Influência da temperatura final de armazenamento sobre as características físicas e

de armazenamento sobre as

características físicas e fertilidade do sêmen resfriado e/ou transportado de equídeos

A redução da temperatura auxilia na conservação do sêmen por redução do crescimento bacteriano e do metabolismo espermático, com controle subsequente da acidificação do meio diluidor. Ressalta-se, ainda, a redução da formação de espécies reativas de oxigênio, principalmente, quando associada à redução da oxigenação, favorecendo o metabolismo anaeróbico em detrimento do aeróbico (Katila, 1997; Squires et al., 1999; Aurich, 2008).

A utilização da temperatura como conservante do sêmen tem sido amplamente utilizada na indústria equestre (Raphael, 2007; Aurich, 2008). A manutenção do sêmen sob estado líquido, em detrimento do congelado, têm sido de grande importância comercial, devido não somente ao menor custo do processamento para o resfriamento do sêmen quando comparado ao congelamento, mas também à baixa fertilidade do sêmen congelado envolvendo um grande percentual de garanhões (Varner et al., 1989; Tischner e Kosiniak, 1992) e jumentos (Trimeche et al., 1998; Canisso, 2008), principalmente, quando da inseminação de jumentas.

Nishikawa e Sugie (1949) definiram que os extremos de temperatura em que os espermatozóides equídeos poderiam sobreviver eram de 54-56°C positivos à 17- 18°C negativos. Verificaram, ainda, que temperaturas acima de 50°C e abaixo de 0°C reduziam significativamente a viabilidade espermática, concluindo que temperaturas entre 2-4°C foram ideais para o armazenamento do sêmen.

Segundo Amann e Graham (1993), o resfriamento induz efeitos mais marcantes na

fertilidade do que na motilidade espermática, uma vez que outros elementos na membrana celular podem sofrer alteração com a queda da temperatura, tais como as proteínas envolvidas no transporte de íons. A diminuição da capacidade enzimática, do transporte de proteínas, a perda de lipídios e de potássio são outros danos observados durante o resfriamento (Pickett e Komarek, 1966; Amann e Graham, 1993; Drobnis et al., 1993).

Em uma ampla revisão, Tischner (1975) apresentou evidências de que a estocagem do sêmen equino à 4°C resultou em menores taxas de concepção que as obtidas quando o sêmen foi armazenado a temperatura ambiente ou a 17°C. Já Palmer (1984), obteve melhor fertilidade (38%) quando as éguas foram inseminadas com sêmen equino diluído em leite e resfriado por uma hora a 5°C, em comparação ao sêmen resfriado a 20°C (21%). Ao contrário, Province et al. (1985) observaram motilidade espermática e fertilidade superiores quando o sêmen foi mantido à temperaturas entre 15 e 20°C, em comparação à 5°C, durante o armazenamento entre 4 e 12 horas.

Tem sido observado que uma redução de 10°C na temperatura do sêmen, provocou um declínio de 50% no metabolismo espermático, sendo que à temperatura de 5°C, apenas 10% do metabolismo é necessário para que os espermatozóides mantenham-se viáveis (Squires et al., 1999).

O efeito da temperatura de armazenamento sobre as características físicas do sêmen equino diluído em diluidor a base de leite desnatado-glicose foi avaliado por Varner et al. (1988). Neste estudo, avaliaram-se as amostras de sêmen às 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a coleta. A longevidade espermática foi bastante reduzida quando os espermatozóides foram armazenados à 37°C, em comparação ao que se observou quando de sua manutenção à temperaturas mais baixas (25 ou 4ºC). Às seis horas de armazenamento os valores médios de motilidade espermática total do sêmen

armazenado a 37°C, à 25°C ou à 4°C foram de 5,4±1,1; 79,8±1,6 e 82,1±1,6%; respectivamente. As motilidades espermáticas total e progressiva do sêmen refrigerado a 4°C foram superiores (P < 0,05) às do sêmen refrigerado à 25°C, para cinco dos sete períodos (24 a 120 h), enquanto a velocidade espermática do sêmen resfriado a 4°C (P < 0,05) foi maior que a do sêmen refrigerado à 25°C para todos os períodos avaliados. Alguns estudos têm mostrado uma superioridade da qualidade seminal quando da sua conservação a 5°C em comparação a 20°C (Varner et al., 1988). Assim, quando utilizou-se diluidores a base de leite, temperaturas entre 4 e 6°C preservaram melhor a motilidade dos espermatozóides em relação ao armazenamento entre 0 e 2°C. Entretanto, para o mesmo diluidor, a temperatura de armazenamento de 4°C foi superior à de 20°C. Por outro lado, observou- se uma melhor manutenção da motilidade espermática a 20°C em comparação às de 10 e 5°C, quando utilizou-se diluidores que não continham leite em sua composição (Magistrini et al., 1992).

Diferentes resultados de fertilidade, de acordo com as temperaturas finais e tempo de armazenamento do sêmen, foram apresentados por Guay et al. (1989): 5°C/24h (48,57%), 5°C/48h (43,33%), 14,5°C/2h (58,06%); 20,0°C/2h (79,41%); 20°C/24h (39,28%); 20°C/48h (13,33%). Neste trabalho, observou-se que de um modo geral, a motilidade espermática não foi afetada pela temperatura final de armazenamento. Entretanto a única temperatura que limitou o crescimento de Pseudomonas aeruginosa foi a de 5°C.

Zidane et al. (1991) também observaram alta contaminação do sêmen diluído em diluidor de leite em pó desnatado-glicose e mantido a 20°C por 48 horas com Pseudomonas aeruginosa, que inviabilizou este tratamento devido à redução da fertilidade, acompanhada por severa endometrite em 3 das 14 fêmeas inseminadas (21,43%). O resfriamento a 5°C respondeu por uma maior taxa de recuperação

embrionária em éguas inseminadas com sêmen resfriado por 24-48 horas.

Batellier et al. (1998) comparando os diluidores INRA 96® e Kenney ou INRA 82®, observaram que a taxa de concepção por ciclo foi superior para o sêmen diluído no INRA96® e armazenado a 15°C, quando comparado ao diluído nos diluidores de Kenney ou INRA82® (avaliados conjuntamente) e armazenado a 4°C, ambos por 24 horas (57% e 40%, respectivamente). Além disso, o sêmen diluído no diluidor INRA96® manteve a mesma taxa de concepção quando o sêmen foi armazenado a 5°C. Com base nesses resultados, os autores sugeriram que o armazenamento do sêmen à 15°C protege a membrana dos espermatozóides das injúrias causadas pelo ―cold shock‖ (choque pelo frio), especialmente, nos garanhões cujo sêmen não suporta resfriamento à temperatura de 4°C, o que pode ser uma alternativa para estes casos. Entretanto, para tempos de armazenamento superiores à 24 horas, a temperatura final entre 4-6ºC parece ser mais adequada para a manutenção das características físicas do sêmen (Varner et al., 1988).

Love et al. (2002) demonstraram que a desnaturação do DNA espermático de garanhões ocorreu em diferentes velocidades, dependendo da temperatura de armazenamento do sêmen. Assim, quando os espermatozóides foram armazenados à 5°C, em diluidor a base de leite, observou-se manutenção da qualidade da cromatina espermática, sem alterações na taxa de desnaturação do DNA ao longo de 46 horas de armazenamento. Entretanto, nos espermatozóides armazenados à 20°C, observou-se desnaturação moderada, verificando-se naqueles armazenados à 37°C altas taxas de desnaturação do DNA.

A maior parte da literatura referente ao resfriamento do sêmen asinino adota como temperatura final de armazenamento à de 5ºC sem, no entanto, ter havido um estudo prévio, visando-se estabelecer se esta temperatura é a mais adequada para esta espécie. Diante disto,

Cottorello et al. (2002) avaliaram o efeito de diferentes diluidores e temperaturas de armazenamento sobre a motilidade e o vigor espermáticos do sêmen asinino. Neste estudo, foram utilizados três diluidores: diluidor a base de leite desnatado, diluidor Baken (3% de gema de ovo) e Baken modificado (10% de gema de ovo), associados à três temperaturas de armazenamento: 0, 5 ou 10ºC. O sêmen foi armazenado por seis dias. Independentemente da temperatura de armazenamento, observou- se que os diluidores Baken foram superiores ao diluidor a base de leite, para a manutenção da atividade espermática. No segundo dia de armazenamento, enquanto a maior parte dos espermatozóides apresentava-se inativa no diluidor a base de leite, a motilidade foi superior a 30% nos diluidores Baken.

Para os diluidores Baken e Baken modificado, Cotorello et al. (2000) observaram que a temperatura de 10ºC tendeu a ser menos eficiente que às de 5 ou 0ºC. Para o diluidor contendo 10% de gema de ovo (Baken modificado) não foram observadas diferenças entre as temperaturas de 0 ou 5ºC. No que se refere ao diluidor contendo menor proporção de gema de ovo (Baken – 3% de gema de ovo), observou-se que a temperatura de 5ºC foi superior para a manutenção das características físicas do sêmen. A temperatura de armazenamento de 10ºC foi superior à de 0ºC apenas para o sêmen diluído em diluidor a base de leite desnatado (Cottorello et al., 2000).

Em um experimento conduzido por Ferreira (1993), o sêmen asinino diluído em diluidor a base de leite ou de gema de ovo e mantido à temperatura ambiente (28 a 30°C) resultou em motilidade espermática inferior à 10%, nas primeiras 24 horas de armazenamento. Entretanto, quando submetido ao resfriamento a temperaturas entre 4-6°C, o sêmen diluído em diluidor lactose – gema de ovo manteve uma motilidade espermática superior à 10%, por até 96 horas. Tal observação vai de encontro ao proposto por Varner et al. (1988) e Brinsko e Varner (1993), de que o armazenamento à temperatura ambiente ocasiona um déficit energético, enquanto o

abaixamento da temperatura (4-6°C) promove mudanças no metabolismo espermático de forma a equilibrar as suas reservas. Assim, Beker (1997) observou uma motilidade progressiva superior à 10% por até 120 horas para o sêmen asinino resfriado a 5°C.

Diferentes temperaturas de armazenamento do sêmen foram utilizadas por Serres et al. (2002), quando avaliaram o comportamento das células espermáticas do jumento, submetidas ao resfriamento à 4°C, 15°C ou 20°C, por até 96 horas. Os espermatozóides armazenados à 4°C e 15°C mantiveram sua viabilidade por até 96 horas, não havendo diferenças entre as mesmas quanto às motilidades total e progressiva, nos diferentes tempos de avaliação. Já o sêmen mantido a 20°C manteve-se viável por até 48 horas; entretanto, apresentou motilidades total e progressiva e integridade de membrana inferiores às observadas quando utilizaram-se temperaturas mais baixas de armazenamento. Quanto à integridade da membrana espermática, esta foi mais bem preservada à 15°C do que à 4°C ou à 20°C.

Também Dalmau (2003) avaliou o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento sobre a viabilidade do sêmen asinino. Desconsiderando-se os efeitos dos diluidores utilizados, a motilidade progressiva foi mantida a valores iguais ou superiores a 30%, por período similar quando o sêmen foi armazenado a 4°C ou à 15°C (39,5 e 35,71 hoeas, respectivamente), tempo superior ao observado para o sêmen armazenado a 20°C (12,03 horas). Observou-se, ainda, uma viabilidade espermática superior à 90 horas, no sêmen diluído no diluidor INRA82® e resfriado a 4°C.

Rozas (2005) estudou os efeitos da adição de complexos colesterol – ciclodextrina (CLC’s) e da temperatura de armazenamento (4 ou 15°C) sobre os parâmetros espermáticos motilidade total (MT) e progressiva (MP) e integridade de membrana, durante o armazenamento do sêmen asinino. Às 24 horas de armazenamento observou-se apenas efeito do tratamento sobre os parâmetros

avaliados, com superioridade dos grupos tratados com CLC’s, sem diferenças entre as temperaturas de armazenamento. Às 48 horas de armazenamento, os melhores resultados de MT e MP permaneceram associados ao sêmen previamente tratado com CLC’s (p<0,0001). Além disso, a porcentagem de espermatozóides com membrana plasmática integra foi ligeiramente superior nas amostras armazenadas à 15°C. Após 72 horas de armazenamento, os tratamentos não apresentando CLC’s em sua constituição, resultaram nos piores resultados de MT e MP, especialmente, quando se conservou o sêmen à 4°C (p<0,05). Já as amostras tratadas com CLC’s apresentaram MT e MP ligeiramente superiores quando armazenadas à 4°C. Não foram observadas diferenças significativas quanto à integridade de membrana; entretanto, melhores resultados foram associados à temperatura de 15°C. Apenas as amostras tratadas com CLC’s e armazenadas à 5°C apresentaram motilidade total superior à 30% após 72 horas de armazenamento. Baseando-se na motilidade progressiva acima de 30%, Contri et al. (2010) obtiveram uma viabilidade espermática por até 120 horas, quando o sêmen foi diluído no diluidor INRA 96® e resfriado a 5°C.

Inexiste na literatura atual estudos comparando o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento do sêmen sobre a taxa de concepção de éguas inseminadas com sêmen asinino. Neste sentido, para inseminação de éguas, Ferreira (1993) armazenou o sêmen asinino à 5°C por 24 ou 48 horas e obteve altas taxas de concepção, de 80,00 e 75,90% respectivamente, sendo estes valores similares aos obtidos quando da utilização do sêmen fresco diluído (82,70%). Em trabalho conduzido por Rozas (2005), a taxa de concepção obtida na inseminação de jumentas com sêmen asinino armazenado a 15°C foi de 26% e 41%, em duas estações de monta consecutivas.

Também utilizando uma temperatura final de 5°C para o armazenamento do sêmen de

jumentos da raça Pêga, Rossi (2008) obteve taxas de concepção/ ciclo de 49,74% em éguas, para o sêmen armazenado por até 12 horas, e de 58,44% para o sêmen fresco diluído. Apesar de não ter sido realizada comparação estatística entre estes valores, numericamente, as taxas de concepção obtidas foram próximas. Vidament et al. (2009) resfriaram o sêmen de jumentos à 4°C por até oito horas antes da inseminação e obtiveram taxa de concepção por ciclo de 45% inseminando éguas e jumentas.

Buscando na literatura dados disponíveis a respeito da taxa de concepção de éguas inseminadas com sêmen asinino fresco ou fresco/diluído, observou-se apenas quatro publicações. Em 1954, Jordão et al. avaliaram a fertilidade de 259 éguas cobertas por monta natural com 28 jumentos. No decorrer de 14 estações de monta, a taxa de concepção média foi de apenas 35,9%. Silva (1988) obteve taxas de concepção de 68,3% à 92,1% ao utilizarem sêmen fresco diluído em diluidor a base de lactose-gema de ovo. Leite (1994), ao utilizar uma dose inseminante contendo 400 x 106 espermatozóides móveis, observou uma taxa de concepção por ciclo de 70%. Em Cuba, Díaz et al. (2009) registraram taxas de concepção de 32,08% em 134 éguas cobertas por monta natural e de 53,80% em éguas inseminadas com sêmen de jumentos, diluído em diluidor a base de leite. Confrontando estes achados com os resultados obtidos por Ferreira (1993), Boeta e Quintero (2000), Vidament et al. (2009) e Rossi (2008), o resfriamento do sêmen à 4-5°C por até 24 horas parece preservar as características seminais sem acarretar prejuízos à fertilidade das éguas inseminadas.

2.1.1.11. Efeito do tempo de estocagem