MÉTODOS LABORATORIAIS

Todos os exames laboratoriais para o diagnóstico e a evolução do LNH foram realizados no Laboratório Central do HC-UFMG, exceto em um paciente (número 96) que foi diagnosticado e tratado inicialmente na Fundação Benjamim Guimarães e posteriormente transferido para o hospital.

Os pacientes que, após anamnese e exame físico, tinham indicação clínica de provável acometimento tumoral primário realizavam uma avaliação laboratorial inicial que incluía exames hematológicos (hemograma e coagulograma) e bioquímicos. Dentre os exames bioquímicos foram feitas a dosagens séricas de LDH, função renal (uréia e creatinina) e hepática (fosfatase alcalina, transaminases oxalacética e pirúvica), além da dosagem sérica de ácido úrico. O exame de dosagem sérica de desidrogenase láctica foi disponibilizado no HC-UFMG a partir do ano de 1987.

O diagnóstico definitivo foi feito com uma amostra do tumor. Essa amostra foi obtida através de biópsia (a céu aberto ou guiada por métodos de imagem) ou citologia oncótica de líquido pleural ou ascítico. Muitas vezes foi necessária a laparotomia para a realização do diagnóstico nas manifestações abdominais. O espécime tecidual obtido deveria ser suficiente para permitir estudo morfológico, imunofenotipagem, imunohistoquímica, citogenética e estudo molecular. O diagnóstico morfológico foi feito por vários patologistas do Serviço de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG. Foram avaliadas lâminas fixadas em parafina e coradas em hematoxilina-eosina para avaliar a morfologia. Em 30 casos foi feita a avaliação das lâminas por uma única profissional do Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG. Não houve, portanto, revisão sistemática de todas as lâminas por não terem sido localizados todos os blocos de parafina com a amostra do tumor.

A análise imunofenotípica utilizou anticorpos de especificidade variável para detectar antígenos celulares (de superfície, citoplasmáticos ou nucleares) em suspensões de células

(citometria de fluxo) ou em cortes de tecidos das peças originais congeladas ou incluídos em parafina (imuno-histoquímica).

A imuno-histoquímica constou de um painel de anticorpos para diagnóstico de LNH e diferenciação das populações celulares B ou T. O painel de anticorpos utilizado foi então constituído por um marcador de células precursoras B e T (TdT), marcadores linfóides pan-B (CD20, CD79a) e marcadores linfóides pan-T (CD45Ro/UCHL-1, CD3) para diferenciar os dois grandes grupos. Foram utilizados os marcadores CD10 para auxiliar na identificação dos linfomas de Burkitt e CD30 e Ki67 nos linfomas de grandes células.

Foi realizada a busca dos blocos de parafina, com cortes dos tecidos da amostra tumoral dos pacientes incluídos na análise, e posteriormente, foram preparadas lâminas coradas pela hematoxilina e eosina (HE) naqueles encontrados. Nos blocos de parafina recuperados, foram realizados cortes histológicos corados em hematoxilina-eosina (HE) e, do bloco mais representativo da doença, cortes para o exame inuno-histoquímico.

Escolhido o melhor bloco de parafina, foram feitos novos cortes histológicos e colocados dois em cada lâmina de vidro adequada para o exame (com carga elétrica para melhor aderência dos cortes). A seguir as lâminas com os cortes foram aquecidas a 70oC em estufa, por no mínimo 20 minutos, os cortes desparafinados com xilol e reidratados em soluções de álcool etílico em concentrações decrescentes.

Foi realizado, então, o bloqueio da peroxidase endógena para não haver interação entre as peroxidases (enzimas) existentes no tecido em análise. O bloqueio foi feito imergindo as lâminas em solução de peróxido de hidrogênio a 3% em Metanol, preparada momentos antes do uso, por 30 minutos. As lâminas foram então novamente mergulhadas em tampão fosfato salino (PBS). As peroxidases teciduais ficam “impedidas” de se ligarem ao revelador diamino-benzidina (DAB) que irá conferir cor à região do antígeno pesquisado; apenas as peroxidases que estão ligadas ao sistema revelador vão interagir com ele.

Na próxima etapa os cortes são imersos em tampão de citrato 0,01 mmol/L em pH 6,0 ou tampão de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), em pH 9, aquecidos em panela a vapor até atingirem a temperatura de 95oC por 20 minutos, para que ocorra a recuperação dos antígenos. Essa recuperação é feita quebrando-se as pontes aldeídicas formadas devido à exposição prolongada do tecido ao formol, e expondo-se os sítios antigênicos do antígeno à superfície para que o seu anticorpo específico a eles se ligue.

A partir daí as lâminas foram resfriadas à temperatura ambiente, ainda mergulhadas no citrato ou no EDTA. Em seguida foram mergulhadas em três banhos de PBS.

Logo após, foi feito o bloqueio de proteínas com a imersão das lâminas em solução de leite desnatado Molico® (30 g para cada 200 ml de PBS diluído em 1:100) por 15 minutos. As lâminas foram novamente lavadas com PBS diluído para remoção completa do excesso do leite.

Cada lâmina foi então secada ao redor dos cortes histológicos e gotejados aproximadamente 50 l do anticorpo primário previamente diluído e designado para cada um dos antígenos pesquisados no corte, por no mínimo 50 minutos e em seguida lavada em PBS diluído. A tabela 11 mostra os anticorpos utilizados e suas diluições.

Tabela 11: Anticorpos utilizados para imuno-histoquímica

Antígeno xxxxxxxClonexxxxxxx xxxxxMarcaxxxxx xxxxxDiluiçãoxxxxx

TdT CD79a CD20 CD3 CD45RO CD10 CD30 Ki67 policlonal JCB117 L26 policlonal UCHL-1 56C6 BerH2 Mib1 Dako® Dako® Dako® Dako® Dako® Dako® Dako® Dako® 1/40 1/20 1/40 1/90 1/50 1/10 1/10 1/50

A reatividade foi detectada através da incubação com anticorpos secundários e um complexo estreptavidina-biotina-peroxidase. Nas reações onde foram utilizados anticorpos com expressão de membrana, foram consideradas positivas as amostras cuja coloração da membrana das células neoplásicas estava distinta da coloração de fundo para a maioria dos anticorpos. Para os CD3 e CD10, além da coloração da membrana, identificou-se também a coloração intracitoplasmática. Para TdT e Ki-67 considerou-se marcação positiva a coloração nuclear.

Em todas as lâminas onde foi feita a reação imuno-histoquímica, controles internos (células normais positivas para aquele antígeno) foram procurados para confirmar a positividade ou negatividade das células neoplásicas.

Todos os casos foram reclassificados utilizando-se os critérios da classificação WHO. Para os casos onde a classificação correta não foi possível, os LNH foram classificados como de células B ou T de acordo com o painel da imunohistoquímica.

A aspiração da medula óssea para mielograma foi realizada, na maioria dos casos, na crista ilíaca posterior. O esfregaço medular avaliou o acometimento medular para se estabelecer o estadiamento. O envolvimento medular foi definido como uma porcentagem de blastos entre cinco e 25%. Os casos com taxa superior a 25% foram considerados como leucemia linfoblástica e excluídos da casuística. A biópsia de medula óssea também foi utilizada em alguns casos para avaliar o acometimento medular.

A punção lombar foi feita para avaliar a presença de blastos no líquor, independente da existência de sintomas neurológicos. Foi feito o estudo citológico do líquor obtido e analisado a presença de células. Entretanto os resultados desse exame não foram localizados em alguns prontuários. Foi considerado acometimento meníngeo quando o número de mononucleares no líquor era superior a 5/mm3 e havia evidência morfológica de linfoblastos.