Métodos

2.3.1 Caracterização físico-química e cor instrumental

As amostras de FSI, FSIA e FSIAF obtidas nos diferentes ensaios foram caracterizadas quanto à composição química centesimal pela determinação dos teores de umidade (44-31 da AACC, 1995), proteínas (46-13A da AACC, 1995); lipídios (30-26 da AACC, 1995); cinzas (08-12 da AACC, 1995) e fibra bruta (32-05 da AACC, 1995). Os teores de carboidratos foram determinados por diferença sem considerar o teor de fibra, que faz parte dos carboidratos.

O índice de acidez do extrato etéreo foi determinado segundo o método número 58-15 da AACC (1995) e o pH foi avaliado de acordo com as normas analíticas do INSTITUTO ADOLFO LUTZ (1985), após o processo de fermentação em cada ensaio.

A cor instrumental das matérias-primas (FSI, FSIA e FSIAF) foi avaliada através do sistema de cor CIEL*a*b*, utilizando-se espectrofotômetro, modelo Color Quest II, marca HUNTER LAB (Reston, Va, EUA), considerando os seguintes parâmetros de operação: ângulo de visão 10°, iluminante D65 e modo de calibração RSIN (reflectância especular incluída), determinando-se os valores de L* ou luminosidade (preto 0/branco 100), a* (verde -/vermelho +) e b* (azul - /amarelo +) (MINOLTA, 1994). A diferença total de cor (∆E), croma (C*) e ângulo de tonalidade (hab) das amostras foram calculados, respectivamente através das seguintes Equações (1a); (1b) e (1c).

C* = [(a)2 + (b)2 ]1/2 (1b) hab = tan-1 [b* /a*] (1c)

2.3.2 Caracterização dos compostos bioativos

Os compostos bioativos (isoflavonas e peptídeos) foram avaliados na FSI, FSIA e FSIAF nos diferentes ensaios do planejamento experimental.

2.3.2.1 Análise das isoflavonas

a) Preparo da amostra e extração

A extração das isoflavonas foi realizada segundo a metodologia descrita por vários autores (COWARD et al., 1993; FUKUTAKE et al., 1996; LUI, 2004), com adaptações para a farinha de soja integral.

Amostras de 10 g de farinha de soja integral (FSI), farinha de soja integral autoclavada (FSIA) e farinha de soja integral autoclavada fermentada (FSIAF), foram peneiradas em peneira de 35 mesh, desengorduradas com éter de petróleo, em extrator tipo Soxhlet, por 4 h. Amostras de 1 g de cada farinha desengordurada foram submetidas à extração com 10 mL de solução 80% metanol durante 2 h, a 25ºC, centrifugadas a 5000xg por 10 min. Os sobrenadantes foram filtrados através de microfiltros de PTFE com porosidade 0,22 µm (Millipore, São Paulo, Brasil) e os filtrados foram estocados a 4ºC, por no máximo 6 dias, e analisados por CLAE-DAD.

b) Condições cromatográficas e identificação das isoflavonas

A determinação das isoflavonas foi obtida através da análise dos extratos metanólicos de soja, por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), sendo realizada de acordo com o procedimento descrito por Aguiar e Park (2004).

Alíquotas de 20 µL foram injetadas em um cromatógrafo líquido Shimadzu com detector de arranjo de diodos (DAD) com comprimento de onda de 254 nm, coluna Gemini C18 (250 mm x 4.6 mm x 5 µm), temperatura 30ºC, fluxo 0,5 mL.min-1, modo gradiente com fase móvel (A) (água: ácido acético 19:1, v/v) e (B) (metanol). O gradiente iniciou com 20% de solvente B, passando para 40% em 15 min, subindo a 50% entre 15 e 55 min, atingindo 70% em 82 min, decrescendo para 20% entre 82 e 87 min, completando a corrida em 100 min.

c) Análise Quantitativa

A quantificação das isoflavonas foi realizada através das análises dos extratos metanólicos de soja por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) seguindo o procedimento descrito por Aguiar e Park, 2004.

As isoflavonas foram quantificadas através do método do padrão externo. Utilizou-se solução padrão de concentrações respectivamente conhecidas de daidzina e genistina (200, 80, 40, 20 e 10 µg.mL-1); glicitina (200, 100, 40, 20 e 10 µg.m-1) e daidzeína, gliciteína e genisteína (100, 50, 20, 10 e 5 µg.mL-1). Os padrões foram injetados em triplicatas e obtiveram-se os cromatogramas correspondentes a cada um deles. Os gráficos foram obtidos com 5 pontos de concentração, relacionando-se as áreas obtidas com as respectivas concentrações. Calculou-se as concentrações dos isômeros de isoflavonas em cada ensaio, por interpolação das áreas.

As concentrações foram expressas em µg de isoflavonas por g de farinha de soja integral (autoclavada e fermentada), em base seca. Após a normalização das diferenças de peso molecular das formas glicosiladas, obtidas através da multiplicação da massa de cada derivado pela razão entre o peso molecular da respectiva aglicona e o peso molecular da forma glicosilada, conforme Song et al.

(1998), Griffith e Collison (2001) e Delmonte, Perry e Rader, (2006), obteve-se as isoflavonas agliconas equivalentes.

2.3.2.2 Determinação qualitativa dos peptídeos

A extração das proteínas foi realizada segundo metodologia proposta por Faurobert (1997). A determinação dos peptídeos foi realizada através da análise de eletroforese SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio). Após a eletroforese, o gel foi tingido com azul-brilhante- de-Coomassie por 40 min e fixado em solução de ácido acético a 7% por 12 horas. Depois dos peptídeos serem fixados no gel, revelados e secos, foram fotoarquivados, analisados e classificados quanto ao peso molecular, em comparação com o padrão, segundo metodologia descrita por Hong, Lee e Kim, (2004) e Alfenas (2006).

2.3.3 Avaliação tecnológica da proteína de soja e fatores antinutricionais

As propriedades tecnológicas das proteínas de soja e os fatores antinutricionais (atividade ureática) antes e após o processo de fermentação foram avaliadas através dos seguintes parâmetros:

2.3.3.1 Índice de absorção de água (IAA)

O IAA foi determinado segundo o método da AACC 88-04 (1995).

2.3.3.2 Índice de solubilidade de nitrogênio (ISN)

O ISN foi determinado segundo método da AACC 46-23 (1995).

2.3.3.3 Índice de atividade ureática (IAU)

2.3.4 Definição das condições otimizadas de fermentação da FSIA

A escolha das condições de temperatura e tempo de incubação da FSIA durante a fermentação utilizando-se o fungo Aspergillus oryzae foi estabelecida em função dos parâmetros tecnológicos (índice de solubilidade do nitrogênio, de absorção de água, de atividade ureática, de acidez do extrato etéreo e pH) e das propriedades funcionais (teores de isoflavonas agliconas e presença de peptídeos), segundo as metodologias já citadas nos respectivos itens anteriores.

2.3.5 Análise estatística

O programa estatístico Statistica 5.0 (Statsoft, USA) foi utilizado para determinar os efeitos das variáveis independentes, calcular os coeficientes de regressão (R2), fazer a análise de variância (ANOVA) e construir as superfícies de resposta, com nível de significância de 5%. O teste de Tukey foi utilizado para determinar as diferenças entre os tratamentos otimizados (nível de significância p ≤ 0,05).