4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.2. Variáveis Clínicas
Os dados clínicos e epidemiológicos de cada pacientes foram coletados conforme as informações das fichas médicas em ANEXO I, preenchidas pelo serviço de racionalização de antimicrobianos de vigilância de hemocultura do HSP e IOP/GRAACC. Os dados microbiológicos da hemocultura e antibiograma foram fornecidos pelo Laboratório Central do HSP, UNIFESP.
4.3. Diagnóstico Microbiológico
4.3.1. Hemoculturas
4.3.1.1. Coleta de Sangue
A coleta de sangue para os frascos de hemoculturas e tubos de EDTA K2 GEL foram realizadas na mesma hora, no mesmo pedido do médico assistente na presença de febre e suspeita de infecção. Na persistência da febre uma coleta adicional de hemocultura foi realizada a critério do médico assistente após 24 horas da primeira coleta.
As coletas de hemocultura foram realizadas pela equipe de enfermagem seguindo normas preconizadas pelas Comissões de Controle Infecção Hospitalar (CCIH) do HSP e IOP/GRAACC.
A coleta de hemocultura de cateter foi realizada em pacientes portadores de cateter venoso central (CVC), nos quais não é possível ou não está indicada à punção periférica, para coleta de amostra sanguínea.
Dos pacientes adultos, foram coletados 10 mL de sangue no frasco BACTEC Plus Aerobic/F® e das crianças foram coletados cinco mL de sangue no frasco BACTEC Plus Pediatric/F®.
4.3.1.2. Processamento das Hemoculturas
As hemoculturas do HSP e do IOP/GRAACC foram processadas no setor de microbiologia do Laboratório Central do Hospital São Paulo, UNIFESP.
Após a coleta, os frascos de hemocultura foram processados pelo equipamento BACTEC 9240® (Becton Dickinson, Maryland, EUA), um sistema automatizado que realiza a monitorização contínua do crescimento bacteriano. O
meio de cultura do frasco possui nutrientes que são metabolizados frente à presença de microrganismos viáveis na amostra. Esta metabolização resulta na produção de CO2 e esta alteração pode ser detectada e interpretada pelo sistema como amostra positiva.
4.3.2. Identificação Bacteriana Fenotípica e Teste de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos
Após a positivação da hemocultura pelo sistema BACTEC® foi realizada um esfregaço corado pelo método de Gram, para liberação do resultado parcial da hemocultura. A semeadura da hemocultura foi realizada em meios de cultura enriquecedores e seletivos, como ágar chocolate, ágar sangue e ágar eosino-metileno-blue (EMB).
A identificação dos microrganismos e o teste de susceptibilidade a antimicrobianos foram realizadas pelo equipamento Phoenix® 100 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md.) utilizando os painéis PMID-121, o PMID-123 e PMID-104, para Gram negativos, Gram negativos não fermentadores e Gram positivos, respectivamente. O sistema utiliza indicadores colorimétricos e fluorométricos para leitura dos testes de identificação e antibiograma.
O perfil de sensibilidade das amostras realizada pelo Phoenix® 100 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md.) foi pela detecção da concentração inibitória mímina (CIM) de acordo com as recomendações do CLSI vigente na data de coleta de cada hemocultura, e foram conforme os documentos M100-S18 (CLSI, 2008), M100-S19 (CLSI, 2009), M100-S20 (CLSI, 2010), M100-S21 (CLSI, 2011).
Através do sistema BD Phoenix também foi possível avaliar a produção de β-lactamase de espectro ampliado (ESβL) pelos testes de triagem e confirmatório, de acordo com as recomendações do M100-S18 (CLSI, 2008), M100-S19 (CLSI, 2009), M100-S20 (CLSI, 2010), M100-S21 (CLSI, 2011). O teste de triagem avaliou as drogas cefpodoxima (0,5 g/mL), ceftazidima (0,5
g/mL) e cefepima (2 g/mL), seguidas pelo teste confirmatório que utilizou as drogas combinadas: ceftazidima/ácido clavulânico (0,125/4 g/mL), ceftriaxona/ácido clavulânico (0,25/4 g/mL) e cefotaxima/ácido clavulânico (0,25/4 g/mL). Para a validação do lote do painel e para o controle de qualidade desses testes foram incluídas as amostras de E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 e K. pneumoniae ATCC 700603 que foi incluída como controle positivo para avaliar a acurácia do sistema para a detecção de ESβL.
Todos os frascos de hemocultura BACTEC® positivos e negativos, em estudo, foram encaminhados ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC da Disciplina de Infectologia da UNIFESP, para a realização das metodologias moleculares.
4.4. Diagnóstico Microbiológico Molecular
4.4.1. Padronização da PCR em Tempo Real
4.4.1.1. Preparação das Amostras Controles e Amostras Clínicas
Para a padronização das técnicas de PCR em Tempo Real foram utilizadas cepas bacterianas e leveduras padrão ATCC (“American Type
Collection Culture”), preferencialmente, e cepas controles que apresentam genes
de resistências e que foram, gentilmente, cedidas por outros grupos de pesquisas e que estão armazenadas no banco de microrganismos do LEMC
(Tabela1). As amostras clínicas controles negativas foram coletas de 30 voluntários profissionais de saúde da Disciplina de Infectologia da UNIFESP.
Todas as amostras bacterianas foram recuperadas em ágar sangue de carneiro (5%) ou ágar chocolate após incubação por 24 horas em atmosfera aeróbia ou microaerófila. As cepas de fungos e leveduras foram recuperadas em ágar Sabouraud. As amostras controles de resistência aos antimicrobianos foram semeadas em meios de cultura acrescidos de antimicrobianos indutores do mecanismo de resistência presente em cada bactéria.
Os controles positivos foram preparados por contaminação do meio de cultura do frasco BACTEC®, sangue periférico em EDTA K2 gel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), e solução salina, por bactéria e fungos referenciados na Tabela 1, correspondendo à escala 0,5 de McFarland. A partir desta escala foram preparados tubos com diluições 10 vezes seriadas. Para fungos filamentosos, os controles positivos foram contaminados e depois do DNA extraído foi quantificado no equipamento NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Delaware USA).
O DNA do microrganismo presente na corrente sanguínea de cada paciente foi obtido a partir de 3 a 10 mL de sangue de veia periférica colhidos em tubo com EDTA K2 gel, bem como a partir dos frascos de hemocultura depois de detectados pelos sistemas automatizados.
4.4.1.2. Extração de DNA
4.4.1.2.1. Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura
Para a extração do DNA foram aliquotados, em um tubo de dois mL estéril, 500 µL do frasco de hemocultura do sistema BACTEC® em 500 µL de brazol. Em
seguida foram adicionados 300 mg esferas de vidro 0,5 mm diâmetro (Scientific Industries, Inc.) e agitados por 10 minutos (min.) no desrupitor de células modelo Genie (Scientific Industries, Inc.). Após este tempo, foram acrescentados 180 µL de clorofórmio gelado e a mistura homogeneizada por cinco segundos no vortex. A solução foi centrifugada a 20.000 g por 12 min a 8 ºC. O sobrenadante foi retirado e transferido para outro tubo contendo 500 µL de etanol gelado que foram agitados 3 a 5 segundos no vortex e centrifugado a 20.000 g por 12 min. a 8 ºC. O sobrenadante foi retirado e foram adicionados 500 µL de etanol gelado e centrifugados 20.000 g por 12 min. a 8 ºC. O sobrenadante foi retirado e foram adicionados 50 µL de água MilliQ. O tubo foi colocado a 65 ºC por 30 minutos.
4.4.1.2.2. Extração do DNA Direto dos Tubos com EDTA K2 Gel
A partir dos tubos de EDTA K2 gel, um volume de 1,5 mL de sangue foi aliquotado em um tubo de 2 mL estéril, a esse volume foram adicionados 300 mg esferas de vidro de 0,5 mm diâmetro (Scientific Industries, Inc.) e agitados por 10 minutos no desrupitor de células modelo Genie (Scientific Industries, Inc.). Uma alíquota de 1 mL foi transferida para um novo tubo e a extração do DNA foi realizada pelo kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Os reagentes proteinase K, buffer AL e etanol foram adicionados proporcionalmente ao volume da amostra de sangue periférico, conforme instruções do fabricante. Foram pipetados 100 μL de proteinase K no fundo de um tubo no qual logo em seguida, foi adicionado 1mL de sangue. Em seguida foram adicionados 1000 μL do buffer AL e homogeneizados no vortex por 15 segundos. O tubo foi incubado a 56°C por 10 minutos e depois centrifugado (spin) para remover as gotículas da tampa do tubo de microcentrífuga. Logo após, foram adicionados 1000 μL de etanol (96-100%). Uma alíquota foi então transferida para um tubo de coluna acoplado ao tubo de
coleta de 2 mL e centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto. O tubo acoplado foi descartado e outra alíquota foi transferida para o mesmo tubo de coluna, que foi novamente centrifugado. O tubo acoplado foi descartado e foram adicionados 500 μL do buffer AW1, centrifugados a 6.000 x g por 1 minuto e depois disso o tubo acoplado foi descartado. Foram adicionados 500 μL do buffer AW2, centrifugados a 20.000 x g por 3 minutos e o tubo da coluna foi transferido para um tubo limpo. Foram adicionados 50 μL do buffer AE, o tubo foi incubado a temperatura ambiente (15-25°C) por 5 minutos e centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto.
Tabela 1: Relação dos microrganismos controles positivos utilizados na padronização das reações de PCR em Tempo Real.
Microrganismo Linhagem
Acinetobacter baumannii ATCC 19606
Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305
Aspergillus flavus Amostra clínica
Aspergillus fumigatus Amostra clínica
Aspergillus parasiticus Amostra clínica
Burkholderia cepacia Amostra clínica
Candida albicans ATCC 90028
Candida krusei ATCC 6258
Candida parapsilosis ATCC 22019
Candida tropicalis ATCC 750
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Enterobacter cloacae Controle blaVIM
Enterococcus avium ATCC 35665
Enterococcus casseliflavus ATCC 700327
Enterococcus durans ATCC 6056
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Microrganismo Linhagem
Enterococcus faecalis Controle vanB
Enterococcus faecalis ATCC 700802
Escherichia coli ATCC 25922
Fusarium solani Amostra clinica
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Klebsiella pneumoniae Controle blaTEM, SHV, CTX, KPC (A28005)
Proteus mirabilis ATCC 29245
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Pseudomonas aeruginosa Controle blaSPM (P1088)
Pseudomonas aeruginosa Controle blaIMP
Pseudomonas aeruginosa Controle blaVIM
Rhizopus sp Amostra clínica
Rhodotorula sp Amostra clínica
Salmonella sp Amostra clínica
Serratia marcescens Amostra clínica
Shigella flexineri ATCC 12022
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Staphylococcus aureus ATCC 43300 mecA
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Staphylococcus haemolyticus ATCC 29968
Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305
Staphylococcus warneri Amostra clínica
Stenotrophomonas maltophilia Amostra clínica
Streptococcus mitis Amostra clínica
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Streptococcus pyogenes ATCC 18615
Streptococcus viridans Amostra clínica
ATCC -American Type Collection Culture
4.4.1.3. Iniciadores e Sondas TaqMan-MGB
Os iniciadores e sondas TaqMan para identificação dos principais patógenos utilizados neste estudo foram desenhados para os genes
espécies-específicas no software “Primer Express” v2. 0 (Applied Biosystems, CA) apresentados na Tabela 2. Para os microrganismos Mycobacterium
tuberculosis, (Desjardin et. al., 1998), Aspergillus spp. (Luong et. al., 2011), Fusarium spp. (Hue et. al., 1999), Candida albicans (Guiver et. al., 2001), Gram
positivo e Gram negativo (Bispo et. al., 2011) foram utilizados iniciadores e sondas já descritos anteriormente. Os iniciadores utilizados para controle interno e os genes de resistência blaKPC, blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA e 18S rDNA para fungos já foram descritos anteriormente e estão
apresentados na Tabela 2.
As sequências dos genes específicos para cada microrganismo foi obtida do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) e alinhadas usando o programa
DNASTAR (Lasergene Software Package DNASTAR, Wisconsin, EUA). Todos
os iniciadores e sondas foram testados em relação à sua especificidade no programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) e demonstraram ser específicos para cada uma de suas finalidades.
Tabela 2: Lista de iniciadores e sondas TaqMan para amplificação da região codificadora dos genes de resistência aos antimicrobianos, controle interno e genes espécie-especificos para a identificação dos microrganismos.
Iniciadores e Sondas Sequencia (5’3’) Microrganismo ou Resistência aos Antimicrobianos Gene Número de acesso GenBank e Referências Acinet-F TGGACTCGGTAGCTGCACTTAC Acinetobacter baumannii recA GU 942487.1 Acinet-R CCCATATGAGAGTCACCCATCTC
Acinet-PB CCTAAAGCAGAAATCGAA Este estudo
Enteroco-F AGAAATTCCAAACGAACTTG Enterococcus spp. AF 35185
Enteroco-R CAGTGCTCTACCTCCATCATT groES
Iniciadores e Sondas Sequencia (5’3’) Microrganismo ou Resistência aos Antimicrobianos Gene Número de acesso GenBank e Referências Ecoli-F GCCGGGAAAAGTGTACGTATCA Escherichia coli uidA AM 180568.1 Ecoli-R CGGGATAGTCTGCCAGTTCAG
Ecoli-PB CGTTTGTGTGAACAAC Este estudo
Enterob-F CATGATGGAGCTGATCCGTAAC
Enterobacter cloacae
Enterob-R CCCGCAAATACGGAGTAACC atpD DQ 859777.1
Enterob-PB TCGCGATCGAGCACT Este estudo
Kpneu-F GATTTAATCGCAACACGCATGA
Klebsiella pneumoniae
hemolysin AF 293352.1
Kpneu-R TTCTCCCGAAAATGAGACACTTC
Kpneu-PB CCTGGGTATGCTATAT Este estudo
Paer-F ACGACGGTCATGGGCAACT
Pseudomonas aeruginosa
regA EU 342000.1
Paer-R GTGATAGTAGCCGGAGTAGTAGCTGT
Paer-PB AAGCTGCTCTCGGAACAGGT Este estudo
Sal-F CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATT
Salmonella spp.
invA U 43272
Sal-R ACGGCTGGTACTGATCGATAA Este estudo
Sal-PB CCACGCTCTTTCGTCTGG Saur-F AGCTGGCTTAGCGTATATTTATGCT Staphylococcus aureus nuc EF 529608.1 Saur-R GCAACTTTAGCCAAGCCTTGA
Saur-PB AATGGTAAACAAAGCTTTAG Este estudo
SCN-F CCCAATCATTTGTCCCACCTT Staphylococcus rrs gi 281296180
SCN-R CCGAAGGTGGAGTAAC coagulase
SCN-PB ACGGCTAGCTCCAAAT negativo Este estudo
Spneu-F CACGGCTCACAGCATGGA
Streptococcus pneumoniae
GU 968411.1
Spneu-R AGAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTCA ply
Spneu-PB CTCAAGGTCAAGTTTGGT Este estudo
Smarc-F CCGTCGCGGTGCTGAT
Serratia marcescens
crp AF 276243.1
Smarc-R CCTGGTTGAGGTAGGACAGGAT
Smarc-PB GATGAAGAAGGTAAAGAGA Este estudo
Steno-F TTGCCACTGCGCGTGTA
S. maltophilia
metB 6365181
Steno -R TGTCGTCGAACTTCAGTTTTGAA
Steno -PB CTTGTTGCCGAAGCCT Este estudo
Mtuber-F GGCTGTGGGTAGCAGACC Mycobacterium tuberculosis IS 6110 X 52471 Mtuber-R CGGGTCCAGATGGCTTGC Mtuber-PB TGTGGGTAGCAGACCTCACCTATGTGTC GA Desjardin et al, 1998 Pmira-F CCTGCGTGATGGTAACAATGA Proteus mirabilis
Pmira1-R GCAGCTTCAGATGCAGAACCT mrpA Z 32686
Pmira1-PB TCTGAACTTTGCTGCTTATT Este estudo
Asperg-F GTGGAGTGATTTGTCTGTTAATTG
Aspergillus spp. 18S
rDNA
Asperg -R TCTAAGGGCATCACAGACCTGTT AF 548061
Asperg -PB CGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCG Luong et al, 2011
Fusar-F AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT
Fusarium spp.
Fusar-R ACAAATTACAACTCGGGCCCGAGA Hue et al, 1999
Calbic-F GGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGT Candida albicans FJ 159679.1 Calbic-R TTGAAGATATACGTGGTGGACGTTTG 18S rDNA Guiver et al, 2001 Calbic-PB TAAGCCATTGTCAAAGCGATC
Iniciadores e Sondas Sequencia (5’3’) Microrganismo ou Resistência aos Antimicrobianos Gene Número de acesso GenBank e Referências
Candsp-R GCCTGCTTTGAACACTCT rDNA Este estudo
Candsp-PB TTTGATGCGTACTGGACCC
NFW-F GACTCCTACGGGAGGC 16S
rDNA
522Rv-R GCGGCTGCTGGGAC
GP-PB CTGAYSSAGCAACGCCGCG Gram positivo Bispo et al, 2011
GN-PB CCTGAYSCAGCMATGCCGCG Gram negativo
HFE_ F GATGACCAGCTGTTCGTGTTC HFE NM 139004.2
HFE_R CCACATCTGGCTTGAAATTCT Este estudo
NS5 AACTTAAAGGAATTGACGGAAG 18S
rDNA
White et al, 1990
NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC Fungo
blaSHV-F ATGCGTTATACGCCTGTG blaSHV Monteiro et al, 2009
blaSHV-R TGCTTTGTATTCGGGCCAA Cefalosporina Monstein et al, 2007
blaTEM-F TGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA blaTEM Monteiro et al, 2009
blaTEM-R ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT Cefalosporina Monstein et al, 2007
blaCTX-F ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC blaCTX Monteiro et al, 2009
blaCTX-R TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCG
G
Cefalosporina Monstein et al, 2007
blaKPC-F ATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTC blaKPC EU 784136
blaKPC-R CAATCCCTCGAGCGCGAGTC Carbapenen Monteiro et al, 2009
blaIMP-F GAATAG(A\G) (A\G)TGGCTTAA(C\T)TCTC blaIMP Mendes et al, 2007
blaIMP-R CAAAC(C\T)ACTA(G\C)GTTATC Carbapenen
blaVIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC blaVIM Mendes et al, 2007
blaVIM-R AATGCGCAGCACCAGGATAG Carbapenen
blaSPM-F CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG blaSPM AJ 492820
blaSPM-R CCTTTTCCGCGACCTTGATC Carbapenen Mendes et al, 2007
mecA-F AAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACC mecA Zhang et al, 2005
mecA-R GAAAGGATCTGTACTGGGTTAATCAG Metilicina
vanA-F GGGAAAACGACAATTGC vanA Dutka-Malen et al,
1995
vanA-R GTACAATGCGGCCGTTA Glicopeptídeo
vanB-F ATGGGAAGCCGATAGTC vanB Dutka-Malen et al,
1995
vanB-R GATTTCGTTCCTCGAC Glicopeptídeo
F- Iniciador Sense; R - Iniciador Anti-sense e PB - Sonda TaqMan
4.4.1.4. Amplificação por PCR em Tempo Real
A amplificação da reação de PCR em Tempo Real foi realizada no equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA) utilizando o Kit Platinum SYBR Green PCR em Tempo Real Super Mix (Invitrogen, California, EUA) e TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, EUA). As condições de termociclagem foram: 2 minutos a 50°C, seguidos de 10
minutos a 95°C e 45 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Todos os iniciadores testados para a PCR em Tempo Real utilizando o fluoróforo SYBR
Green foram submetidos à análise da curva de desnaturação (melting curve)
para garantir a correta amplificação de cada conjunto de iniciador e assim, determinar a temperatura de desnaturação (Tm - Temperatura de melting) dos produtos de PCR para cada gene. O ciclo de dissociação dos produtos para a curva de desnaturação (melting curve) foi: 95°C por 10 minutos, seguidos por 40 ciclos de 40 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C, e uma etapa para realização da curva de desnaturação que variou de 68°C até 95°C, com aumento gradual na temperatura de 0,5°C/s. Dessa forma, foi determinada a temperatura de desnaturação (Tm) dos produtos de PCR dos genes analisados.
Tanto para o sistema SYBR Green quanto para o sistema TaqMan foi avaliado o Ct em que ocorreu a detecção da positividade.
A triagem das amostras positivas para os microrganismos foi realizada primeiramente pela PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan utilizando os iniciadores ‘genéricos’ para os genes 16S rDNA para bactérias e sondas Gram especificas, que diferenciam os bactérias em Gram positivas e Gram negativas. E pela PCR em Tempo Real por SYBR Green para fungos com iniciadores ‘genéricos’ para o gene 18S rDNA. Depois disso, as amostras com resultados positivos foram encaminhadas para outra reação de PCR em Tempo Real com sondas espécie-especificas para cada microrganismo. Assim, foi possível otimizar as reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan, direcionando para as reações para bactérias ou para as reações para fungos.
4.4.1.5. Eficiência da PCR em Tempo Real
A eficiência (E) das reações para os protocolos de PCR em Tempo Real foi calculada após construção de uma curva padrão utilizando a fórmula: E =
10(-1/-slope) -1, onde E = eficiência, “slope” = inclinação da curva no 7500 Software v2. 0.4 . O valor corresponde à eficiência da reação em porcentagem quando multiplicado por 100. As curvas foram avaliadas por um ensaio com as amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de cinco pontos e foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança de 95%.
Para determinar a eficiência da PCR em Tempo Real foram utilizadas cepas controles, para os genes espécie-especificos foram utilizadas cepas ATCC ou amostras clinicas caracterizadas, e os genes de resistências foram realizados com cepas cedidas gentilmente por outros grupos de pesquisas e que estão armazenadas no banco de microrganismos do LEMC. Todas as amostras bacterianas foram recuperadas em ágar sangue de carneiro (5%) após incubação por 24 horas em atmosfera aeróbia ou microaerófila. Os respectivos controles utilizados para os genes encontram-se na Tabela 1.
O limite mínimo de detecção de DNA para o gene HFE foi avaliado utilizando DNA extraído dos frascos BACTEC®. Estes foram diluídos a partir de 10 ng/µL até 100 fg/µL. Em um tubo contendo 4 mL de salina foi preparada uma suspensão bacteriana na escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Um mL da solução foi transferida para tubo de 2 mL estéril e assim foi extraído o DNA bacteriano por fervura, 10 minutos a 100°C e centrifugado a 16.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 2 mL estéril. Para a preparação das amostras para a curva padrão, foi realizada uma diluição seriada de 10-1 a 10-7 a partir do tubo da escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL) para cada gene testado. Para a padronização as curvas foram realizadas em triplicata.
4.4.2. Validação de Novos Métodos de Diagnóstico
4.4.2.1. Especificidade Analítica
A determinação da especificidade analítica foi abordada em dois aspectos: reação cruzada e falsos positivos, conforme o documento MM3-A2 (CLSI, 2006). Foram avaliadas a capacidade de amplificação dos alvos amplificados e a incapacidade de amplificação cruzada de microrganismos relacionados aos microrganismos alvo (Tabela 1). Uma reação contendo todos os reagentes, com exceção do DNA da amostra, também foi utilizada como controle negativo.
4.4.2.2. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff”
A determinação do Ct do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff point” foi
realizada usando amostras negativas. O “cutoff”, limiar o qual um resultado abaixo dele é relatado como positivo e acima como negativo, foi calculado de acordo com os documentos EP12-A2 (CLSI, 2008), EP17-A (CLSI, 2004) e Chandelier e colaboradores (2010). Para dados paramétricos com distribuição dos Ct das amostras negativas correspondentes a uma distribuição normal, com 95% de confiabilidade e valor de α de 5%, o LoB foi calculado pela equação: LoB = µCtN + 1.645 σCtN (CtN= Ct das amostras negativas).
Para dados não paramétricos com distribuição não correspondente a distribuição normal e resultados quando truncado com zero, foi considerado p = (100-α) = 95. Os valores mensurados foram ordenados de acordo com o resultado e o percentil foi estimado pela observação dos valores classificados. O LoB foi determinado pela posição do Ct correspondente aos 95 percentiis pela equação: LoB = PctB (100-α), no qual LoB = NB (p/100) + 0,5.
Quando o valor da posição não for um valor inteiro, para o cálculo da posição dos 95 percentiis, foi realizada a interpolação linear. Se a posição foi X1,5
a posição foi a média entre duas posições. Se a posição dos 95 percentil corresponder a uma posição X1,25 , a posição foi calculada como X1 + 0,25 (X2 – X1).
O ciclo de “cutoff” foi determinado a partir do Ct de amostras negativas. Os
valores de Ct determinado pelas amostras negativas puderam ser considerados quando determinados e quando foram “undetermined” os resultados do Ct foram
considerados como valores Ct correspondentes a 40, ou seja, o último ciclo da PCR usando o método em tempo real (Chandelier et. al., 2010).
4.4.2.3. Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade)
Para métodos laboratoriais de análises clínicas foi conforme o CLSI, no qual o limite inferior de detecção pode ser determinado conforme o documento EP17-A (CLSI, 2004). Foi sugerido para determinar o LoD um número mínimo de 60 resultados de amostras positivas com baixa concentração.
O limite inferior de detecção das reações de PCR foi obtido pela equação: LoD = LoB + cβ SDS (LoD – limite de detecção; LoB – limite do branco; cβ – derivado do percentil de 95% da distribuição padrão Gaussiana e fator de correção e SDS – desvio padrão estimado para a população).
4.4.2.4. Acurácia Clínica
A acurácia clínica para a PCR em Tempo Real foi determinada pela curva ROC. Foi utilizado como amostras controles negativo um total de 30 amostras
em um pool de três amostras por frasco de hemocultura BACTEC® e 30 amostras em tubos de EDTA K2 GEL com um pool de três amostras provenientes de 30 profissionais da saúde sem a doença.
A Curva de Características de Operação do Receptor (Curva ROC-
Receiver Operating Characteristic) demonstra a relação normalmente antagônica
entre a sensibilidade e a especificidade dos exames que apresentam resultados contínuos. É uma ferramenta poderosa para medir e especificar problemas no desempenho do diagnóstico em medicina por permitir estudar a variação da sensibilidade e especificidade para diferentes valores de corte. A sensibilidade e a especificidade dependem muito do ponto de corte (“cutoff”) entre os resultados
positivos e negativos. A Curva ROC mostra um gráfico de sensibilidade (ou taxa de verdadeiros positivos) versus taxa de falsos positivos. O valor do ponto de corte é definido com um valor que pode ser selecionado arbitrariamente pelo