De uma forma geral, ambas as técnicas utilizadas neste trabalho, nomeadamente o MLPA e o aCGH foram úteis no diagnóstico de desequilíbrios cromossómicos em pacientes com indicações clínicas específicas. A partir deste trabalho estabelecemos as seguintes conclusões:
Os resultados de MLPA e de array CGH dependem da qualidade do DNA extraído, ou seja, quando a qualidade do DNA é pouca satisfatória a fiabilidade dos resultados é comprometida.
A técnica de aCGH permite determinar o tamanho exato das anomalias cromossómicas e o número de genes envolvidos, enquanto que no MLPA a determinação do tamanho da alteração depende do número de sondas que cobrem a região alterada e das distâncias entre as sondas de MLPA, as quais podem encobrir uma deleção/duplicação.
A técnica de FISH é de grande utilidade para a confirmação de resultados, com a particularidade de detetar diferentes níveis de mosaicismo dependendo do número de células analisadas. Para além disso, o facto de identificar translocações equilibradas, não identificadas por MLPA ou aCGH, é primordial para o estudo dos progenitores e desta forma na determinação da origem da alteração cromossómica.
Para além do estudo dos progenitores, o estudo de irmãos é também relevante, dado o risco de recorrência (superior a 1 %) em gestações futuras, no caso de um dos progenitores ser portador do rearranjo cromossómico. No caso de o rearranjo não ser herdado a partir de um dos progenitores este é considerado de novo e deste modo apresenta um risco de recorrência de ≈ 1 %.
Apesar de, todos os pacientes estudados pela técnica de MLPA apresentarem indicações clínicas, a maioria não revelou alterações nos painéis de MLPA utilizados. No caso destes pacientes, o fenótipo observado poderá ser devido à presença de rearranjos presentes noutras regiões cromossómicas e desta forma uma alternativa possível é o seu estudo pela técnica de aCGH.
A previsão do fenótipo com base nas alterações cromossómicas identificadas, na maioria das vezes é dificultada pela presença de outros fatores genéticos e não genéticos, os quais influenciam na determinação final do fenótipo. A título de exemplo, a penetrância incompleta, os fatores epigenéticos e a influência de fatores ambientais, são responsáveis pela grande variabilidade fenotípica em pacientes com alterações idênticas, desde
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indivíduos aparentemente normais a nível fenotípico a indivíduos com múltiplas anomalias.
A pesquisa em bases de dados genómicas específicas e na literatura são úteis no estabelecimento de uma correlação entre o genótipo e o fenótipo no caso de pacientes com quadros clínicos específicos e portadores de determinada anomalia cromossómica.
Atualmente a técnica de MLPA é utilizada maioritariamente para estudos em pré-natal, mas precisamente para o despiste rápido das aneuploidias mais comuns, com um número superior de amostras analisadas comparativamente aos pacientes analisados pelos restantes painéis, no âmbito do diagnóstico pós-natal. Esta situação deve-se sobretudo ao facto, da maioria dos estudos em pós-natal estar centralizada na técnica de aCGH, sendo o MLPA utilizado na validação das anomalias cromossómicas identificadas. É de salientar que, no caso de nenhum dos painéis de MLPA disponíveis comercialmente pela empresa MRC-Holland incluir a região alterada, uma alternativa é o “MLPA Design”, no qual são desenhadas sondas específicas para essa mesma região.
Embora, a aplicação da técnica de aCGH tenha vindo a aumentar exponencialmente para fins de diagnóstico, a estratégia inicial no estudo de pacientes com anomalias cardíacas, como indicação clínica principal, permanece no estudo com o painel de MLPA P250 dada a elevada densidade de sondas para a região crítica do cromossoma 22q11.21, o que se reflete neste estudo num maior número de pacientes estudados com este painel, comparativamente aos restantes painéis.
De uma forma geral, a capacidade do MLPA detetar alterações numa dada região cromossómica depende do número de sondas específicas para essa região. Desta forma, o desenvolvimento de novos painéis de MLPA que incluam um maior número de sondas para uma região específica associada a determinado distúrbio, poderão contribuir para o equilíbrio entre o número de pacientes estudados pelas técnicas de MLPA e aCGH, e assim proporcionar uma melhor relação custo-benefício.
O MLPA revelou ser uma técnica muito útil para o diagnóstico rápido das aneuploidias mais comuns, no entanto, foram utilizadas amostras obtidas a partir de procedimentos invasivos, os quais apresentam um risco de aborto associado. Desta forma, as estratégias para DPN não invasivo de aneuploidias que têm vindo a ser desenvolvidas, irão contribuir para a redução significativa desse risco.
Os desequilíbrios cromossómicos detetados neste trabalho abrangem regiões específicas do genoma, as quais incluem determinados genes potencialmente responsáveis pelo fenótipo
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observado. No entanto, o conhecimento acerca da função e expressão desses genes é limitado, o que dificulta a determinação de uma correlação genótipo-fenótipo precisa. Deste modo, um estudo mais detalhado acerca dos genes associados a determinado rearranjo cromossómico, juntamente com a análise da influência dos fatores genéticos e epigenéticos sobre a determinação final do fenótipo, são abordagens a serem adotadas nesta área.
Dada a grande complexidade do atraso mental, o estudo do proteoma de pacientes com este distúrbio, representa uma das estratégias de grande relevância a serem desenvolvidas para uma melhor compreensão desta doença.
Por último, as técnicas de sequenciação de última geração, incluindo a sequenciação do exoma, são úteis na pesquisa de mutações em genes específicos associados com determinadas doenças genéticas e representam potenciais tecnologias para utilização em laboratórios de diagnóstico/investigação, uma vez que têm vindo a ser referenciadas como técnicas inovadoras e de elevado rendimento para estudos nestas áreas.
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