Perfil eletroforético da fração protéica da FSIAF

Na soja são encontrados três tipos de proteínas: as envolvidas no metabolismo, as estruturais e as de reserva, que não possuem atividade biológica (ZARKADAS et al., 1994).

Segundo Hou e Chang (2004), aproximadamente 90% das proteínas totais da soja são globulinas e podem ser extraídas com solução salina diluída. A glicinina e a β-conglicinina são as duas maiores globulinas de reserva. A glicinina, também conhecida como proteína 11S da soja, consiste de polipeptídeos ácidos e básicos que são ligados através de ligações disulfídricas. A β-conglicinina, uma proteína 7S, é uma glicoproteína trimérica que consiste de três tipos de subunidades (’,  e β).

Os perfis eletroforéticos da fração protéica da FSI, FSIA e FSIAF nos diferentes ensaios estão apresentados na Figura 3.13. Observa-se que houve a presença de moléculas com peso molecular superior a 97,4 kDa na FSIA e nas amostras de FSIAF, indicando que o tratamento térmico provocou a desnaturação protéica e provavelmente a agregação de cadeias polipeptídicas. Este comportamento das proteínas também foi observado por Takeiti, Souza e Netto (2004), que avaliaram a influência do tratamento térmico sobre as propriedades funcionais do isolado protéico de soja e identificaram que a fração 7S é

desnaturada a 75,4ºC, enquanto que a fração 11S a 93,2ºC e que a proteína desnaturada podem formar polímeros.

Figura 3.13 – Análise de SDS-PAGE de proteína de farinha de soja integral (FSI), farinha de soja integral autoclavada (FSIA) e de farinha de soja integral autoclavada fermentada (FSIAF), nos diferentes ensaios.

As subunidades da β-conglicinina, ’ -7S,  - 7S e a β – 7S migraram no gel até aproximadamente o peso molecular de 72 kDa, 68 kDa e 52 kDa, respectivamente. Também podem ser identificados no gel a glicinina, polipeptídeos e polipeptídeos ácidos, incluindo o A3, Ax (A1a, A1b, A2 e A4). Os polipeptídeos ácidos Ax e os básicos Bx são provenientes de duas bandas que pertencem à glicinina. O A3 migrou um pouco mais lentamente (peso molecular ~42 kDa) do que a maior parte do grupo ácido Ax (peso molecular ~37 kDa). Os polipetídeos básicos B3 e B4 podem ser separados sobre as menores bandas, sendo as maiores bandas os Bx (B1a, B1b e B2). Os polipetídeos Bx migraram no gel até a posição intermediária entre as bandas B3 e B4. Os resultados encontrados na

FSI e FSIA foram similares aos reportados por Hou e Chang (2004) e Liu et al., (2008).

Comparando a banda da FSIA com as bandas da FSIAF (Figura 3.13, Linhas 1 a 11), as subunidades da proteína de soja da FSIAF obtida nos diferentes ensaios apresentaram alterações na intensidade da banda, após a fermentação, sendo evidenciado que as subunidades ’ -7S,  - 7S foram mais hidrolisadas que as β – 7S durante o processo de fermentação da FSIA utilizando o fungo

Aspergillus oryzae, observado pela menor intensidade das bandas nas amostras

fermentadas.

Takeiti, Souza e Netto (2004), avaliaram o efeito da hidrólise e do tratamento térmico do isolado protéico de soja através do perfil eletroforético, observaram que o aumento da severidade do tratamento térmico resultou no desaparecimento da fração 7S, enquanto a globulina 11S permaneceu presente, após a hidrólise. Os autores concluíram que a fração 7S foi mais suscetível à hidrólise, devido à desnaturação térmica.

A fração 7S sofreu desnaturação térmica ficando mais suscetível a hidrólise, aparecendo nas bandas das amostras fermentadas com menor intensidade ao mesmo tempo em que surgiram bandas com moléculas de menor peso molecular, indicando provavelmente a degradação destas proteínas em peptídeos, devido à fermentação, visto que, na FSIA não se observou a presença destas moléculas menores.

Segundo Panyam e Kilara (1996), a hidrólise protéica leva à formação de uma grande variedade de peptídeos, tanto peptídeos de baixo peso molecular, como peptídeos de alto peso molecular e, ainda, cadeias que não sofrem hidrólise. Na Figura 3.14, observa-se o efeito da fermentação da FSIA utilizando o fungo Aspergillus oryzae na hidrólise das proteínas da soja. Verifica-se que houve um aumento na quantidade de peptídeos de baixo peso molecular (<20 kDa) nas amostras fermentadas, sendo possível identificar nos ensaios (1, 3, 5, 6, 8, 9,10 e

11) a formação de bandas na faixa de 6,5 kDa, as quais não foram identificadas na FSI e na FSIA. Os resultados encontrados estão de acordo com os reportados por Hong, Lee e Kim (2004), que também avaliaram o efeito da fermentação da farinha de soja utilizando Aspergillus oryzae GB-107, por 48 horas, na formação de peptídeos. Os autores observaram um aumento significativo na quantidade de pequenos peptídeos (<20 kDa) e uma redução nos peptídeos maiores (>60 kDa) quando comparado com a farinha de soja não fermentada, atribuindo a formação dos peptídeos de menor peso molecular à ação de enzimas proteolíticas secretadas pelo fungo Aspergillus oryzae durante a fermentação.

Figura 3.14 – Análise de SDS-PAGE de proteína da farinha de soja integral (FSI), farinha de soja integral autoclavada (FSIA) e da farinha de soja integral autoclavada fermentada (FSIAF), nos diferentes ensaios.

Estudos demonstraram que o fungo Aspergillus oryzae pode produzir enzimas como aminopeptidases, serina endopeptidases, aspartato

endopeptidases, dentre outras (PEDERSON, CARLESEN e NIELSEN, 1999; LIANG, PAN e LIN, 2009).

Sardjono e Knol (1998) reportaram que a atividade proteolítica do Aspergillus

oryzae alcançou níveis máximos após 48 horas de fermentação, não sendo

observadas alterações após esse período. Isto sugere que as faixas de tempo de 19 a 53 horas utilizadas neste estudo proporcionaram condições favoráveis para que o fungo Aspergillus oryzae produzisse proteases, proporcionando o aparecimento de peptídeos de baixo peso molecular.

Watanabe, Aoki e Fujimoto (2008) estudaram o efeito de uma dieta com soja fermentada, como o tempeh, na absorção de cálcio em ratos. Os autores observaram que durante a fermentação com o fungo Rhizopus microsporus por 20 horas, houve a redução de fitatos e a produção de peptídeos na faixa de 10 kDa, que possibilitaram um aumento na absorção de cálcio em cobaias com dieta a base de tempeh.

Os peptídeos bioativos são identificados na soja e principalmente em produtos de soja fermentada, hidrolisado protéico de soja e também em soja germinada, segundo estudos realizados por vários autores (JEONG et al., 2003; MEJIA et al., 2004; BEERMANN et al., 2009; PAUCAR-MENACHO, 2009).

Beermann et al. (2009) caracterizaram as propriedades antioxidantes de peptídeos bioativos obtidos da hidrólise enzimática, com tripsina pancreática, de isolado protéico de soja e observaram um aumento na atividade antioxidante quando comparada com o isolado protéico não hidrolisado. A hidrólise também aumentou a quantidade de peptídeos de baixo peso molecular com até 1kDa, com predominância de resíduos de aminoácidos aromáticos, conferindo maior propriedade funcional ao produto.

Mejia et al. (2004) estudaram a concentração de lunasin, um peptídeo que apresenta uma seqüência de 43 aminoácidos e um baixo peso molecular de aproximadamente 5,4 kDa, originalmente isolado da proteína de soja, mas

também pode ser encontrada na cevada. Este peptídeo apresentou concentrações de 0,10 a 1,33 g/100 g em farinha de soja de diferentes variedades e possui um importante papel na prevenção e no tratamento de alguns tipos de câncer.

Dia et al. (2009) isolaram, purificaram e caracterizaram o lunasin obtido de farinha de soja desengordurada e avaliaram a atividade anti-inflamatória. Encontraram três peptídeos com peso molecular de 5, 8 e 14 kDa, que apresentaram imunorreatividade positiva com o anticorpo utilizado para identificar o lunasin. Este peptídeo também apresenta atividade anti-inflamatória. A germinação da soja por 12 horas a 25ºC pode aumentar a concentração de

lunasin na farinha de soja integral, melhorando assim as suas propriedades

funcionas (PAUCAR-MENACHO, 2009).