número de aplicações clínicas. Atualmente, foi desenvolvida uma plataforma que utiliza a espectrometria de massa de produtos de PCR ionizados (incluindo produtos do gene 16S rDNA) que é capaz de integrar, no mesmo sistema, a identificação da espécie do microrganismo, genotipagem, detecção de genes de virulência e de resistência aos antimicrobianos (Ecker et. al., 2006).
Atualmente, a detecção de bactérias de interesse clínico pelos laboratórios de biologia molecular é realizada pela amplificação do gene 16S rDNA, codificador da subunidade menor do RNA ribossomal (rRNA). Este gene apresenta regiões altamente conservadas entre todas as espécies bacterianas e regiões altamente variáveis que permitem a diferenciação entre espécies (Van de Peer et. al., 1996). O gene 16S rDNA, geralmente apresenta nove regiões hipervariáveis, que demonstram diversidade filogenética entre as diferentes espécies bacterianas, a utilização de iniciadores denominados universais, complementares às regiões conservadas que flanqueiam as regiões variáveis do gene, são suficiente para identificação bacteriana em grande parte dos casos.
Análises posteriores, utilizando hibridização com sondas de DNA, restrição dos produtos de PCR por RFLP ou o sequenciamento direto dessas sequências permitem a identificação da espécie bacteriana.
2.5.2. Genes de Resistência aos Antimicrobianos
2.5.2.1. Gene mecA
Os antimicrobianos -lactâmicos agem através da inibição de enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do peptideoglicano, principal componente da parede celular das bactérias Gram positivas (Giesbrecht et. al., 1998). Estas enzimas catalisam a etapa final da síntese da parede celular e, por ser o sítio de ação das penicilinas, passaram a ser chamadas de proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs). Estas PBPs catalisam a reação de transpeptidação necessária para a união das cadeias de peptideoglicano, constituintes da parede celular bacteriana. O mecanismo de resistência ao -lactâmicos está associado à alteração do sítio de ação do mesmo pela produção de uma proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a (também denominada PBP2’).
Esta proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a, é codificada pelo gene mecA, que confere resistência à meticilina em S. aureus e em
Staphylococcus Coagulase Negativo (SCoN). O gene mecA faz parte de um
elemento genético móvel designado cassete estafilocócico do cromossomo mec (“staphylococcal cassette chromosome mec” - SCCmec), integrado ao cromossomo de S. aureus e localizado próximo à sua origem de replicação. (Katayama et. al., 2000). O SCCmec apresenta o complexo do gene mec, que codifica resistência à meticilina, e o complexo do gene ccr (do inglês “cassette chromosome recombinase”), que codifica recombinases responsáveis pela sua mobilidade. Além disso, apresenta uma região denominada J (derivada do termo inglês “junkyard”) que compõe o restante do material genético do complexo SCCmec. Esta região é de grande importância para auxiliar na classificação dos diferentes tipos de SCCmec, atualmente classificados em 11 tipos (Turlej et. al., 2011).
O complexo do gene mecA é composto do gene propriamente dito e de seus genes regulatórios mecI e mecR1, localizados na região posterior ao promotor do gene mecA. O gene mecI codifica uma proteína que se liga ao DNA e reprime a transcrição do gene mecA, enquanto que o gene mecR1 codifica uma proteína que promove a transcrição do gene mecA na presença de -lactâmicos (Sharma et. al., 1998). São conhecidas quatro classes deste complexo, nomeadas de A a D, que divergem entre si de acordo com a presença de determinadas seqüências de inserção (seqüências de DNA envolvidas com a mobilização de informação genética, de função similar aos plasmídeos) (Katayama et. al., 2001).
Diversos autores relataram alta incidência de infecção de corrente sanguínea por Staphylococcus spp. resistentes à meticilina. (Linares et. al., 2009; Bert et. al., 2010). Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) realizado com 3.907 amostras de bactérias Gram positivas coletadas de centros médicos no mostrou que S.
aureus foi o microrganismos mais prevalente em infecções de corrente
sanguínea seguido por SCoN. Neste mesmo estudo, 31% dos isolados de S.
aureus e 80% dos SCoN apresentaram resistência a meticilina (Gales et. al.,
2009).
2.5.2.2. Genes vanA e vanB
Os antimicrobianos glicopeptídeos (vancomicina) agem no metabolismo de construção da parede celular bacteriana, através da ligação da porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano, principal componente estrutural da parede celular das bactérias Gram positivas (Silveira et. al., 2006; Eggert et. al., 2001).
A resistência bacteriana à vancomicina ocorre pela produção de um dipeptídeo, com terminação D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac), precursor do peptidoglicano. Esse dipeptídio diminui em uma escala superior a 1000 vezes a afinidade da vancomicina com a camada de peptidoglicano, conferindo resistência a este antimicrobiano principalmente em Enterococcus faecium e E.
faecalis (McComas et. al., 2003; Silveira et. al., 2006).
O gene vanA é mediado pelo transposon Tn1546, localizado em plasmídeo ou cromossomo da célula bacteriana. O transposon Tn1546 codifica nove polipeptídeos que atuam em conjunto na conferência da resistência a vancomicina. Estes polipeptídeos podem ser distribuídos em quatro grupos funcionais: Transposição, Regulação, Resistência e Proteínas acessórias (não essenciais).
São descritos sete fenótipos de resistência aos glicopeptídios, A,B,C,D,E,G e L, e os genes mais prevalentes, vanA e vanB estão descritos em espécies E. faecalis e E. faecium, os enterococos com fenótipo vanA apresentam alto grau de resistência a vancomicina e teicoplanina, com resistência induzível à presença de glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina, avorpacina, ristocetina) e por agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e polimixina B. O fenótipo VanB apresenta altos níveis de resistência à vancomicina enquanto a sensibilidade a teicoplanina é mantida. Ambos os genes podem ser encontrados em plasmídeos ou no cromossomo bacteriano e ser transferidos entre espécies enterocócicas (Cetinkaya et. al., 2000).
O surgimento dos primeiros isolados de enterococos resistentes à vancomicina e sua disseminação no ambiente hospitalar contribuiu para a busca de novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et. al., 2006). Em infecções de corrente sanguínea, dentre os Gram
positivos, as espécies de Enterococcus spp. estão entre os microrganismos mais isolados em ICS (Erdem et. al., 2009). No Brasil Gales e colaboradores, em um estudo multicêntrico em 2008, reportaram os Enterococcus spp. como a oitavo espécies mais encontradas, sendo o terceiro entre os Gram positivos, com resistência a vancomicina em 7,7% dos isolados (Gales et. al., 2009).
2.5.2.3. Produção de
-Lactamases
Os antimicrobianos -lactâmicos interferem na parede celular de Gram negativos e são frequentemente os mais utilizados no tratamento das infecções bacterianas. A ampla utilização, principalmente, das cefalosporinas de segunda e terceira gerações nos tratamento de infecções causadas por enterobactérias foi acompanhada pelo surgimento e disseminação de cepas bacterianas resistentes produtoras de enzimas do tipo ESβL (Tumbarello et. al., 2006).
As β-lactamases são um grupo de enzimas capazes de inativar antimicrobianos β-lactâmicos, por hidrolisarem a ligação amida do β-lactâmicos, causando a destruição irreversível do antimicrobiano (Livermore, 1995). A atividade enzimática é variável de acordo com o tipo, a quantidade de β-lactamase produzida e os diversos substratos β-lactâmicos existentes. Estas enzimas são capazes de hidrolisar as penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens, e a interação entre estas enzimas e seus substratos resulta em compostos inativos que permitem a sobrevivência da célula bacteriana (Bush, 2001). A quantidade de enzima produzida, a habilidade da enzima em hidrolisar o antimicrobiano e a velocidade com que o -lactâmico penetra pela membrana celular externa são alguns fatores que podem influenciar na capacidade da β-lactamase em conferir resistência (Livermore, 1991).
As β-lactamases constituem um grupo heterogêneo de enzimas produzidas por inúmeras espécies bacterianas, tanto positivas quanto Gram-negativas, porém com diversidades estruturais e localizações diferentes. Nas bactérias Gram-positivas, as β-lactamases são secretadas para o meio extracelular, dessa forma são menos ativas que as β-lactamases produzidas pelas bactérias Gram-negativas. Nesses microrganismos, as β-lactamases estão presentes no espaço periplásmico, podendo assim alcançar maiores concentrações e agirem de uma maneira mais eficaz sobre os antimicrobianos β-lactâmicos (Livermore, 1993).
A codificação para a produção das -lactamases pode ser cromossômica ou mediada por plasmídios e transposons, podendo ser induzida tanto pela presença de -lactâmicos, como de precursores de parede celular no meio extracelular (Livermore, 1991; Livermore, 1993).
Devido à grande diversidade de tipos de β-lactamases, inúmeras tentativas de estabelecer um sistema de classificação para estas enzimas foram propostos ao longo dos anos. Atualmente, dois esquemas de classificações têm sido considerados como de maior importância. A classificação de Ambler, desenvolvida em 1980, foi baseada nas sequências de nucleotídeos e aminoácidos das enzimas e somente quatro classes moleculares de β-lactamases foram descritas: A) β-β-lactamases de espetro ampliado (ESβLs), penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases; C) cefalosporinases cromossomais; e D) oxacilinases (Ambler, 1980). Em 1995, Bush, Jacoby e Medeiros propuseram um esquema baseado nas propriedades bioquímicas, estrutura molecular e sequencia nucleotídica das enzimas, combinando as características estruturais e funcionais das -lactamases, classificando-as em grupos funcionais (Bush et. al. 1995).
