Imuno-histoquímica

O diagnóstico citomorfológico das leucemias é bem estabelecido há vários anos. Entretanto, nos linfomas, o diagnóstico citológico usualmente exige a confirmação histopatológica (HARRIS et al., 2000b; BENNET et al., 1976). Em alguns casos, procedimentos cirúrgicos e invasivos são necessários para obter um material adequado e um diagnóstico confiável. Algumas intervenções cirúrgicas podem atrasar o início do tratamento por não serem possíveis em pacientes graves ou devido aos riscos perioperatórios.

Esse diagnóstico e a classificação dos linfomas anteriormente baseada na morfologia, passaram pela caracterização imuno-histoquímica até chegar à classificação atual da WHO (SWERDLOW et al., 2008).

Atualmente, o estudo morfológico dos cortes histológicos ainda é a base do tratamento dos linfomas, sendo a imuno-histoquímica a técnica auxiliar mais utilizada. A imuno-histoquímica é utilizada tanto para diferenciar um processo neoplásico de um reacional, quanto para classificar os linfomas (HSI et al., 2001). Além disso, crianças com neoplasias linfóides podem ser adequadamente caracterizadas através da combinação da citomorfologia, imunofenotipagem, genética e apresentação clínica (HARRIS et al., 2000b; BENNET et al., 1976). Na presente casuística o diagnóstico foi baseado nos dados clínicos, morfológicos e na análise fenotípica, seja pela imuno-histoquímica ou pela imunofenotipagem através da citometria de fluxo.

A imuno-histoquímica é realizada a partir de cortes de tecidos fixados em parafina. Utilizam-se anticorpos específicos que reconhecerão antígenos expressos na célula tumoral. A escolha dos antígenos a serem usados na imuno-histoquímica, baseia-se inicialmente na citomorfologia do corte histológico corado pela hematoxilina-eosina e nos dados clínicos.

A imuno-histoquímica foi refeita nas 30 amostras recuperada nos arquivos do Departamento de Anatomia Patológica. As 46 imuno-histoquímicas restantes já possuíam o painel adequado para a classificação ou foram utilizados os resultados do estudo anterior (ALVIM, 1994). Nesta última

situação, isso foi necessário devido à impossibilidade de localizar os blocos contendo o espécime para o diagnóstico.

Este estudo analisou inicialmente os cortes histológicos corados pela hematoxilina-eosina. A partir dessa primeira análise, foi feito um painel de anticorpos baseado no diagnóstico morfológico. Neste estudo reclassificou-se retrospectivamente um caso para linfoma de Hodgkin, baseado na morfologia e confirmado pela positividade do CD30. De forma similar, o Non-Hodgkin’s Lymphoma Classification Project (1997) observou que 1,8% dos casos diagnosticados como LNH não eram, realmente, LNH.

A interpretação da imuno-histoquímica necessita que a análise seja feita por um profissional experiente. Não é recomendado que o diagnóstico seja feito somente com base em um único anticorpo, mas que haja integração entre a positividade e a negatividade de um painel de anticorpos (PERKINS et al., 2007). Cada tipo de LNH tem antígenos que podem ser mais ou menos específicos para ele (SWERDLOW et al., 2008). O diagnóstico diferencial é baseado nos achados clínicos e morfológicos que orientarão a escolha dos anticorpos a serem testados.

Um painel simples de anticorpos foi utilizado na República Tcheca (KAVAN et al., 1999). O diagnóstico foi feito através da morfologia citológica, a presença da imunoglobulina de superfície (sIg) para identificar o linfoma de Burkitt, sIg, CD 19 e CD20 positivos para os outros subtipos B e Ki-1 para o linfoma anaplásico de grandes células. Com o desenvolvimento de técnicas mais apuradas e maior disponibilidade de anticorpos, os painéis para imuno-histoquímica se tornaram mais direcionados para cada subtipo. O protocolo francês LMB89 definiu a linhagem de célula B madura pela reatividade ao CD10, CD19, CD20, CD22, e CD24 (PATTE et al., 2001). Para identificação dos linfomas linfoblásticos o Children’s Oncology Group utilizou CD 79a, CD20, CD1a, CD3, CD5, CD 45 Ro e CD43 (ABROMOWITCH et al., 2008)

No presente estudo foram utilizados os marcadores TdT, CD20, CD79a, CD45Ro, CD 10, CD30 e Ki67. Um painel de anticorpos semelhante ao deste estudo foi realizado com CD20, CD79a, CD3, CD45Ro, CD43, CD68, CD15 e CD30 e ALK para diagnóstico de linfoma de grandes células anaplásicas ( LE DELAY et al., 2008). O CD 43 é encontrado em neoplasias de célula T (LLA e LNH), o CD68 nos linfomas histiocíticos e o CD15 auxilia o diagnóstico de linfoma de Hodgkin.

Dentre os 98 pacientes da presente casuística, 72 (73,5%) eram do fenótipo B, 18 (18,4%) do fenótipo T e oito (8,2%) indeterminado. A indisponibilidade regular dos marcadores imuno- histoquímicos em nosso meio dificulta a classificação imunofenotípica dos LNH. Esses valores foram muito semelhantes a outro estudo brasileiro onde se observou que 75,7% dos pacientes eram da linhagem B, 18,2% de linhagem T e 6,1% tinham histologia anaplásica (PEDROSA et al., 2007). A maior frequência do LNH de linhagem B é evidenciada pela grande disponibilidade de estudos

com esse subtipo, muitos deles com grande número de pacientes (WOESSMANN et al., 2005; PATTE et al., 2001, 2007; AMYLON et al., 1999; REITER et al., 1999; BOWMAN et al., 1996)

Na presente casuística o painel mínimo incluiu anticorpos para definição de linfoma de linhagem B e T, linfoma linfoblástico, linfoma de Burkitt linfoma de grandes células devido à maior frequência desses tipos na faixa etária estudada (CAIRO et al., 2005). O alto custo dos anticorpos utilizados na imuno-histoquímica também foi um fator de adequação do painel fenotípico mínimo.

A realização de um painel fenotípico mínimo neste estudo contribuiu para um diagnóstico mais preciso do tipo de LNH. Isso foi evidenciado pelos oito diagnósticos que mudaram após a análise da imuno-histoquímica, mesmo que parcial. Além da mudança do diagnóstico, a imuno- histoquímica também proporcionou o aperfeiçoamento do mesmo. Esse exame possibilitou a classificação da maioria dos pacientes desta casuística.

Como era de se esperar, a imuno-histoquímica completa possibilitou a mudança de diagnóstico em mais crianças do que o exame parcial (seis e dois casos, respectivamente). O mesmo ocorreu quando houve o aperfeiçoamento do diagnóstico (oito casos com exame completo e quatro com exame parcial).

É interessante observar, também, que apenas a análise morfológica possibilitou o diagnóstico em 19 (19,4%) dos casos nos quais a imuno-histoquímica não alterou a classificação. Todos esses casos eram de linfoma de Burkitt, mostrando que as características típicas desse linfoma auxiliam muito o diagnóstico.

A imunofenotipagem pode ser feita em suspensão de células “frescas” utilizando a citometria de fluxo. O painel de anticorpos usados também se baseia na suspeita diagnóstica. A citometria de fluxo é útil no diagnóstico preliminar de LNH do tipo Burkitt e linfoblástico (MANN et al., 2006).

Nesta casuística foi feita a imunofenotipagem de nove pacientes: três com espécime do líquido ascítico (linfoma de Burkitt) e seis do líquido pleural (dois linfoma de Burkitt e dois linfoma linfoblástico T, dois linfoma linfoblástico sem definição, se B ou T).