A própolis é uma substância resinosa, altamente aderente, produzida em diversos vegetais como árvores, arbustos, flores e troncos, para se protegerem, principalmente no estágio de brotos, pois, são vulneráveis a microrganismos e insetos. A colmeia, principalmente as larvas, fica igualmente vulnerável a invasores, levando as abelhas a coletarem essas substâncias que protegem os vegetais, para se protegerem.
A própolis tem sido usada na medicina popular em vários países, como sendo um bom remédio tanto na terapia quanto na profilaxia de diferentes processos patológicos. Os extratos etanólicos e aquosos têm sido descritos como tendo um amplo espectro de atividades biológicas.
O efeito bactericida dos extratos etanólicos de própolis (LU ET A., 2005) foi demonstrado em amostras de própolis coletadas em diferentes estações do ano e em diferentes regiões de Taiwan em culturas de Staphylococcus aureus.
De acordo com Orsi e seus colaboradores (ORSI ET AL., 2005) macrófagos foram pré-estimulados com própolis brasileira e búlgara e foram colocados em contato com Salmonella typhimurium em diferentes relações macrófago/bactéria onde concluiu-se que a própolis aumenta a atividade bactericida do macrófago sendo, a própolis brasileira, mais eficiente do que a búlgara.
O sinergismo do extrato etanólico da própolis com alguns antibióticos (KROL et al., 1993) foi verificado, no entanto, em algumas drogas o efeito foi moderado, porém um efeito sinérgico com a estreptomicina e a cloxacilina foi identificado.
Um estudo testou o efeito da própolis contra 67 tipos de fungos isolados de pacientes com oncomicoses, e demonstrou que o extrato de própolis tem excelente desempenho, comprovando a sua atividade antifúngica (OLIVEIRA et al., 2006). Ainda, de acordo com Silici e seus colaboradores (SILICI ET AL., 2005) comprovaram ação da própolis turca contra micoses superficiais.
Também se verificou que o extrato aquoso da própolis originária de Israel inibe significativamente a transformação maligna de fibroblastos de rato (NIH/3T3) pelo vírus Moloney do sarcoma murino (Musv-124) (HULEIHEL, ISHANO, 2001).
Vários extratos de própolis brasileira do estado de São Paulo (BRP) (CUNHA et al., 2004) foram avaliados em relação à sua atividade antitripanossômica (T. cruzi), demonstrando que alguns extratos apresentavam uma alta atividade.
Recentemente, foi relatado o uso da própolis como um agente contra o protozoário Giardia duodenalis, inibindo o seu crescimento e sua aderência (FREITAS et al., 2006). Também foi comprovada a ação da própolis na redução da infecção da
Leishmania amazonensis em macrófagos (AYRES et al., 2007).
A atividade citotóxica da própolis foi demonstrada por Matsuno e seus colaboradores (1997), usando o ácido 17-hidroxicleoroda-3-dien-15-oico, outro composto isolado da própolis brasileira, no tratamento de linhagens humanas de células de carcinoma hepático (HuH13), carcinoma de pulmão (HLC-2), células de câncer cervical (Hela) e câncer de cólon (26-L5).
Segundo Kimoto e seus colaboradores (2001), utilizando o composto Artepillin C (ácido 3,5 diprenil-4-hidroxicinâmico), obtido da própolis oriunda das regiões de Minas Gerais (BRP) e Paraná (BRG), demonstrou-se que as células de melanoma transplantadas em camundongos apresentavam apoptose após 3 semanas de tratamento com 500 mg de Artepillin C via intratumoral. Também foi observada uma inibição no crescimento do tumor com aumento da relação de células T (CD4/CD8) e um número maior no total de células T helper.
A publicação de Akao e seus colaboradores (2003) demonstrou o efeito inibitório da Drupamina e Bacarina e compararam com os efeitos do Artepilin C. Assim, os derivados do ácido cinâmico extraídos da própolis brasileira (BRP), inibiram o crescimento das células da leucemia promielocítica humana (HL60), das células de adenocarcinoma de colon (SW480, DLD-1, COLO201), dos linfócitos periféricos normais estimulados a mitose, em células de câncer gástrico (MKN1, MKN28, MUGC4), em leucemia mielóide crônica (K562) e linfoma histiocítico humano (U937). Entretanto, a atividade anticancerígena de bacarina e drupanina foi levemente menor que a do Artepillin C em linhagens de células de leucemia HL60.
Extratos alcoólicos da própolis chinesa têm atividade antiproliferativa contra várias linhagens de células tumorais (CHEN et al., 2003), incluindo células de melanoma humano (A2058), células de melanoma murino (B16F10), células de tumor de mama humano (MCF-7), células de hepatoblastoma humano (HepG2), células de carcinoma hepatocelular humano (Hep3B), e células de adenocarcinoma de colon humano (HT-29). Ainda, Aso e seus colaboradores (2004) demonstraram, em células de linfoma histiocítico humano (U937), que o extrato etanólico bruto da própolis brasileira inibe por apoptose, o crescimento destas células e a síntese de macromoléculas de maneira dose-tempo dependente.
Também é de conhecimento científico a ação antioxidante da própolis (CHEN et al., 2001; AHN et al., 2004), antiinflamatória (NATARAJAN et al., 1996; MICHALUART et al., 1999; PAULINO et al., 2003, 2006, 2008), imuno-modulatória e antimetastásica (ORSOLIC et al., 2003, 2004; FISCHER et al., 2007a, 2007b).
A avaliação das atividades biológicas dos compostos da própolis e a elucidação do mecanismo, usado para a realização de suas funções, promovem substancial alicerce para o desenvolvimento de novas drogas.
Muitos compostos encontrados na própolis são relatados na literatura como indutores de apoptose, contribuindo assim para a inibição da proliferação em células tumorais. A exemplo do Propolin A®, Propolin B® e Propolin C®, prenilflavonóides isolados da própolis chinesa, que induzem apoptose em células de melanoma (CHEN et al., 2006; CHEN et al., 2004), Benzofenonas polisopreniladas, garcinol e curcumina, isoladas da planta Garcinia inibem a proliferação das células HL60 por apoptose devido à indução da liberação de citocromo c da mitocôndria e ativação das caspases (PAN et al., 2001).
O Arterpilin C, derivado do ácido cinâmico e constituinte de um tipo de própolis brasileira (tipo BRPG), mostrou um potente efeito citotóxico e induziu altos níveis de apoptose em várias linhagens de leucemia (KIMOTO et al. 2001; KIMOTO et al. 1998).
Também derivados de benzofenonas (como garcinol, isogarcinol e xantoquimol) são relatados com indutores de apoptose em células de leucemia humana (MATSUMOTO et al., 2003). O garcinol também é relatado como potente inibidor da histona acetiltransferase e indutor de apoptose (BALASUBRAMANYAM et al., 2004).
Por outro lado, alguns estudos demonstraram que compostos derivados da própolis podem ter efeitos sobre a necrose em algumas patologias (ORSOLIC et al., 2003; ORSOLIC et al., 2004).
De acordo com o estado da técnica, passa a ser relevante, a procura de alguma substância que possa ativar, de alguma forma, os mecanismos de regulação e controle do ciclo celular, a fim de parar o crescimento dos tumores através da indução de uma célula, que carrega uma bagagem genética totalmente alterada, à morte.
O pedido de patente brasileiro PI 0601863 trata de composições medicamentosas a base de própolis brasileira tipificada com atividade leishmanicida e método de tratamento. Mais especificamente, a presente invenção se refere a composições medicamentosas à base de própolis brasileira tipificada, ao uso dessas composições e de seus componentes ativos (isolados ou combinados) na redução da infecção de macrófagos infectados com Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis, Leishmania chagasi e Leishmania donovani e seu método de tratamento
em animais e humanos.
Nosso grupo de pesquisa estudou várias amostras de propolis e publicou recentemente um artigo sobre a atividade analgésica e aniinflamatória da própolis verde do Brasil. Demonstramos que a propolis verde produziu um potente efeito antiedematogenico, anti-inflamatorio e analgésico quando avaliado através de vários modelos animais e em métodos de biologia molecular. A propolis verde inibiu a produção de prostaglandina E2 durante a fase de inflamação aguda, reduziu a produção de óxido nítrico em macrófagos e inibiu a ativação do fator de transcrição nuclear (NFκB). Esse efeito inibitório reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e da cicloxigenase tipo 2 (COX-2). Mostramos ainda que esses resultados são reproduzíveis para o Artepillin C, principal marcador químico da
própolis (PAULINO et al., 2006). Além desses resultados, a incubação de propolis verde não afetou a expressão ou atividade do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), mas tem um efeito ativador no sistema da PKB/Akt no músculo liso vascular na presença de angiotensina II. Estes efeitos farmacológicos podem indicar que a propolis verde de Baccharis dracunculifolia induz efeito analgésico e antiinflamatório, pelo menos em parte, através da modulação da via do NFκB.
Em outro conjunto de experimentos, demonstramos que a própolis Brasileira tipificada produziu efeito relaxante na traquéia isolada de cobaia in vitro. Este efeito está indiretamente dependente da produção e liberação de óxido nítrico de neurônios nitrérgicos e este efeito é diretamente dependente da modulação de canais de potássio modulados por cálcio e alta (BKCa) e intermediária (IKCa) condutâncias (PAULINO et al., 2002). Por outro lado, experimentos em eletrofisiologia demonstraram que a própolis e seus compostos prenilados podem inibir a atividade de canais de potássio modulados por voltagem (Kv1.3). O efeito bloqueador sobre os Kv1.3 pode também ser encontrado para alguns dos compostos prenilados como o Artepillin C. O bloqueio de Kv1.3 em neurônios nitrérgicos pode despolarizar as terminações nervosas e promover a liberação para o espaço sináptico da musculatura lisa das vias aéreas. Esses mecanismos podem explicar, pelo menos em parte o efeito relaxante do extrato de própolis nas preparações do trato respiratório. Kv1.3 também é expresso em outros tipos celulares, como nas células leucêmicas onde é o canal iônico mais importante no controle da atividade celular. Este tipo de canal pode modular a ativação celular, maturação e diferenciação. De fato, bloqueadores Kv1.3, como Correolide, podem ser utilizados para o tratamento de leucemias e doenças inflamatórias e imunológicas. De modo similar ao Correolide, a própolis pode diminuir a atividade dos Kv e reduz a ativação e diferenciação celular.
Recentemente, foi publicado na literatura especializada que a própolis pode ser usada como suplemento nutricional na terapêutica coadjuvante do câncer (SHIMIZU et al., 2005).
Um dos primeiros estudos demonstrando o efeito anticâncer da própolis foi publicado por Scheller (Scheller et al., 1989). Analizaram o efeito do extrato etanólica de própolis (EEP) em carcinoma maduro de Erlich em camundongos, concluindo que a própolis reduziu, in vivo, o tamanho do tumor através da inibição da citocromo C redutase. Kimoto e colaboradores (1996) demonstrou, pela primeira vez, que o Artepillin C extraido da propolis Brasileira produziu mudanças no ciclo cellular e induzia apoptose nas células tumorais. Kimoto e colaboradores (1998) demonstraram ainda que quando o Artepillin C foi aplicado as células tumorais humanas e de camundongos, in vitro e in vivo, produziu efeito citotóxico reduzindo claramente o crescimento tumoral.
O Artepillin C causou significativo dano celular ao tumor sólido e em células leucêmicas quando avaliado no ensaio do MTT, no ensaio da síntese de DNA, e nas observações morfológicas. O efeito citotóxico da própolis verde pode estar relacionado à fragmentação do DNA e a consequente apoptose induzida pelo Artepillin C. Outra hipótese sugerida para a ação da própolis é a redução da peroxidação lipídica e do aumento do sistema imune por meio da ativação dos linfócitos. Esse efeito foi encontrado por uma elevação da taxa TCD4/CD8 bem como no total de células linfocíticas. Esse efeito foi encontrado em célula de carcinoma renal induzidas pelo nitrilo acetato férrico em camundongos (KIMOTO et al., 2000), em células leucêmicas humanas e em carcinogênese pulmonar induzida pelo nitrilo acetato férrico em camundongos (KIMOTO et al., 2001).
Outros compostos prenilados foram encontrados apresentando o mesmo efeito citotóxico em três linhagens celulares produzindo fragmentação de DNA e eficientemente produzindo apoptose celular em linhagens de tumor, mas sem afetar o desenvolvimento do ciclo celular normal (Chen et al., 2003). Efeito similar foi encontrado também para a drupanina e bacharina em linhagens de células tumorais humanas, todavia esse efeito foi menos potente que o do Artepillin C (AKAO et al., 2003).
O estudo dos mecanismos de ação da própolis se iniciou quando Chen e colaboradores (2004) demonstraram que o propolin C, uma prenilflavanona isolada da própolis, produziu efeito apoptótico relacionado à indução de proteínas pró- apoptóticas em células de melanoma humano. Os níveis de procaspase-8, Bid, procaspase-3, e poli (ADP-ribose) polimerase foram diminuídas de maneira dependente da dose e dependente do tempo. Mais ainda, propolin C foi capaz de liberar o citocromo C da mitocondria para o citosol. Estes experimentos sugerem que o propolin C pode ativar a via apoptótica mediada pela mitocondria.
Uma abordagem interessante para tratamento do câncer é a redução da neoangiogenese associada ao crescimento do tumor. Liao e colaboradores (2003) descreveu o efeito inibitório do ester do ácido cafeico (CAPE) sobre a angiogenese, sobre a capacidade de invasão do tumor, e sobre a metastase. De fato, em baixas concentrações CAPE (1,5 microg/mL) inhibiu 52.7% da capacidade de formação de tubo como capilar em células de cordão umbilical humanos (HUVEC) cultivadas em Matrigel. Células CT26 tratadas com CAPE demonstraram redução da capacidade de invasão (47.8%) e redução da expressão de metaloproteinase da matrix celular (MMP)2 e 9. Além disso, CAPE também foi capaz de reduzir a expressão de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) em células CT26. Quando camundongos (BALB/c) receberam uma injeção intraperitoneal de CAPE, a capacidade de metástase pulmonar das células CT26 foi diminuída juntamente com os níveis plasmáicos de VEGF. Estes resultados sugerem que o CAPE pode ser utilizado para reduzir a metástase associada ao tumor.
A enzima COX-2 é induzida por citocinas, fatores de crescimento e promotores de tumor e está superexpressa em tecidos inflamados e em formação tumoral (FOSSLIEN, 2000). Esta enzima está localizada em células neoplásicas, células endoteliais e tecidos de estroma (WILLIAMS et al., 2000; JONES et al., 1999) e contribui para a angiogenese no tumor e para o seu crescimento por um aumento da expressão de VEGF (GALLO et al., 2001), além disso, a produção de eicosanóides pode estimular diretamente a atividade do crescimento do endotélio vascular associado a angiogenese (DANIEL et al., 1999), e inibir a apoptose das células tumorais e endoteliais por um aumento da expressão da proteína anti-apoptóticas bcl-
2 (LIU et al., 2000; SHENG et al., 1998). Devido às múltiplas ligações entre tumor e angiogenese, crescimento do tumor e expressão de COX-2, a inibição seletiva de COX-2 e NFκB representam uma promessa na estratégia terapêutica para o tratamento de tumores sólidos malignos.
Vários estudos sugerem que o CAPE é um potente e específico inibidor do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-kappaB). Lee e colaboradores (2004) demonstraram que o CAPE inibiu significativamente a atividade de ligação do NFκB ao DNA induzido pelo H-rassem afetar a ativação do sinal extracelular regulado pela p38-MAPK, que é a proteína mais importante na via de sinalizalização da proteína Ras. Os autores concluíram que o CAPE pode exercer efeito quimiopreventivo no câncer através da inibição da expressão da COX-2 e pela restauração das “gap junction” intercelulares rompidas pela H-ras, possivelmente por modulação da via do NFκB. Em complemento a esses dados, Abdel Latif e colaboradores (2005) demonstraram que o efeito antiinflamatório do CAPE atavés da modulação do NFκB e AP-1 ativados por Helicobacter pylori em linhagem de células epiteliais gástricas (AGS). Os autores demonstraram que o efeito inibitório estava relacionado à inibição da degradação da proteina IkappaB-α, e o efeito também estava ligado a supressão do crescimento e proliferação celular induzido pelo H. pylori, além disso o CAPE também reduziu a expressão de citocinas como TNFα e IL8, e da COX-2. Neste os autores também propuseram que a inibição da transcrição pelo CAPE poderia resultar na supressão de genes envolvidos na inflamação induzida pelo H. pylori e pode prover de uma nova abordagem para a terapêutica do câncer e de inflamação.
Demonstramos que a própolis verde de Baccharis dracunculifolia (BRPx) é um potente inibidor do NFκB em células (HEK293) e pode modular a expressão da COX- 2, reduzindo a produção de PGE2 durante a inflamação induzida pela carragenina em camundongos, da mesma forma que inibiu a produção de óxido nítrico em células RAW264.7 (PAULINO et al., 2006). Demonstramos também que o Artepillin C, presente na própolis verde de Baccharis dracunculifolia, reproduziu os mesmos resultados do extrato nos modelos de inflamação.
Relatos similares demonstram que a crisina reduz a expressão de COX-2 em células RAW 264.7 estimuladas por LPS, suprimindo significativamente a expressão de RNA mensageiro para a COX-2 de maneira dependente da dose. Os autores sugerem que a crisina pode ser uma opção terapêutica com indicações antiinflamatórias e anticarcinogênicas (WOO et al., 2005).
De modo similar, recentemente Klenke e colaboradores (2006) relataram que o Celecoxib é um potente inibidor do crescimento secundário de tumor de medula in
vivo, e que esse efeito pode ser explicado pela atividade antiangiogênica e pró-
apoptótica apresentada pelo celecoxib. Esses resultados indicam que a combinação da dose estabelecida na terapia com inibidores de COX-2 representam uma possível aplicação no tratamento de metástase medular.
De fato, compostos extraídos de muitas plantas, mel e própolis apresentam atividade antitumoral. Foi demonstrado que a crisina, um composto fenólico presente na propolis de Baccharis dracunculifolia, induziu apoptose mediada pela ativação direta de caspase 3 e que a via de sinalização da Akt assumiu um papel importante nesse efeito apoptótico em células U937. Superexpressão de uma forma ativa da Akt (myr-Akt) em células U937 inibiu a indução de apoptose, a ativação da caspase 3 e a quebra da PLC gama1 pela crisina. Esses resultados sugerem que a via da Akt toma um papel maior na regulação da resposta apoptótica induzida pela crisina em células leucêmicas humanas e que o bloqueio da via da PI3K/Akt pode representar uma alternativa interessante para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de leucemias. (WOO et al., 2004).
Em adição a esses resultados, Cheng e colaboradores (2005), demonstraram que a expressão do inibidor das quinases dependents de ciclina (CDK), p21(Waf1/Cip1), estava significativamente aumentada, sem alterar os níveis plasmáticos da proteína p53, em células tratadas com crisina. A atividade das CDK2 e CDK4 foram reduzidas pela crisina de maneira dependente da dose. Da mesma forma a crisina também inibiu a atividade proteosoma. Os autores sugerem que a crisina exerce seu efeito inibitório sobre o crescimento através da ativação da p38- MAPK, levando ao acúmulo de p21(Waf1/Cip1) ou pro mediadar a actividade proteosomal. Complementando essa hipótese, Kuo e colaboradores (2006) demonstraram que o CAPE (em 24h) inibiu o crescimento de células de glioma C6 e
inibiu o percentual de células em desenvolvimento na fase G0/G1 em 85%. Demonstraram ainda que em 6 horas, CAPE, reduziu os níveis de proteina hiperfosforilada pRb, e os níveis de p21, p27, e p16 estavam significativamente super expressos.
De modo similar, o Artepillin C foi efetivo no carcinoma de colon (SHIMIZU et al., 2005) demonstraram que o Artepillin C é um antioxidante biodisponível que pode ser incorporado às células intestinais (Caco-2) e nas células hepáticas (HepG2) sem qualquer conjugação e inibiu a oxidação intracelular do DNA. O Artepillin C também foi adicionado a celulas de cancer de colo humano (WiDr) onde inibiu o seu crescimento G (0)/G(1). Os eventos envolveram a diminuição da atividade quinase e da formação do complexo ciclina D/CDK4 e nos níveis da proteína de retinoblastoma fosforilada nas posições Ser 780 e 807/811. Os inibidores do complexo CDK, Cip1/p21 e Kip1/p27, aumentaram seus níveis. Por outro lado, Northern blotting demonstrou que o Artepillin C não afetou a expressão do RNA mensageiro para Kip1/p27. Os autores também demonstraram que em linhagem de células de câncer de colo retal humano com deleção gênica para Cip1/p21 (HCT116), que o Artepillin C falhou em reduzir a diferenciação celular G(0)/G(1), mas não no tipo normal dessa célula. Então, de modo análogo ao CAPE, o Artepillin C parece prevenir o câncer de colo através da indução da parade do ciclo celular por estimulação da expressão de Cip1/p21, um usual quimiopreventivo em câncer de colo retal. Na verdade, vários relatos na literatura descrevem os inibidores das CDK, p21WAF1CIP1, como principais reguladores ao nível transducional da diferenciação celular (GARTEL et al., 2005; HERSHENSON, 2004).
Em concordância com esses resultados, Shimizu e colaboradores (2005) demonstraram que a dieta com Artepillin C suprimiu a formação de focus aberrantes induzidos por azoximetano em colon de camundongo através da ativação do elemento de resposta antioxidante e através da indução das enzimas de fase II no fígado. Para explicar esse efeito (CHEN et al., 2005) demonstraram que o CAPE sensibiliza as células de adenocarcinoma de colo retal (CT26) para a radiação ionizante via depleção da GSH e inibição da via do NFκB, sem toxicidade para a medulla óssea, fígado ou rins.
As metaloproteinases da matriz celular são enzimas proteolíticas dependentes de zinco que assumem papel importante na metastase de tumor. Elas estão envolvidas na quebra da matriz extracelular bem como nos substratos não protéicos não ligados à matriz celular. Foi relatado que o CAPE pode modular a expressão dos genes das MMPs (MMP-2, MMP-9, MT1-MMP), dos inibidores da metaloproteinase-2 (TIMP-2) e in vitro a capacidade invasiva das células de fibrossarcoma humano. CAPE também diminuiu os níveis de RNA mensageiros para as MMP e TIMP-2 em células de fibrossarcoma humano (HT1080) quando aalizado através da técnica de RT-PCR e exibiu uma significant redução na expressão das MMP-2 e MMP-9 em (HT1080) (HWANG et al., 2006). Em adição a esses resultados, o CAPE inibiu a atividade da MMP-2 bem como a capacidade de invasão, mobilidade, migração de células e a formação de colônias tumorais. Esses dados demonstram evidencia direta de que o CAPE funciona como agente antimetastatico, que pode inibir marcadamente a capacidade invasiva das células tumorais. Estes dados estão de acordo com aqueles demonstrados por Jin e colaboradores (2005) no qual o CAPE inibiu a atividade da MMP-9 demonstrando atividade seletiva antiproliferativa para as células de hepatocarcinoma (Hep3B), mas não para células normais de cultura primária de