Antes de iniciar a exposição das plantas aos gases (T0) e a cada 30 dias (T1 - 30 dias, T2 – 60 dias, T3 – 90 dias e T4 – 120 dias) foram analisados os seguintes parâmetros: Índice de Injúria Foliar, Biomassa, Clorofila, Proteína, Peroxidase. A atividade enzimática do solo feita pela hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) foi feita somente em T0 e T4.
3.5.1 Índice de Injúria Foliar (IIF)
O surgimento de injúrias foliares visíveis (necroses) foram vistoriados e mensurados visualmente em porcentagens de folíolos afetados.
Ao serem retiradas das estufas, as mudas foram analisadas e classificadas quanto a Injúria Foliar. Foram consideradas seis classes, descritas na Figura 11. Foi considerado Classe 0 os folíolos que não apresentaram sintomas de injúria, ou seja, visualmente eram 100% saudáveis.
Figura 11 - Classes de Injúria Foliar.
Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4 Classe 5
1-5% 6-25% 26-50% 51-75% 76-100%
Para cada indivíduo foi aplicado o Índice de Injúria Foliar (IIF), onde a porcentagem de sintomas é dividida em classes e depois calculada de acordo com a fórmula descrita em Furlan et al. (2008) (Equação 1) e mostrada a seguir:
Equação 1 – Fórmula para cálculo do Índice de Injúria Foliar (IFF)
IIF (%) = (N1 x 1) + (N2 x 2) + (N3 x 3) + (N4 x 4) + (N5 x 5) x 100 (N0 + N1 + N2 + N3 + N4 + N5) x 5
Onde N1, N2, N3, N4 e N5 representam a quantidade de folíolos com sintomas em cada classe e N0 é o número de folíolos que não apresentaram sintomas.
3.5.2 Produção da biomassa
Para o cálculo da biomassa, primeiramente foi removido a terra das plantas e estas foram separadas em três partes: folíolos, caule e raiz as partes tiveram suas massas determinadas em balança semi-analítica. Após a pesagem úmida de cada planta, separou-se 50% das folhas e raízes, foram destinadas às análises e as outras partes foram utilizadas para determinação da massa seca (84 °C por 24 horas). Após esse período, as partes foram pesadas para determinação da massa seca, a qual foi relacionada com o número de plantas (g.planta-1) (BENINCASA,
3.5.3 Determinação do Teor de Clorofila
A determinação do teor de clorofila foi feita pelo método espectrofotométrico a partir do uso das absortividades específicas em acetona 80% e mudanças nas absortividades em comprimentos de onda adequados (VERNON, 1960). Em uma balança analítica foi pesado 0,25 g de amostra de folhas frescas, sendo esta amostra introduzida em um Erlenmeyer de 50 mL protegido da luz com papel alumínio para evitar a fotodegradação da clorofila.
Em um balão de 10 mL foi diluído 1 mL do sobrenadante da amostra, completando o restante com acetona 80%. O balão também foi protegido com papel alumínio até ser feita a leitura de absorbância em espectrofotômetro em λ = 648, 653 e 665 nm. Os valores de absorbância encontrados foram inseridos nas seguintes fórmulas, obtendo-se os valores do conteúdo total de clorofila expresso em miligrama de clorofila por grama de folha (mg.g-1) (Equação 2):
Equação 2 – Fórmula para cálculo da Clorofila.
Ca = 14,85 A 665 - 5,14A 648 Cb = 25,48 A 648 - 7,36 A 665 C(a+b) = 7,49 A 665 - 20,34A 648 Ca: clorofila a
Cb: Clorofila b
C(a+b): clorofila total (ou somando-se Ca+Cb)
A648 ou 665: valor da absorbância no comprimento de onda respectivo
3.5.4 Determinação do conteúdo de Proteína
A dosagem de proteínas totais foi realizada segundo o método de Bradford (1976), utilizando o reagente azul brilhante de Coomassie G-250. Para a preparação do reagente, são dissolvidos 100 mg de azul brilhante de Coomassie G-250 em 50 mL de Etanol 95% (v/v). Após a dissolução, são adicionados 100 mL de Ácido Fosfórico 85% (v/v). O volume é completado para 1 litro com água destilada e após a solução é filtrada e conservada em frasco âmbar. Dos extratos vegetais obtidos previamente é utilizada uma alíquota de 100 µL (ou uma diluição para cair na parte
linear da curva-padrão), a qual é adicionado 3 mL do reagente de Coomassie, sendo agitados em seguida.
O sistema de reação é mantido a temperatura ambiente e realizada a leitura de absorbância no espectrofotômetro em comprimento de onda igual a 595 nm. Foram analisadas 3 amostras e realizadas três repetições para cada amostra. A absorbância é relacionada com a quantidade de biomassa presente na amostra e as quantidades de proteína foram calculadas em relação à curva-padrão feita com soro de albumina bovina (SAB). Os resultados foram expressos em (mg.g-1 planta). A
validação do protocolo usado, em termos de linearidade das respostas obtidas com as amostras foi feita através de uma curva de calibração onde foi usada a SAB comercial.
Assim, uma solução-mãe da proteína comercial (SIGMA, P-8000) foi preparada pela dissolução de 100 mg da proteína em 100 mL de tampão fosfato (50 mM; pH 7,6). Uma gama de diluições foi utilizada para preparar a curva de calibração, a qual serviu para expressar os resultados obtidos com as amostras. As diluições preparadas para a confecção da curva de calibração foram as seguintes (µg.100 µL-1): 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 e 100,0. A Equação 3 indica a equação da reta
para as 5 curvas.
Equação 3 – Equação da reta.
y = 0,0038.X + 0,0315 (R2 = 0,9938)
3.5.5 Atividade enzimática da Peroxidase
A determinação da atividade enzimática da peroxidase nas plantas foi feita segundo a metodologia proposta por Byl et al. (1994) macerando 0,1 g da amostra (folhas ou raízes), colhidas de forma homogênea, com 2 mL de solução tampão fosfato de potássio 50 mM (pH = 7,6). As amostras homogeneizadas foram armazenadas em freezer até o momento das análises. Na análise, o homogeneizado foi transferido para microtubos tipo Eppendorf graduado com tampa e centrifugado novamente (10.000 rpm, 10 min., 4ºC) na centrifuga Mini Spin Plus – Eppendorf. Para a análise espectrofotométrica, 0,1 mL do sobrenadante obtido contendo enzima
foi adicionado a 0,70 mL da solução A e 0,75 mL da solução B. A solução A é constituída por 125 mg de 4-Aminoantipireno e 4,05 g de fenol completando com 250 mL de água destilada.
A solução B é constituída de 0,1 mL de Peróxido de Hidrogênio e 250 mL de tampão HEPES 0,01 M, pH = 7,1. O sistema de reação foi mantido à temperatura ambiente, sendo realizada a leitura no espectrofotômetro digital Instruthem Modelo UV-2000A em comprimento de onda igual a 510 nm. A cinética durou 1 minuto. A atividade da enzima é a diferença entre as leituras final e inicial da absorbância e esta variação foi expressa como ∆Abs.g-1 planta, já que as quantidades de biomassa
e de proteínas eram muito similares entre as amostras. Foram analisadas 3 amostras com três repetições para cada amostra.
3.5.6 Atividade de enzimas hidrolíticas (hidrólise do FDA) do Solo
Para avaliar o impacto da emissão dos gases na microbiologia do solo foram realizadas medições de hidrólise do FDA. Com o auxílio de uma espátula foi coletado o solo superficial (onde eliminou-se toda a matéria orgânica residual superficial). Foi preparado uma solução tampão de fosfato de potássio 60 mM, pH 7,6 (8,7g de K2HPO4 + 1,3g KH2PO4 para 1 L de água), sendo o pH ajustado com
ácido clorídrico (HCl) 0,01 M. As amostras de solo foram distribuídas em tubos de ensaios (5 g de amostra) em três repetições para cada amostra. Concluída esta fase, foram acrescentados 0,2 mL da solução de FDA (concentração final 2 mg.mL-).
A preparação da solução de FDA foi feita pela dissolução de 40 mg de FDA (FLUKA 31545) em 5 mL acetona p.a. e 15 mL de água destilada. Os tubos de ensaio foram agitados suavemente durante o tempo de exposição (4 h) e a seguir, 20 mL de acetona foi então aplicada para terminar a reação. O material foi filtrado e colocado em novos tubos de ensaio onde então foram centrifugados a 500 rpm durante 15 minutos, seguido de filtração do sobrenadante (Whatman 0,45 µm). O filtrado foi lido no espectrofotômetro digital Instruthem Modelo UV-2000A em comprimento de onda igual a 490 nm. Os resultados foram expressos como ∆Abs.g-1