Experimentos in vivo

4.5.1 Animais

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e das diretrizes internacionais para a investigação biomédica envolvendo animais do Conselho de Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS). O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (número do protocolo: 004/2013).

Camundongos albinos Swiss (cerca de 30 g, 6-8 semanas de vida), de ambos os sexos, fornecidos pelo biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foram utilizados. Os camundongos foram pareados por sexo e idade em todos os procedimentos. Os animais foram mantidos em gaiolas padrões de polipropileno (30 × 19 × 13 cm) e mantidos em temperatura controlada (22 ± 2ºC) em um ciclo claro/escuro de 12 h. Os camundongos foram alimentados com ração extrusada padrão de laboratório (Presence®, adquirida da Agroline, Campo Grande, MS, Brasil) e água ad libitum. Ao final dos experimentos, os animais foram eutanasiados por overdose de tiopental sódico (100 mg/kg) pela via intraperitoneal (i.p.).

4.5.2 Protocolos de tratamento e doses utilizadas

As doses de EA e SAB foram administradas seguindo dois protocolos de tratamento: pré-tratamento (EA ou SAB utilizados 60 min antes da injeção da peçonha) e pós-tratamento (EA ou SAB administrados 1 min após a injeção da peçonha). Em ambos os protocolos, EA (400 mg/kg) ou SAB (100 µL/camundongo) foram administrados pela via intraperitoneal (i.p.). A dose de EA foi escolhida baseando-se em estudos dose-efeito (resultados não mostrados), dos quais a dose mais efetiva foi selecionada. A dose e a via de administração do SAB foi escolhida baseando-se em ensaios piloto, estudos prévios encontrados na literatura e a bula do produto, que indica que 1 mL de SAB neutraliza 5 mg de PBj (peçonha de referência), o que corresponde a uma proporção 1:0,2 PBj: SAB (p/v). Considerando as doses- desafio utilizadas neste estudo, um excesso de SAB em relação à bula do produto foi utilizado, para evitar possíveis resultados falso-negativos devido baixa dosagem de SAB (Tabela 3). Grupos onde animais envenenados foram tratados com PBS foram utilizados

como controle (controle peçonha). Adicionalmente, como controle negativo, animais receberam apenas PBS (controle normal).

Tabela 3 – Doses-desafio da peçonha de Bothrops erythromelas (PBe) e dosagem de soro antibotrópico (SAB) utilizados

Atividade Dose-desafio PBe (µg) Dose de SAB (µL) Proporção PBe:SAB (p/v) µL SAB por mg de PBe Edematogênica 1,0 100,0 1:100 100.000 Hemorrágica 25,0 100,0 1:4 4.000 Proteolítica 15,0 3,75 1:0,25 250 15,0 7,5 1:0,5 500 15,0 15,0 1:1 1000 PLA2 2,5 0,625 1:0,25 250 2,5 1,25 1:0,5 500 2,5 2,5 1:1 1000 Hialuronidase 3,0 0,75 1:0,25 250 3,0 1,5 1:0,5 500 3,0 3,0 1:1 1000

Fonte: Autoria própria. PLA2: fosfolipase A2.

4.5.3 Atividade edematogênica

A atividade edematogênica de PBe foi avaliada utilizando o modelo de edema de pata, conforme descrito previamente na literatura com pequenas modificações (FÉLIX-SILVA et al., 2014d). PBe (1 µg/ 50 µL de PBS) foi injetada subcutaneamente na pata direita posterior. Animais controle receberam igual volume de PBS (controle normal). A dose de PBe foi escolhida baseada em ensaios piloto, onde a dose selecionada causou edema de pata significativo sem produzir hemorragia local. A espessura individual da pata direita foi mensurada imediatamente antes da injeção da peçonha (valor basal) e em intervalos de tempo selecionados após a indução do edema (0,25; 0,5; 1; 1,5 e 2 h), utilizando um paquímetro digital (Digimess, São Paulo, SP, Brasil). O edema foi expresso como a diferença percentual entre a espessura da pata depois (nos respectivos tempos) e antes (valores basais) da injeção da peçonha, como média ± erro padrão da média, com n = 5 animais por grupo. Adicionalmente, a área sob a curva temporal após 2 h (ASC0-2 h) foi calculada utilizando a

regra trapezoidal.

Após 2 h da injeção de PBe, os animais foram eutanasiados e suas patas direitas posteriores foram coletadas para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), como um marcador bioquímico da migração de neutrófilos para o sítio inflamatório, conforme descrito previamente (BRADLEY et al., 1982). Resumidamente, os tecidos das patas foram pesados, picotados e homogeneizados em tampão brometo de

hexadeciltrimetilamônio 0,5% (1 mL de tampão para cada 50 mg de tecido). Em seguida, as amostras foram sonicadas em banho de gelo por 30 s, submetidas a 3 ciclos de congelamento- descongelamento e finalmente sonicadas por mais 30 segundos, para extração da enzima MPO. O sobrenadante obtido após a centrifugação a 10.000 g por 10 min a 4ºC foi utilizado para a determinação da atividade enzimática, misturando-se 20 µL de cada sobrenadante com 200 µL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 contendo peróxido de hidrogênio 0,0005% e o-dianisidina 0,167 mg/mL. A mensuração da atividade foi conduzida a 460 nm, utilizando uma leitora de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA), através de leitura cinética em intervalos de 1 min, durante 3 minutos. Uma unidade de MPO é definida como o equivalente ao consumo de 1 µmol de peróxido de hidrogênio, considerando que 1 µmol de peróxido de hidrogênio provoca uma mudança na absorbância de 1,13 × 10-2 por minuto (POSADAS et al., 2004). Amostras de cada animal foram analisadas em triplicata e a média dessas determinações foi utilizada para expressar o resultado como média ± erro padrão da média, com n = 5 animais por grupo.

4.5.4 Atividade hemorrágica

A atividade hemorrágica de PBe foi avaliada utilizando o modelo de hemorragia de pele local, conforme descrito previamente na literatura com pequenas modificações (DOMINGOS et al., 2015; ROODT et al., 2000). PBe (25 µg/ 100 µL de PBS) foi injetada subcutaneamente na região central do abdome dos camundongos. Animais controle receberam igual volume de PBS (controle normal). Após 3 h, os animais foram eutanasiados e a superfície interna da pele foi exposta. A pele hemorrágica foi removida e pesada em uma balança analítica. A hemorragia foi expressa como a massa do halo hemorrágico formado após a injeção subcutânea da peçonha, em gramas, como média ± erro padrão da média, com n = 5 animais por grupo.

Em seguida, o halo hemorrágico foi fragmentado e homogeneizado em 3 mL de reagente de Drabkin para extração da hemoglobina. Após incubação durante 48 h a 8ºC, as amostras foram primeiramente centrifugadas a 392 g por 10 min, a temperatura ambiente. Logo após, 1 mL deste sobrenadante foi centrifugado a 16.000 g por 30 min a 4ºC. Por fim, o sobrenadante límpido obtido foi lido a 540 nm em uma leitora de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA), utilizando reagente de Drabkin como branco. A concentração de hemoglobina no halo hemorrágico foi determinada através de uma curva padrão usando hemoglobina. A hemorragia foi expressa como o conteúdo de hemoglobina extraído do halo

hemorrágico formado após a injeção subcutânea da peçonha, em mg/mL. Amostras de cada animal foram analisadas em triplicata e a média dessas determinações foi utilizada para expressar o resultado como média ± erro padrão da média, com n = 5 animais por grupo.