LABORATÓRIO DE ANATOMIA PATOLÓGICA.

Os fragmentos obtidos por meio da endoscopia digestiva alta, da biópsia jejunal peroral e da laparotomia, foram encaminhados ao Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG, para estudo histológico, que foi realizado sempre pelo mesmo patologista, Prof. Dr. Eduardo Alves Bambirra. O material colhido durante os procedimentos endoscópicos, a

biópsia jejunal peroral e a laparotomia foi conservado em solução aquosa de formalina a 10%, sendo o tecido ósseo encaminhado em solução tamponada de formol a 10%.

Os fragmentos intestinais, antes de serem processados para exame histológico, foram examinados em lupa estereoscópica para avaliação da morfologia de superfície e, a seguir, processados de forma rotineira para inclusão em parafina.

Os cortes histológicos foram obtidos em micrótomo rotativo de oscilação vertical (Leica, Alemanha) com espessura de 2 a 5µm. Foram rotineiramente processados para coloração pela Hematoxilina e Eosina, e PAS-Alcian Blue, pH 2,5. Em alguns casos específicos, outras colorações histoquímicas se fizeram necessárias para esclarecimento de aspectos morfológicos peculiares.

No presente estudo, os fragmentos intestinais foram avaliados segundo a sua arquitetura geral, com ênfase nas vilosidades, criptas, relação de proporcionalidade vilosidade/cripta, lâmina basal, vasculatura e celularidade da lâmina própria e das demais camadas da parede do intestino delgado, no caso das biópsias por laparotomia. Também foram observados os detalhes morfológicos das células de revestimento, as particularidades da orla em escova e as características dos linfócitos intra-epiteliais.

Naqueles pacientes em que não foi possível a detecção da imunoglobulina anormal no soro (cadeias α ou γ-pesadas), foi realizado estudo imuno-histoquímico da amostra intestinal, por meio do método de Cattoretti et al.48, que utiliza Avidina-Biotina-Peroxidase, após exacerbação antigênica dos cortes histológicos em forno de microondas em solução citrada (Biogenex, EUA). Para a pesquisa dos epitopos marcadores das estruturas de superfície das células mononucleadas da lâmina própria, foram utilizados os anticorpos primários monoclonais anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM, anti-porção secretória de IgA, anti- kappa e anti-lambda (Dako, EUA Novocasta Laboratories, England). Os cortes histológicos do material previamente fixado em solução de formalina a 10% tiveram de 4 a 6 µm de espessura e foram coletados em lâminas limpas e pré-tratadas para melhor adesividade das mesmas (Silame, Difco).

Em todas as reações executadas, foram utilizados casos estranhos à casuística em estudo, de reatividade previamente conhecidas, que serviram como controles positivos. Os controles negativos foram obtidos por meio da substituição do anticorpo primário por PBS e por soro de coelho normal. A reatividade antigênica foi considerada positiva, quando as

células apresentavam coloração marrom escuro, seja na membrana celular, nuclear ou no citoplasma.

Como referido anteriormente, as características histológicas das alças do intestino delgado, dos linfonodos abdominais e dos órgãos como o fígado e a medula óssea foram considerados os indicadores mais importantes na caracterização da extensão da doença, na abordagem terapêutica e no prognóstico da DIPID. Assim, na tentativa de uniformizar e agrupar estas alterações histológicas, existem algumas classificações na literatura92,227, sendo mais utilizada a classificação de Galian et al.92, que foi a adotada no estudo e que agrupa os pacientes em três estádios distintos, A, B e C.

Estádio histológico A: caracteriza-se por densa e homogênea infiltração da lâmina

própria do intestino delgado por células plasmáticas e/ou linfoplasmocitárias de aparência benigna. Esse infiltrado leva à distorção do padrão vilositário, com alterações que vão desde a atrofia parcial, na qual os vilos mostram-se alargados, até a atrofia total. As alterações das vilosidades são mais acentuadas no duodeno e jejuno proximal e mostram um paralelismo com o grau de infiltração da lâmina própria. Os enterócitos variam de aspecto semelhante ao normal à forma cuboidal, com núcleo central, borda em escova pobremente visível e citoplasma eosinofílico. Pode existir aumento dos linfócitos intra- epiteliais. As criptas possuem aspecto morfológico normal, mas um achado constante e marcante é a escassez destas e o aumento da distância entre essas estruturas. Os linfonodos mesentéricos exibem infiltrado semelhante ao descrito na mucosa intestinal, podendo ou não apresentar discreta desorganização da sua arquitetura. Outros órgãos como o cólon e o estômago podem apresentar uma infiltração pelo mesmo padrão celular. No fígado, numa freqüência menor, denso infiltrado de células plasmáticas maduras e linfócitos podem estar presentes nos espaços porta. Pequenos nódulos, também formados por células plasmáticas maduras, podem ser encontrados no interior dos lóbulos.

Estádio histológico B: observa-se atrofia das vilosidades e os enterócitos são

cuboidais. O infiltrado da lâmina própria é muito denso e formado por células plasmáticas maduras, que habitualmente se localizam na superfície do epitélio. Entretanto, a maior população celular é representada pelos plasmócitos atípicos, caracterizados por células com citoplasma pouco desenvolvido, núcleo central e grande. O nucléolo é volumoso, possui cromatina frouxa e localiza-se em posição central. Essas células ocupam preferencialmente

as camadas mais profundas da mucosa, sobretudo a submucosa e a muscular. A profundidade desse infiltrado varia muito ao longo do intestino. Em algumas áreas, ele pode permanecer confinado à mucosa, exibindo herniações localizadas para a submucosa superficial, enquanto em outras, invadem a muscular e a serosa. As células presentes no infiltrado podem invadir e levar à destruição das criptas intestinais, lesão esta, observada com relativa freqüência nesse estádio da doença.

O mesmo padrão celular descrito no intestino é encontrado infiltrando os linfonodos, ocasionando uma completa subversão na sua arquitetura. Em muitos casos a gordura capsular e pericapsular é invadida e poucos centros germinativos são poupados. Os seios medulares e periféricos podem estar dilatados. No fígado, os espaços porta podem exibir o mesmo tipo de infiltrado e lesões nodulares também podem estar presentes.

Estádio histológico C: a principal característica desse estádio é uma exuberante

proliferação celular, que invade difusamente todas as camadas da parede intestinal. As células são atípicas, freqüentemente binucleadas, por vezes, lembrando as células de Reed-

Sternberg. Os linfonodos apresentam infiltração homogênea por células com características

semelhantes às observadas no intestino, o que leva à subversão total da arquitetura linfonodal. O fígado, baço e medula óssea podem encontrar-se infiltrados por células de mesmo padrão.

Durante o transcorrer do estudo, as biópsias realizadas por ocasião do diagnóstico e as subseqüentes, foram reavaliadas pela pesquisadora e pelo orientador, à luz da evolução clínica e laboratorial de cada caso, para permitir melhor interpretação da dinâmica das alterações histológicas do intestino delgado, frente às intervenções terapêuticas adotadas.