Inibição dos efeitos locais induzidos pela peçonha de Bothrops erythromelas (PBe) in

vivo

4.5.1 Animais de experimentação

Experimentos envolvendo animais foram realizados seguindo-se as recomendações do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e as diretrizes internacionais para a investigação biomédica envolvendo animais do Conselho de

Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS). O protocolo experimental utilizado foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (número do protocolo: 004/2013).

Foram utilizados camundongos albinos Swiss (cerca de 30 g, 6-8 semanas de vida), de ambos os sexos, fornecidos pelo biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os camundongos foram pareados por sexo e idade em todos os experimentos. Os animais foram mantidos em gaiolas padrões de polipropileno (30 × 19 × 13 cm) e mantidos em temperatura controlada (22 ± 2ºC) em um ciclo claro/escuro de 12 h. Os camundongos foram alimentados com ração extrusada padrão de laboratório (Presence®, Agroline, Campo Grande, MS, Brasil) e água ad libitum. Ao final dos experimentos, os animais foram eutanasiados por overdose de tiopental sódico (100 mg/kg) pela via intraperitoneal (i.p.).

4.5.2 Esquema de tratamento

Antes de avaliar a eficácia dos tratamentos nos efeitos locais de PBe, as doses mínimas de peçonha para induzir os efeitos estudados (edema, hemorragia e miotoxicidade) foram determinadas, conforme descrito a seguir. Após a escolha das doses mínimas de peçonha para cada modelo experimental, foram estabelecidas doses de SABC e gel para o tratamento dos animais após o envenenamento experimental com PBe, sozinhos ou em combinação. Os grupos de tratamento consistiram em:

(1) PBe + SABC: os animais receberam injeção de PBe e 1 min depois receberam tratamento intraperitoneal (i.p.) com 100 µL de SABC;

(2) PBe + SABC + gel (associação): os animais receberam injeção de PBe, 1 min depois receberam tratamento i.p. com 100 µL de SABC e, por fim, receberam tratamento tópico com 20 mg do gel fitoterápico, aplicado a partir de movimentos padronizados de 25 fricções com um swab, 2 min após o enveneneamento e depois reaplicado na metade da duração do modelo experimental (2 h na atividade edematogênica e 1,5 h nas atividades hemorrágica e miotóxica);

(3) PBe + gel: os animais receberam injeção de PBe e depois receberam tratamento tópico com 20 mg do gel fitoterápico, aplicado a partir de movimentos padronizados de 25 fricções com um swab, 2 min após o enveneneamento e depois reaplicado na metade da

duração do modelo experimental (2 h na atividade edematogênica e 1,5 h nas atividades hemorrágica e miotóxica).

A dose e a via de administração de SABC foi selecionada baseando-se em ensaios piloto, em estudos prévios na literatura e na própria bula do produto, que indica que 1 mL de soro neutraliza 2 mg de peçonha de B. jararaca (peçonha de referência). Considerando-se as doses-desafio de PBe utilizadas, um excesso de SABC foi utilizado em todos os ensaios, para evitar possíveis resultados falso-negativos devido a baixas dosagens de SABC. O protocolo de aplicação do gel (número de fricções e quantidade aplicada) foi otimizado para permitir a perfeita internalização da formulação na pele dos animais.

Além dos grupos tratados, como controle, utilizaram-se grupos de animais injetados apenas com PBe (controle envenenamento experimental) e grupos de animais injetados apenas com PBS (controle saudável).

4.5.3 Atividade edematogênica

A atividade edematogênica de PBe foi avaliada utilizando o modelo de edema de pata, conforme descrito previamente na literatura, com pequenas modificações (FÉLIX-SILVA et al., 2017a). O edema foi induzido pela injeção subcutânea na pata posterior direita de 50 µL de PBS contendo 1 µg de PBe. A quantidade de peçonha utilizada foi capaz de induzir edema de pata significativo ao longo de 4 h de observação, sem produzir hemorragia local. A espessura individual das patas foi mensurada imediatamente antes da injeção da peçonha (valor basal) e em intervalos de tempo selecionados após a indução do edema (0,5; 1; 2; 3 e 4 h), utilizando um paquímetro digital (Digimess, São Paulo, SP, Brasil). O edema foi expresso como a diferença percentual entre a espessura da pata depois (nos respectivos tempos) e antes (valores basais) da injeção da peçonha. Adicionalmente, a área sob a curva temporal após 4 h (ASC0-4 h) foi calculada para cada grupo experimental.

4.5.4 Atividade hemorrágica

A atividade hemorrágica de PBe foi avaliada utilizando o modelo de hemorragia de pele, conforme descrito previamente na literatura, com pequenas modificações (ESMERALDINO; SOUZA; SAMPAIO, 2005; KONDO et al., 1960). A hemorragia foi induzida pela injeção intradérmica, no dorso depilado dos animais, de 50 µL de PBS contendo

25 µg de PBe. Após 3 h, os animais foram eutanasiados e a superfície interna da pele foi exposta e fododocumentada. As imagens foram binarizadas e as áreas de cada halo hemorrágico foi mensurada em mm2, utilizando o software ImageJ 1.44p (National Institutes of Health, MD, EUA).

4.5.5 Atividade miotóxica

A atividade miotóxica de PBe foi avaliada conforme descrito previamente na literatura com pequenas modificações (MEBS; EHRENFELD; SAMEJIMA, 1983; RUCAVADO et al., 2000). O dano muscular foi induzido pela injeção, no músculo gastrocnêmio direito, de 50 µL de PBS contendo 50 µg de PBe. Após 3 h, o sangue dos animais foi coletado, incubado por 30 min a 37ºC e então centrifugado a 3.000 g por 15 min para obtenção do soro. O soro de cada animal foi então utilizado para quantificar o nível de creatina quinase (CK), utilizando kits comerciais em um analisador automático Labmax Plenno, de acordo com as recomendações do fabricante (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).

A miotoxicidade indireta também foi avaliada, por meio da quantificação de hemoglobina no tecido muscular injetado com a peçonha. Após a coleta do sangue, os animais foram eutanasiados e os músculos injetados foram dissecados, fragmentados e homogeneizados em 1 mL de reagente de Drabkin. Após incubação em overnight a 8ºC, as amostras foram primeiramente centrifugadas a 3.000 g por 5 min a 4ºC e, logo em seguida, o sobrenadante obtido foi centrifugado a 16.000 g por 30 min a 4ºC. Por fim, 100 µL do sobrenadante límpido obtido foi lido a 540 nm em uma leitora de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA), utilizando reagente de Drabkin como branco. A concentração de hemoglobina (em mg/mL) no músculo foi determinada através de uma curva de calibração utilizando hemoglobina como padrão.