A infecção de corrente sanguínea é a complicação infecciosa mais frequente em transplantado de célula tronco hematopoiética. Esta complicação é decorrente da imunodeficiência que os acompanha após o transplante (Poutsiaka et. al., 2007). Vários estudos ressaltam que as ICS continuam sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes transplantados, principalmente, naqueles afetados por neoplasias hematológicas (Maschmeyer
et. al., 2008).
Atualmente, a hemocultura ainda é o diagnóstico padrão para a identificação microbiológica de patógenos na corrente sanguínea (Mylotte & Tayara, 2000). A detecção precoce do patógeno causador é crucial para o tratamento antimicrobiano adequado, principalmente em casos de pacientes transplantados favorecendo uma maior chance de sobrevida e sucesso pós-transplante (Maschmeyer et. al., 2011).
A implantação de métodos moleculares resultou em um novo conjunto de métodos rápidos para o diagnóstico de ICS. Estes métodos são mais sensíveis e aumentam o número de casos com caracterização microbiológica laboratorial positiva, além de permitir uma redução no tempo de liberação de resultado (Engel et. al., 2007).
A técnica da PCR estabeleceu uma nova era na identificação de microrganismos diretos de amostras clínicas. Diversos protocolos de PCR baseados na amplificação do gene 16S rDNA tem sido utilizados para detecção de DNA bacteriano diretamente de amostras clínicas coletadas de diferentes sítios infecciosos (Klausegger et. al., 1999; Shang et. al., 2001; Klaschik et. al., 2002b; Wellinghausen et. al., 2004; Shigemura et. al., 2005; Yang et. al., 2008;
Wu et. al., 2008; Ohlin et. al., 2008). Além disso, a técnica de PCR também tem sido bastante utilizada na detecção de genes de resistência, incluindo amostras de corrente sanguínea. Desta forma, a detecção precoce tanto do microrganismo quanto do gene de resistência pode contribuir para a adequação do tratamento antimicrobiano, proporcionando assim, uma diminuição na morbi/mortalidade (Ferraresso & Berardineli, 2005).
Os objetivos deste estudo foram: o desenvolvimento de protocolos para detecção, ausência e presença, dos microrganismos utilizando PCR em Tempo Real multiplex na triagem para diferenciação entre patógenos Gram positivos e Gram negativos; detecção de genes por PCR em Tempo Real com único alvo, para genes espécie-especificos, genes de resistência à antimicrobianos, e a detecção de fungos e leveduras. As reações de amplificação dos genes por PCR em Tempo Real foram realizadas diretamente em amostras de sangue coletadas em tubos com EDTA K2 gel e em frascos de hemocultura automatizado (BACTEC®).
A mais importante característica que pode ser ressaltada na padronização da PCR em Tempo Real foi o tempo total para obter o resultado final. Considerando a extração de DNA diretamente de amostras clínicas de sangue periférico coletados em EDTA K2 gel, a reação de amplificação TaqMan para diferenciar Gram positivo e Gram negativo, seguida da reação para detectar genes de resistências, direcionados conforme os resultados da PCR, e por ultimo, as análises dos resultados, obteve tempo total de 8 horas. Comparado com outras ferramentas de diagnóstico baseados em PCR, a metodologia
TaqMan Multiplex PCR não necessitou de análises posteriores, como restrição
de produtos por RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”), etapas de hibridização com sondas de DNA e sequenciamento dos produtos amplificados para identificação das espécies bacterianas (Shang et. al., 2001; Wellinghausen
et. al., 2004; Klaschik et. al., 2002b). No entanto, a PCR em Tempo Real SYBR Green para a detecção dos genes de resistência necessitou de um tempo maior,
já que o fluoróforo aplicado nesta técnica utilizou uma curva de dissociação para analisar a temperatura de melting (Klaschik et. al., 2004).
As temperaturas de melting (Tabela 4) encontradas neste estudo para os genes de resistência aos antimicrobianos mostraram boa especificidade. O Tm médios para os genes de resistência em Gram positivos foram de 71,92; 74,41 e 85,48 para mecA, vanB e vanA, respectivamente. E para os Gram negativos, apenas os genes blaKPC e blaSHV, obtiveram Tm próximos, 91,31 e 91,67; respectivamente. Os controles positivos utilizados na padronização obtiveram um desvio padrão máximo de 0,30 para os genes estudados. Além disso, a determinação dos Tm de cada produto amplificado após a diferenciação pela análise da curva de dissociação mostrou picos altos permitindo a diferenciação entre as várias sequencias de DNA. Estudos mostraram uma melhoria na especificidade de detecção de genes quando os produtos amplificados foram diferenciados por Tm (Klaschik et. al., 2004; Wellinghausen et. al., 2004).
As especificidades dos nossos ensaios testados com vários microrganismos (Tabelas 1 e 6) não detectaram reação cruzada entre os DNA extraídos de amostras controles positivas. Entretanto, algumas reações mostraram sinais de fluorescência nos controles negativos para os genes 16S rDNA e o uidA, que identifica E. coli. Outros estudos reportaram que nas técnicas de PCR utilizando iniciadores universais, como 16S rDNA, ocorreu a detecção de DNA entre 500 e 1.000 cópias bacteriana por reação. Este limite de fundo, geralmente, foi detectado pela presença de DNA contaminante de E. coli nos reagentes não descontaminados.
A descontaminação dos reagentes com o uso de DNAse I foi utilizados em alguns estudos e mostraram efeitos inibitórios nas etapas de amplificação (Corless et. al., 2000; Klaschik et. al., 2002a; Silkie et. al., 2008). A presença dos restos de bactérias contaminantes pode prejudicar sensibilidade e especificidade analítica dos ensaios de PCR em Tempo Real (Meier et. al., 1993; Klaschik et.
al., 2002a). Quando a técnica de PCR em Tempo Real é utilizada para a
detecção de patógenos em amostras clínicas com pequena quantidade de DNA a presença de sinal positivo para os controles negativos pode dificultar a interpretação dos resultados das amostras positivas (Klaschik et. al., 2002a).
Desta forma, para a identificação dos principais patógenos foram selecionadas regiões alvos conservadas nos DNA de cada microrganismo e, portanto, mais adequada para diferenciação de espécies. Cada microrganismo foi diferenciado por sequências alvos bem descritas por vários autores e os sinais de fluorescência não foram detectados nos demais genes alvos (Desjardin
et. al., 1998; Luong et. al., 2011; Hue et. al., 1999; Guiver et. al., 2001).
Na detecção de patógenos por PCR em Tempo Real com abordagem qualitativa, presença/ausência, tem grande utilização definir o ciclo de corte (Ct
“cutoff”), número do ciclo do PCR (Burns &Valdivia, 2008). A definição de um Ct
de corte inadequado pode levar a erros de interpretação dos resultados da PCR em Tempo Real e gerar com sérias consequências (Larianov et. al., 2005). No presente estudo foram estabelecidos o Ct do LoD e Ct corte (“cutoff”) para todos
os genes estudados seguindo as recomendações do documento EP17-A (CLSI, 2004).
O limite de detecção de Unidade Formadora de Colônia (UFC) por reação para os respectivos genes em estudo mostrou o teste muito sensível, sendo possível a detecção dos genes na presença de 15 a 1,5 UFC por reação (Tabela
5), porém quando determinado o Ct “cutoff” e o LoD este limite aumentou a UFC
por reação para a maioria dos genes avaliados (Tabela 8). Outros autores encontraram uma sensibilidade semelhante de 10 UFC/reação (Loonen et. al., 2011). Para E. coli e Klebsiella pneumoniae em frascos de cultura de sangue foram encontrados uma sensibilidade de 10 UFC/reação (Gerbet et. al., 2008 e Kurupati et. al., 2004).
Alguns estudos relataram que a maioria dos episódios de bacteremia clinicamente significativos em adulto realizados por hemocultura quantitativa foi caracterizada por um numero baixo de bactérias circulando, 54% das hemoculturas de pacientes com endocardite obtiveram 1 a 30 UFC/mL de sangue. Em crianças, a magnitude da bacteremia, geralmente, foi inversamente proporcional à idade da criança (Werner et. al., 2008). Outro autor mostrou que em 73% dos pacientes com bacteremia por Gram negativos as hemoculturas tiveram menor que 10 UFC/mL de sangue (Kreger et. al., 1980). Dessa forma, a sensibilidade analítica em UFC/reação encontrada no nosso estudo limita a capacidade de diagnóstico de bacteremia nos pacientes se comparados com a sensibilidade teórica de um UFC/frasco de hemocultura quando inoculado 10 mL de sangue periférico.
Entretanto, a hemocultura convencional, geralmente, necessita de um período de 1 a 3 dias para fornecer resultados de identificação das espécies e o antibiograma. E os resultados de sensibilidade analítica dos PCR em Tempo Real, até o presente momento, não podem substituir a hemocultura convencional, porém o tempo de liberação em 8 horas do PCR em Tempo Real para os genes em estudo pode proporcionar uma valiosa informação adicional aos médicos para um tratamento mais rápido. Alguns autores reportaram que a utilização de testes moleculares para a detecção precoce de microrganismo em corrente sanguínea e a detecção de genes de resistência ocasionou em
contribuição para a adequação do tratamento antimicrobiano diminuindo a morbi/mortalidade (Ferraresso & Berardineli, 2005).
A eficiência da reação de PCR em Tempo Real utilizando a metodologia de TaqMan Multiplex PCR em Tempo Real foi menor quando comparadas com a reação com amplificação de único alvo para PCR em Tempo Real TaqMan na detecção dos genes espécie-especificos. Outros autores também encontraram o mesmo resultado utilizando sondas para amplificação de dois alvos simultaneamente (Exner & Lewinski, 2002; Hayden, 2004; Mothershed & Whitney, 2006). A eficiência das reações de SYBR Green para os genes blaTEM,
blaSHV, blaCTX-M e vanB foram menores em relação aos demais genes, provavelmente, pelo tamanho dos produtos amplificados, 700 a 1000 pb. Alguns estudos relatam que o tamanho dos produtos pode interferir na eficiência e sensibilidade dos testes de PCR (Dorak, 2006).
No presente estudo, a prevalência de bactérias foi de 30,3% para Gram negativas e de 69,7% Gram positivas (Figuras 3 e 2). Em um recente estudo descritivo realizado no Hospital São Paulo por Goto e colaborados (2007), a ICS por Gram negativos foi de 32,9% e a mortalidade foi de 41% em sete dias quando causada por BGN multirresistente e 8,7% por outros agentes. A identificação precoce destes microrganismos para o sucesso terapêutico dos pacientes submetidos à TCTH e pacientes com doenças hematológicas submetidas à quimioterapia torna-se de extrema relevância.
Observamos que a maior prevalência nas espécies de Gram positivas foi o gênero Staphylococcus (Figura 2). Dentre este, houve o predomínio de SCoN em relação a S. aureus. Nos SCoN foram detectadas altas taxas de resistência à oxacilina pelo sistema automatizado Phoenix®. Gales e
colaboradores relataram em um estudo resultados semelhantes com prevalência de SCoN com alta resistência à meticilina (Gales et. al., 2009).
No presente estudo houve 26% dos casos de ICS por enterococos, sendo 66,6% (4/6) VRE, com presença do gene vanA. Timmers e colaboradores (2002) relataram que este gênero é comumente isolado em pacientes transplantados e a transmissão nosocomial de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) ocorre, frequentemente, em pacientes de hematológicos. Um estudo realizado em pacientes com câncer mostrou que a colonização por VRE estava presente em 93% dos pacientes que apresentavam o microrganismo E.
faecium e em 67% dos pacientes colonizados por E. faecalis (Ghanem et. al,
2007). Rocchetti reportou em seu estudo a presença de Enterococcus spp em 8,3% dos casos de ICS (Rocchetti, 2011).
O número de ICS causadas por bactéria produtoras de ESβL apresenta uma tendência crescente que expresa um impacto significativo sobre as taxas de mortalidade e os custos hospitalares (Tumbarello et. al., 2006). Encontramos nas espécies Gram negativas a prevalência de E. cloacae (Figura 3) com 100% de detecção de ESβL pelo sistema automatizado Phoenix®.
Na avaliação da concordância entre a identificação pelo sistema automatizado Phoenix® e PCR em Tempo Real nas amostras dos frascos BACTEC® foram encontradas 16 amostras divergentes (Tabela 10). Estas amostras foram detectadas e identificadas pelos testes fenotípicos, porém não foram detectadas por PCR em Tempo Real. Este fato pode ser resultante da baixa eficiência da reação multiplex com as sondas Gram positiva e Gram negativa, uma vez que, destas 16 amostras, nove foram PCR em Tempo Real positivas para os genes espécie-especificos.
Observamos que na comparação entre PCR em Tempo Real utilizando as sondas espécie-especificas e sondas para Gram positivo e Gram negativo (Tabela 10), a metodologia com detecção com único alvo foi maior em relação à detecção pela metodologia de TaqMan Multiplex PCR, provavelmente isso ocorreu devido à amplificação simultânea de sondas para dois alvos, já que reações multiplex apresentam menor sensibilidade de detecção quando comparadas a reações com amplificação de um único alvo (Exner & Lewinski, 2002; Hayden et. al., 2004; Mothershed & Whitney, 2006).
A divergência encontrada entre a identificação por testes fenotípicos realizados no Phoenix® e PCR em Tempo Real utilizando os iniciadores para genes espécie-especificos foi de sete amostras. Estas amostras foram detectadas fenotipicamente, porém apresentaram resultados negativos para o PCR em Tempo Real (Tabela 10). Alguns autores atribuem este fato a presença de substâncias como proteína heme, IgG, sódio polianetolsulfonato e componentes do sangue presentes nos frascos BACTEC® (Al-Soud & Radstrom 2001; Engel et. al., 2007). Isso pode explicar uma possível queda da eficiência de amplificação da PCR em Tempo Real observada nas amostras com identificação pelos testes fenotípicos e não detectadas por PCR em Tempo Real.
Resultados semelhantes também foram relatados por Varani e colaboradores (2009), que encontraram 16 amostras de frascos de hemocultura positivos (BacT/Alert 3D system® (BioMerieux Italia, Rome, Italy)) com resultado negativo pelo método de PCR em Tempo Real SeptiFast. Os microrganismos discordantes no estudo de Varani foram SCoN, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa,
S. maltophilia e E. cloacae. Kellog e colaboradores (2000) encontraram
divergências na identificação para S. aureus e Staphylococcus coagulase negativo que foram detectados na hemocultura fenotipicamente e apresentaram PCR em Tempo Real negativa.
Alguns estudos observaram que os frascos de hemocultura podem ter resultados negativos devido ao volume insuficiente de sangue coletado para a detecção de bactérias, e também o baixo nível de bacteremia (<10 UFC / mL) foi muito mais comum (até 68%) em pacientes pediátricos do que se acreditava anteriormente. Kellog e colaboradores (2000) concluíram que é necessário coletar até 4,5% do volume de sangue do paciente (cerca de 4 ml / kg) em pelo menos duas amostras de sangue para detectar baixas concentrações de patógenos.
Na análise da concordância entre PCR em Tempo Real com sondas GN/GP e testes fenotípicos foram detectadas nove amostras pela PCR em Tempo Real que apresentaram resultados negativos pelo sistema BACTEC® (Tabela 10). A divergência encontrada foi PCR em Tempo Real positiva para a sonda Gram negativa nas amostras 57 e 26 coletas do mesmo paciente (Tabela 10), estas amostras foram coletadas com uma diferença de dois dias uma da outra. A PCR em Tempo Real com iniciadores para espécie-especificas identificou o microrganismo K. pneumoniae nestas mesmas amostras. Depois de 19 dias este paciente apresentou cultura com K. pneumoniae, porém, este frasco de hemocultura não foi enviado ao LEMC e não foi avaliado pela PCR em Tempo Real. Assim, a alta concentração de DNA detectada sugere que a contaminação nestas amostras parece menos provável (Tabela 16).
Outra discordância entre os testes fenotípicos e PCR em Tempo Real encontrada foi a PCR em Tempo Real detectada pelas sondas Gram positivas que o sistema BACTEC® não detectou. As amostras 421, 423 e 5 EDTA K2 GEL (Tabela 12) foram coletadas no mesmo dia e apresentaram Ct de 36,5; 34,5 e 33,6; respectivamente. Este paciente apresentou dez dias antes cultura positiva para S. epidermidis, porém, esta amostra não foi encaminhada ao LEMC e não foi avaliada pela PCR. A PCR em Tempo Real com os iniciadores
espécie-especificos que detectou o microrganismo SCoN foram consideradas negativas, mesmo apresentando Ct detectado (Tabela 16). Após o cálculo do Ct do LoD para SCoN estas amostras foram negativas pela PCR em Tempo Real. Portanto, a baixa concentração de DNA encontrada nestas amostras sugere a detecção de DNA de bactérias mortas sugerindo contaminação.
Na avaliação da concordância a amostra 45 apresentou PCR positiva tanto para sonda Gram positiva quanto para sonda Gram negativa, com Ct que indicam alta concentração de DNA (Tabela 16). A hemocultura pelo sistema BACTEC® foi negativa. Este paciente depois de 16 dias apresentou hemocultura positiva para SCoN, porém, o frasco não foi encaminhado ao LEMC e, portanto, não foi avaliada por PCR. A concentração de DNA encontrada para Gram positivo sugere que não ocorreu contaminação, no entanto, para Gram negativo sugere contaminação. Já que não houve crescimento de nenhum microrganismo Gram negativo nas culturas anteriores ou posteriores a data da amostra analisada. A PCR com sondas espécie-especificas para SCoN obteve o Ct de nove.
Outra amostra (560) apresentou PCR positiva para ambas as sondas GP/GN e o sistema automatizado Phoenix® identificou apenas o Gram negativo,
Citrobacter freundii. A amostra 568 do mesmo paciente e coletada na mesma
data da outra amostra, já apresentou concordância entre o teste fenotípico Phoenix® e PCR em Tempo Real para detectar Gram positivo. Desta forma, a sonda Gram positiva detectada na amostra 560 sugere pouco provável que seja contaminação por GP. Uma vez que o sistema automatizado Phoenix® identificou SCoN na amostra 568 e o Ct detectado de 21,6 sugere alta concentração de DNA. A PCR espécie-especifica detectou Ct oito para SCoN na amostra 560 e Ct 9,33 para amostra 568 (Tabela 16).
As amostras 327, 337 e 340 coletadas do mesmo paciente obtiveram resultados positivos para sonda Gram positiva e foram concordantes com a identificação de E. faecium pelo sistema automatizado Phoenix®. A amostra 328 coletada três dias depois apresentou PCR positiva para sonda Gram positiva e identificação negativa pelo sistema automatizado Phoenix®. Portanto, a baixa
concentração de DNA detectado com Ct 35,5 sugere ser contaminação. Outras amostras da mesma data tiveram resultados negativos para PCR (Tabela 10 e 16).
Resultados semelhantes aos encontrados no nosso estudo também foram relatados por Lehmann e colaboradores (2008), que avaliaram a aplicação da PCR em Tempo Real na detecção de patógenos no sangue pelo Kit SeptiFast LightCycler® (Roche-Molecular Diagnosis) e comparou os resultados com os obtidos pelo BACTEC®. Lehmann e colaboradores (2008) detectaram 114 amostras pelo SeptiFast e 46 destas amostras foram negativas pelo sistema BACTEC®. Os resultados discordantes ocorreram tanto por algumas espécies identificadas pelo sistema BACTEC® não estarem presentes no kit SeptiFast® quanto podem ter sido consideradas contaminação na hemocultura. Em estudos, a taxa de amostras consideradas contaminadas por SCoN chega a ser de 26%, já que se trata de bactérias colonizantes da pele (Ikegaya et. al., 2010).
Uma questão importante é se estes patógenos adicionalmente detectados por PCR em Tempo Real em frascos de hemocultura são clinicamente relevantes ou se não são apenas contaminantes, sendo importante a discriminação entre colonização e contaminação, ou infecção verdadeira. Em um estudo realizado Dierkes e colaboradores (2009) a maioria dos patógenos detectados apenas por SeptiFast® também estiveram presentes em outras amostras do mesmo paciente, sugerindo uma relevância clínica. Os resultados encontrados por estes autores estão em concordância com outros estudos, onde
patógenos detectados adicionalmente por PCR estavam presentes em outras amostras do mesmo paciente (Mancini et. al., 2008; Louie et. al., 2008).
Apesar de todas as divergências encontradas no nosso estudo a acurácia clínica mostrou um desempenho satisfatório para a maioria dos genes avaliados com uma área sob a curva ROC acima de 0,82. Os ensaios mostraram uma alta especificidade clinica pela curva ROC, acima de 99,5 % para todos os genes avaliados (Tabela 9). A menor área (0,73) foi encontrada para o gene espécie-especifico que detecta E. coli, provavelmente o desempenho foi prejudicado pela devido do DNA contaminante nos reagentes de PCR (Carroll et. al., 1999; Corless et. al., 2000).
A sensibilidade clínica encontrada no presente estudo foi baixa para SCoN, provavelmente, este resultado pode estar relacionado à alta detecção deste microrganismo nas reações de PCR em Tempo Real, por estarem presentes como microrganismos colonizantes de pele (Ikegaya et. al., 2010). Observamos uma concordância moderada para o gene 16S rDNA com um coeficiente Kappa de 0,482, já para a PCR com sondas espécie-especificas o grau de concordância pelo Kappa foi 0,79 quando comparado com o sistema automatizado Phoenix®, e assim considerado uma boa concordância.
No presente estudo, a PCR em Tempo Real para sondas Gram negativa e Gram positiva em comparação com a identificação pelo sistema automatizado Phoenix® mostrou sensibilidade de 65,38%, especificidade de 88,05%, VPP de 51,51% e VPN de 92,91%. Já para a PCR em Tempo Real com sondas espécie-especificas foi obtido 96% de sensibilidade, 93,33% de especificidade, 72,72% de VPP e 99,21% de VPN da PCR em comparação com o sistema automatizado Phoenix® (Tabela 14).
Jordan & Durso (2005) apresentaram resultados melhores, pois encontraram 96% de sensibilidade, 99,4% de especificidade, 88,9% de valor preditivo positivo e 99,8% de valor preditivo negativo da PCR em comparação com o cultivo de 0,5-1,0 mL de sangue com frasco BACTEC®. No nosso estudo não foi realizada a etapa de enriquecimento e isso pode explicar a diferença entre os dois métodos em comparação com o que foi relatado por Jordan & Durso. Não podemos excluir que os nove resultados de PCR em Tempo Real positivos sem resultados concordantes com cultura positiva podem também resultar de contaminação.
No presente estudo, as porcentagens de resultados falsos positivos, calculados pela curva ROC, utilizando amostras controle ATCC e amostras controles negativas de pacientes sem sinais de infecção de corrente sanguínea para PCR com sondas GP/GN foi de zero, considerando o LoD calculado. A PCR em Tempo Real com sondas espécie-especificas para A. baumannii,
Enterococcus spp., P. mirabilis, S. marcescens e Salmonella spp. apresentaram
os valores de falsos positivos calculados pela curva ROC de 41,2%, 15%, 35%, 20% e 10%, respectivamente (Tabela 9). Resultados semelhantes foram relatados por Chiquet e colaboradores, que encontraram resultados falsos positivos próximos de zero com a utilização de PCR convencional (Chiquet et.