Outros aditivos

O armazenamento do sêmen diluído por longos períodos, mesmo que à baixas temperaturas, pode resultar em crescimento bacteriano na ausência de antibióticos (Burns et al., 1975). Dentre os antibióticos mais utilizados nos diluidores seminais destacam- se a penicilina G potássica, a estreptomicina, a amicacina, a polimixina B e a kanamicina (Jasko et al., 1993).

Varner et al. (1993) comparam o efeito da adição de penicilina G (1000UI/mL) e/ou sulfato de amicacina (1000µg/mL) a um diluidor a base de leite sobre a viabilidade espermática de garanhões. Após 24 horas de armazenamento, a adição dos dois antibióticos foi benéfica, sendo que o sêmen diluído na presença de penicilina e amicacina apresentou uma viabilidade espermática superior à do sêmen diluído, na ausência de antibióticos.

Ao utilizar um diluidor a base de gema, Beker (1997) avaliou os efeitos da adição de penicilina G potássica e sulfato de estreptomicina sobre as características físicas do sêmen asinino resfriado. Na maioria das observações, a motilidade total foi superior no diluidor sem antibiótico, no transcorrer da preservação do sêmen, desde a avaliação feita pós-diluição até o quarto dia de armazenamento. Similarmente ao que observou-se para a motilidade total, a motilidade progressiva apresentou resultados superiores nas amostras armazenadas na ausência de antibiótico, dos dias um a quatro pós-coleta.

Outras substâncias têm sido adicionadas aos diluidores a base de leite, visando preservar as características espermáticas durante um período de armazenamento maior. Neste sentido, Heiskanen et al. (1987) verificaram que a adição de Hepes e teofilina ao diluidor a base de leite em pó desnatado-glicose, proposto por Kenney et al. (1975), beneficiou o armazenamento do sêmen equino por longos períodos. O Hepes proporcionou a manutenção de um pH constante durante a estocagem, enquanto a teofilina exerceu efeito estimulatório sobre as células espermáticas.

Neste experimento, obteve-se taxas de concepção, ao primeiro ciclo, de 82% e 70%, respectivamente, para o sêmen diluído no diluidor de Kenney original ou suplementado com Hepes e teofilina, e armazenado por 24 horas. Posteriormente, utilizando o mesmo diluidor de Kenney modificado pela adição de Hepes e teofilina, Heiskanen et al. (1994) obtiveram uma viabilidade espermática por até 80 horas, obtendo uma taxa de concepção por ciclo de 65%, quando da utilização do sêmen armazenado por 70 - 80 horas a 5-7°C. A baixa relação entre colesterol: fosfolípides na membrana espermática dos equídeos tem sido incriminada como determinante de sua maior sensibilidade aos processos de criopreservação (Amann e Pickett, 1987). Diante disso, vários estudos foram conduzidos na tentativa de se aumentar a relação colesterol: fosfolípides, quando incorporou-se colesterol à membrana espermática de equídeos utilizando a ciclodextrina como carreador.

A ciclodextrina é um oligossacarídio macrocíclico, solúvel em água, que contém um centro hidrofóbico capaz de acomodar substâncias apolares, formando complexos de inclusão e aumentando sua solubilidade em meios aquosos (Pitha et al., 1988). As - ciclodextrinas têm afinidade preferencial por esteróides quando comparados a outros lipídios e, devido à sua especificidade relativamente alta pelo colesterol, tem sido sugerido que estes compostos podem ser efetivos na modificação do metabolismo do colesterol (Yancey et al., 1996).

O uso de ciclodextrinas para a incorporação de colesterol às membranas plasmáticas foi relatado primeiramente por Klein et al. (1995), utilizando células miometriais. A habilidade da metil- -ciclodextrina e seu complexo de inclusão com colesterol em alterar o conteúdo desse esteróide na membrana plasmática, se deve à formação de uma nova reserva contendo colesterol na fase aquosa. Esta reserva é rapidamente envolvida num equilíbrio entre o colesterol ligado à membrana e o colesterol complexado com a

ciclodextrina. A incubação das células com a ciclodextrina isoladamente provoca a retirada do colesterol da membrana, estando o equilíbrio voltado para o complexo de inclusão (Atger et al., 1997). Inversamente, a incubação da membrana plasmática desprovida de colesterol com o complexo de inclusão leva à restauração do colesterol da membrana (Klein et al., 1995). Na célula espermática demonstrou-se que o colesterol é incorporado em todas as membranas, localizando-se, em maior concentração, nas membranas acrossomal e mitocondrial (Moore et al., 2005a).

A incubação do sêmen com complexos colesterol–ciclodextrina (CLC) tem resultado em melhor viabilidade espermática pós– congelamento/resfriamento em diferentes espécies domésticas. Estudos envolvendo o congelamento do sêmen de garanhões demonstraram uma melhora quanto à viabilidade espermática pós- descongelamento, quando realizou-se a incorporação do colesterol à membrana espermática, carreado pela ciclodextrina (Combes et al., 2000). Além disso, durante o resfriamento a 5°C, a incorporação de colesterol teve efeitos positivos. Os espermatozóides equinos tratados com CLC, submetidos à centrifugação (C) ou não (NC), exibiram melhores parâmetros de motilidade que os não tratados às 24, 48 e 72 horas de armazenamento, bem como maior porcentagem de espermatozóides com membrana intacta às 48 horas (40% e 45% contra 23 e 22%) e 72 horas (33 e 30% contra 17 e 15%) (Torres et al., 2006).

Ao utilizarem garanhões cujo sêmen apresentava baixa tolerância à criopreservação, Zahn et al. (2002) observaram aumento da motilidade e da porcentagem de espermatozóides com membranas intactas pós-descongelamento quando da inclusão de 0,125mM de CLC ao meio diluidor; entretanto, este procedimento resultou em queda da fertilidade quando comparada à do grupo controle (25% x 75%).

Na espécie asinina, a incubação do sêmen com 1,5 ou 2,0 mg de CLC para cada 120 x 106 de espermatozóides, previamente ao resfriamento, resultou em melhoria (P<0,05) dos parâmetros de motilidade total, progressiva e integridade da membrana plasmática (Rozas, 2005), embora as diferentes concentrações de CLC’s fossem similares quanto aos parâmetros espermáticos (Tabela 2).

Em jumentos da raça Zamorano- Leonés, Álvarez et al. (2006) demonstraram que a

incubação do sêmen com CLC pré- congelamento aumentou a motilidade e a viabilidade espermática pós- descongelamento, em relação ao grupo não tratado. No mesmo estudo, observaram que a porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto foi maior (p<0,05) para os grupos tratados com 2 e 2,5mg de complexo colesterol-ciclodextrina, em relação ao grupo controle.

Tabela 2. Motilidade e integridade da membrana plasmática em função da concentração de

complexo colesterol-ciclodextrina (CLC; Rozas, 2005).

CLC MT (%) MP (%) EMPI (%)

Controle (0 mg) 21,90 ± 4,87b 15,64 ± 4,89b 12,56 ± 5,72b

1,5 mg 45,83 ± 4,87ª 36,29 ± 4,89ª 31,35 ± 5,72ª

2,0 mg 51,12 ± 4,87a 40,55 ± 4,89ª 31,48 ± 5,79ª

CLC: concentração CLC (mg /120 x 106 _{sptz); MT: motilidade total; MP: motilidade progressiva; EMPI: espermatozóides com a}

membrana plasmática íntegra.

Ao avaliarem diferentes protocolos para o congelamento do sêmen asinino, Jepsen et al. (2010) observaram que a inclusão de 20% de gema de ovo ao meio diluidor resultou em prejuízos à fertilidade. Quando comparou os tratamentos: I) diluidor contendo 20% de gema de ovo; II) diluidor contendo 5% de gema de ovo e III) diluidor contendo 20% de gema de ovo + 60mM de metil- ciclodextrina, observou-se taxas de concepção de 6,3% (1/15); 46,5% (20/43) e 58,3%(14/24) em éguas. Diante da capacidade da ciclodextrina em se ligar ao colesterol, os autores concluíram que, neste experimento, este molécula foi capaz de sequestrar colesterol suficiente para inibir os efeitos das altas concentrações de gema de ovo (possível fonte de colesterol), sobre a capacidade fertilizante dos espermatozóides asininos pós-descongelamento.

Alguns estudos têm demonstrado que o conteúdo elevado de colesterol pode ser prejudicial à célula espermática (Parks et al., 1981), contribuindo para a infertilidade do sêmen de humanos e garanhões (Sugkraroek et al., 1991; Brinsko et al., 2005). Pretende-se que a mesma possa induzir um estado de decapacitação inibindo a reação acrossômica

(Davis, 1978). Além disso, publicações anteriores trazem evidências de que a capacidade fecundante do espermatozóide é influenciada pelos teores de colesterol na membrana plasmática da célula espermática, sendo a sua fusão inibida pelo colesterol (Davis, 1980).

Avaliando as características espermáticas de garanhões com fertilidade normal ou com infertilidade de natureza desconhecida, Brinsko et al. (2005) observaram que as motilidades total e progressiva, bem como a morfologia espermática não diferiram (p>0,05) entre os grupos. Entretanto, após a incubação dos espermatozóides com cálcio ionóforo, a taxa de ocorrência de reação acrossomal foi de 96 ± 3% para os oriundos dos garanhões férteis, sendo de apenas 3 ± 2% para os espermatozóides dos garanhões inférteis. Os autores relacionaram este achado à maior (p=0,01) relação molar de colesterol: fosfolípideos observada para os espermatozóides dos garanhões inférteis (1,51 ± 0,34) em relação aos dos garanhões férteis (0,89 ± 0,27).

Assim, tais estudos corroboram com os achados de Zahn et al. (2002) e Jepsen et al.

(2010), quando o excesso de colesterol, agregado à membrana plasmática, foi prejudicial à capacidade fecundante dos espermatozóides de equideos submetidos ao congelamento.

2.1.1.6. Efeito da coleta fracionada, da