Fase Móvel

Um sistema de HPLC moderno possui vários recipientes para os solventes que constituem a fase móvel, o que permite que a formação desta seja fácil e rápida de obter. Os recipientes são constituídos por material inerte (normalmente vidro) possuindo tampas com abertura apropriada para o tubo que bombeia o solvente. A ponta do tubo imerso no solvente tem um filtro poroso de Teflon, o qual impede que partículas suspensas existentes nos solventes entrem no sistema cromatográfico, o que a acontecer poderia entupir as tubagens ou a coluna e ainda danificar a bomba ou o sistema de injecção. Os gases dissolvidos na fase móvel podem interferir no sistema, por formação de bolhas que causam mau funcionamento da bomba ou uma má resposta do detector, pelo que a desgaseificação dos solventes é de extrema importância sendo obtida por um tratamento ultrassónico sob vácuo prévio à introdução dos solventes nos frascos, fazendo borbulhar um gás inerte de baixa solubilidade (ex. He) nos solventes ou usando uma unidade de desgaseificação. Esta última consiste num sistema de vácuo que remove bolhas de ar que possam existir nos fluxos dos solventes antes de entrar para o sistema.1,5,10

Em HPLC a separação dos compostos é influenciada não só pela interacção relativa dos compostos com a fase estacionária, como também com a fase móvel. A separação dos compostos depende das polaridades das espécies envolvidas, sendo necessário escolher uma fase móvel na qual os compostos sejam solúveis. Nem sempre é possível alcançar uma separação satisfatória em combinação com um tempo de análise adequado usando uma fase móvel constituída apenas por um solvente. Assim, são normalmente utilizadas misturas de solventes. Uma designação para a capacidade de um solvente (ou da fase móvel) em eluir os compostos designa-se por força do solvente, estabelecida através da série eluotrópica; quanto maior a força do solvente, menores são os tempos de retenção associados.1,10,12

Genericamente, existem dois modos de operação, dependendo da forma como a composição da fase móvel varia ao longo da análise cromatográfica. A primeira é designada eluição isocrática na qual a composição da fase móvel é constante. A eluição por gradiente é outra opção, na qual a composição da fase móvel varia no tempo, de forma linear ou por patamares, usando-se dois ou mais solventes com diferentes polaridades, de forma a assegurar a resolução dos compostos. Os solventes mais usados são tipicamente a água, o metanol e o acetonitrilo. Para melhorar a separação e tornar os picos mais simétricos, é possível usar-se soluções tampão na composição da fase móvel de modo a controlar

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principalmente a ionização dos compostos. Há vários tampões vulgarmente utilizados, entre os quais os inorgânicos são os mais usados, tais como o fosfato de potássio ou de sódio.1,5,10,12

Para a formação de fases móveis com vários solventes, as bombas utilizadas têm que possuir um funcionamento binário ou quaternário, de modo a poderem bombear dois ou mais solventes em simultâneo. Os solventes para a fase móvel são então retirados dos recipientes próprios e enviados para o sistema por meio de uma bomba, a qual deve possuir determinadas características nomeadamente criar pressões elevadas, de modo a conseguir bombear a fase móvel através da coluna, não criando um fluxo pulsado nem ruído no detector, permitir fluxos controlados compreendidos entre 0,1 e 10 mL/min e assegurar reprodutibilidade.4,5

As bombas recíprocas são as mais usadas em HPLC e consistem numa pequena câmara para a qual o solvente é bombeado pelo movimento de dois pistões. De um modo genérico, estas bombas possuem duas válvulas que abrem e fecham alternadamente, controlando o fluxo de eluente que entra e sai de um cilindro. Estas bombas têm a desvantagem de causar um fluxo pulsado, o qual pode ser reduzido com recurso a um pulse damper, colocado à saída da bomba e que suaviza a pulsação e mantém o fluxo constante; as principais vantagens são o reduzido volume interno, elevada pressão e fácil adaptação a múltiplos fluxos e modos de operação.4,5

4.4.2. Sistema de Injecção

Ao contrário do que sucede em GC, onde existe disponível uma grande variedade de injectores, em HPLC é utilizado quase em exclusivo um único tipo de injector denominado “sistema de loop”, cujo esquema se encontra reproduzido na figura 4.7.

Este sistema permite a injecção de volumes compreendidos entre 5 e 500 µL, consoante a capacidade do loop, e consiste numa válvula com dois percursos da fase móvel; o primeiro (figura 4.7.a) coloca a fase móvel em equilíbrio com a fase estacionária, ao mesmo tempo que a amostra é introduzida no loop; o segundo (figura 4.7.b) permite que a fase móvel entre no loop arrastando a amostra na direcção da coluna.5,10,12

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Figura 4.7 – Injector por sistema de loop: posição de introdução da amostra(a) e posição de

injecção da amostra no sistema (b) (adaptado de Modern Analytical Chemistry1).

4.4.3. Coluna Cromatográfica

As colunas cromatográficas usadas em HPLC são normalmente construídas em aço inoxidável, com diâmetros internos compreendidos entre 2,1 e 4,6 mm e comprimentos que variam entre 3 e 30 cm, havendo um grande número de diferentes colunas comercialmente disponíveis. São constituídas por partículas porosas de sílica, com tamanhos compreendidos entre 2 e 10 µm, permeáveis ao solvente e com elevada área superficial.1,5 Estas colunas são facilmente degradáveis por quaisquer partículas suspensas na amostra ou na fase móvel que eventualmente entrem na coluna podendo bloqueá-la, bem como por adsorção irreversível de impurezas ou contaminantes na fase estacionária. De forma a minimizar estes problemas é comum usarem-se pré-colunas, que funcionam como um filtro, protegendo a coluna analítica. A pré-coluna tem a mesma fase estacionária que a coluna cromatográfica, sendo mais pequena e menos dispendiosa, facilmente substituída de forma regular.1,4,5,11

No sentido de prevenir a degradação da fase estacionária, esta encontra-se quimicamente ligada à sílica, por reacção desta com um organoclorosilano (Si(CH3)2RCl), em

que R é um grupo funcional alquilo ou alquilo substituído, originando uma estrutura como a exemplificada pela figura 4.8 (cromatografia de fase ligada).1,5,11,12

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Figura 4.8 – Estrutura molecular simplificada de uma fase estacionária quimicamente ligada às

partículas de sílica (adaptado de Quantitative Chemical Analysis4)

As propriedades da fase estacionária dependem da natureza do grupo R; se R for polar, a fase estacionária terá características polares, usando-se uma fase móvel apolar ou moderadamente polar, no que se designa por cromatografia líquida de fase normal. A combinação de uma fase estacionária apolar com uma fase móvel polar é designada por cromatografia líquida de fase reversa, sendo a mais usada em HPLC. Na cromatografia de fase reversa os compostos mais polares são eluídos primeiro; o aumento da polaridade da fase móvel conduz a tempos de retenção mais longos para os restantes compostos, devendo iniciar-se a separação com uma fase móvel relativamente polar, a qual se vai tornando menos polar à medida que decorre a análise. Este tipo de cromatografia é ideal para a análise de compostos polares e mesmo iónicos, não compatíveis com GC. As fases estacionárias mais comuns são aquelas em que R é um grupo n-octilo (C8) ou n-octadecilo (C18 ou octadecilsilica, ODS).1

Em HPLC a coluna também se encontra num forno de temperatura controlada. O aquecimento da coluna cromatográfica normalmente diminui a viscosidade da fase móvel, reduzindo a pressão ou permitindo um fluxo maior, o que diminui os tempos de retenção e aumenta a resolução, pois facilita a difusão dos compostos. No entanto, temperaturas muito elevadas (> 100 °C) podem degradar a fase estacionária.4

4.4.4. Sistema de Detecção

Contrariamente ao que sucede em GC, em HPLC não existem detectores universalmente aplicáveis, sendo por isso necessário utilizar o detector mais adequado à natureza das substâncias a analisar. As características para um detector em HPLC são as mesmas anteriormente apresentadas para GC (vd. 4.3.4).

73 Os detectores mais usados são os baseados em medidas espectroscópicas, como a absorção no UV-vis e a fluorescência. Um detector de HPLC baseado na absorção dos compostos na região do UV-vis é essencialmente um espectrofotómetro de UV-vis que mede a absorvância de um composto obedecendo à lei de Lambert-Beer e registando a variação de concentração do composto. À medida que os compostos começam a ser eluídos, a absorvância muda, traçando-se um pico no cromatograma, o qual corresponde à absorvância em função do tR.1,10,11

O detector mais usado consiste num selector de comprimento de onda (λ) variável ou por rede de díodos (DAD). Este último apresenta a vantagem de vários λ serem monitorizados em simultâneo com registo do espectro total dos compostos obtendo-se assim um cromatograma tridimensional, com a absorvância não só em função de tR, mas também do λ.

Neste tipo de detector, a luz da fonte passa através da célula de fluxo, dispersando-se e atingindo um conjunto de fotodíodos, cada um deles a monitorizar um dado λ.1,4,5,10,12

Existem duas limitações no uso deste tipo de detector: a fase móvel não pode absorver ao λ seleccionado (> cut-off)e os compostos necessitam ter propriedades cromóforas, pelo que se trata de um detector selectivo. Estes detectores permitem limites de detecção entre 100 pg a 1 ng de composto injectado.1,10 Para se alcançarem limites de detecção mais baixos, é possível usar como detector um espectrómetro de massa, hifenado com um cromatógrafo líquido. Em comparação com outros detectores mais usados, o LC-MS é relativamente dispendioso, havendo por isso necessidade de obter vantagens consideráveis associadas ao seu uso, uma das quais se encontra no facto de permitir uma melhor identificação da identidade do composto.

4.4.5. Sistema de Aquisição e Tratamento de Dados

As características dos sistemas de aquisição e tratamento de dados são as referidas em 4.3.5. No caso do HPLC, não existem bibliotecas de espectros de UV-vis mas é possível criá-las a partir dos compostos puros; quando se utiliza MS é possível comparar os dados espectrais obtidos a partir dos compostos puros com os obtidos em amostras.5

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4.5. Referências Bibliográficas

[1] D. Harvey, Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill Companies, Inc., International Edition, EUA, 2000.

[2] H. M. McNair, J. M. Miller, Basic Gas Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., 2ª Edição, EUA, 2009.

[3] J. M. F. Nogueira, Química nº 100, Revista da Sociedade Portuguesa de Química, Portugal, Janeiro a Março de 2006.

[4] D. C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, W. H. Freeman and Company, 6ª Edição, EUA, 2003.

[5] D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, Principles of Instrumental Analysis, Saunders College Publishing, 5ª Edição, EUA, 1998.

[6] A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, Kluwer Academic Publishers, 5ª edição, Holanda, 1999.

[7] H. J. C. das Neves, A. M. C. Freitas, Introdução à Cromatografia Gás-Líquido de Alta

Resolução, Dias de Sousa, Lda, Portugal, 1996.

[8] R. L. Grob, E. F. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., 4ª Edição, Hoboken, EUA, 2004.

[9] http://masspec.scripps.edu/ (consultado em 28/07/2009).

[10] J. Kenkel, Analytical Chemistry for Technicians, CRC Press, 3ª Edição, EUA, 2003.

[11] W. M. A. Niessen, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, Taylor and Francis Group, 3ª Edição, EUA, 2006.

[12] R. E. Ardrey, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry: An Introduction, John Wiley & Sons, Reino Unido, 2003.

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Técnicas Microscópicas e 

Espectroscópicas 

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