Procedimentos testados, concebidos e optimizados

3.2.2.1. BIOTECNOLOGIA VEGETAL – CULTURA IN VITRO DE COUVE-FLOR E

DE VIOLETA AFRICANA

Em biotecnologia vegetal foram concebidos e optimizados procedimentos para a micropropagação de plantas, através de técnicas de cultura in vitro, com vista à produção de clones de couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis L.) e de uma planta ornamental, a violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendl

.

). Enquanto que a selecção da couve-flor teve por base os motivos referidos no Capítulo 2 (ver secção 2.2.2.4. Espécie modelo:

Brassica oleracea var. botrytis L., p.38), a escolha da violeta africana resultou do seu

papel de modelo para trabalhos de clonagem vegetal, em diversos manuais escolares dos actuais programas das disciplinas de Biologia e Geologia do ensino secundário (Silva

et al., 2005; Silva et al., 2008) – aspecto determinante para a sua escolha na cultura in vitro de plantas.

A cultura in vitro inicia-se com a escolha e selecção da planta-mãe a partir da qual são retirados os explantes para a regeneração de novas plantas. No caso da couve-flor, utilizaram-se como explantes porções da inflorescência e para a violeta africana, face às dificuldades verificadas na indução de rebentos, testaram-se os seguintes tipos de explantes: limbo e pecíolo da folha; pétalas.

A couve-flor a utilizar deve ser fresca e não mostrar quaisquer sinais de envelhecimento (manchas acastanhadas), devendo escolher-se para explantes as porções mais centrais, dada a menor probabilidade de serem portadoras de infecções. Relativamente à violeta africana, preferencialmente escolheram-se órgãos jovens, pela maior probabilidade de responderem ao meio de cultura.

No desenvolvimento das fases de micropropagação das duas plantas foram concebidos e optimizados os seguintes procedimentos: a) desinfecção e inoculação dos explantes no meio de cultura para a indução de rebentos; b) transferência dos rebentos para o meio de enraizamento; c) transferência das plântulas para o substrato de transplante e aclimatização. No que diz respeito à desinfecção do material biológico, foram testados diversos procedimentos, com variações na concentração das soluções de álcool etílico (50 e 70%) e das de lixívia com detergente (14, 20, 30 e 40%), descrevendo- se e ilustrando-se nos procedimentos 1A e 1B, respectivamente, Anexo 2 (couve-flor) e Anexo 3 (violeta africana), apenas aquele que permitiu obter, para cada uma das plantas, os melhores resultados, ou seja, o procedimento que resultou na menor taxa de infecção

e de mortalidade dos explantes. Em virtude dos explantes de violeta africana serem de reduzidas dimensões, a indução de rebentos efectuou-se em placas de Petri, enquanto para a couve-flor foram utilizados frascos de vidro. Os explantes depois da desinfecção e inoculação em meio MS foram colocados em câmaras de crescimento com condições de luz, intensidade luminosa e temperatura controladas.

Ao meio de cultura foram adicionadas citocininas, pois além dos rebentos in vitro produzirem pequena quantidade destes reguladores de crescimento, o seu principal local de síntese são as raízes, e os explantes utilizados não possuem sistema radicular (Canhoto, 2010). Deste modo, explica-se a sua inclusão nos meios de cultura para a indução e o crescimento dos rebentos. Após o desenvolvimento e o crescimento dos rebentos procedeu-se ao seu enraizamento, descrito e ilustrado no procedimento 2 para a couve-flor e também utilizado para a violeta africana (ver Anexo 4). Este processo efectuou-se transferindo os rebentos do meio de crescimento para um meio sem reguladores de crescimento, tal como descrito na literatura para as plantas herbáceas (Canhoto, 2010). Por outro lado, a redução da concentração de sais no meio de cultura para metade é um processo utilizado para promover a rizogénese (Canhoto, 2010), tendo também sido aplicado no enraizamento dos rebentos de violeta africana. As plântulas obtidas foram posteriormente transferidas para um substrato de transplante (turfa e vermiculite), para aclimatização em estufim, antes de serem transferidas para o solo (violeta africana) ou campo (couve-flor). As etapas desta fase descrevem-se e ilustram-se no procedimento 3, para a couve-flor, e também se utilizaram para a violeta africana (ver Anexo 5).

No que diz respeito ao meio de cultura, além da utilização do meio MS, procedeu-se a um ensaio com as duas plantas em que se substituiu este meio por adubo líquido

universal KB (cuja composição se descreve no Anexo 1), comercialmente usado na nutrição de plantas. Este ensaio destinou-se a testar a possibilidade de substituir o meio MS por outro economicamente mais vantajoso, a fim de tornar o procedimento mais acessível às escolas. Para a indução de rebentos, foram testados os reguladores de crescimento apresentados na Tabela 3.2, que resume as condições de cultura testadas nas duas plantas.

Para avaliar a capacidade de resposta dos explantes de couve-flor ao meio de indução procedeu-se à análise da taxa de crescimento, através do cálculo da quantidade de massa fresca ao longo do tempo (Dixon, 1985). Determinou-se a massa de dezasseis explantes livres de contaminações, de sete em sete dias, durante cinco semanas (em condições de assepsia na câmara de fluxo laminar), através da utilização de frascos

previamente esterilizados e mudando para novo meio de cultura de quinze em quinze dias. Para a violeta africana, analisou-se a capacidade de resposta dos rebentos ao meio de indução, a partir da determinação da massa de vinte rebentos (previamente estabelecidos in vitro), com procedimento igual ao referido para a couve-flor.

Tabela 3.2 – Condições de cultura testadas.

Couve-flor Violeta africana

Tipo de explante Inflorescência da couve-flor. Limbo e pecíolo da folha; pétalas.

Tipos de meio de cultura MS; adubo líquido universal KB. MS; adubo líquido universal KB. Adubo líquido universal KB

+

Reguladores de crescimento (auxinas e citocininas)

Indução: cinetina (2,5 mg/L); sem

adição de reguladores de

crescimento (controlo).

Indução: cinetina (2,5 mg/L); BAP (2 mg/L) + IBA (0,5 mg/L); sem adição de reguladores de crescimento (controlo). Enraizamento: NAA (0,5 mg/L e 1 mg/L); IBA (0,5 mg/L e 1 mg/L). Meio MS + Reguladores de crescimento (auxinas e citocininas)

Indução: cinetina (2,5 mg/L); IAA (8 mg/L); cinetina (2,5 mg/L) + IAA (8 mg/L); sem adição de reguladores de crescimento (controlo).

Enraizamento: sem adição de reguladores de crescimento.

Indução em limbo e pecíolo: BAP (2mg/L) + IBA (0,5 mg/L); BAP (2,25 mg/L) + IBA (0,0203 mg/L).

Indução em pétalas: NAA (0,2 mg/L) + BAP (1,0 mg/L); NAA (1,0 mg/L) + BAP (1,0 mg/L).

Enraizamento: sem adição de reguladores de crescimento.

Soluções desinfectantes Lixívia com detergente a 20, 30 e 40%; solução de álcool etílico a 70%; Benlate a 1g/L.

Água com detergente; lixívia com detergente a 14, 20 e 30%; solução de álcool etílico a 50 e 70%; Benlate a 1g/L.

Fotoperíodo; intensidade luminosa e temperatura

Fotoperíodo de 16h de luz; intensidade luminosa de 45 μmol m-2

s-1 fornecida por lâmpadas fluorescentes; temperatura de 221º C.

Objectivos específicos

:

 Conhecer a técnica de micropropagação por cultura in vitro como forma de produzir milhares de plantas geneticamente iguais, a partir de uma planta original;

 Manusear material em condições de assepsia;

 Estudar a indução de raízes, caules e folhas na cultura in vitro de couve-flor e violeta africana;

 Conhecer as etapas da micropropagação;

 Manipular correctamente material vegetal para a transferência das plântulas estabelecidas in vitro para ex vitro;

 Conhecer as principais dificuldades na adaptação das plantas às condições ex vitro;

 Integrar a micropropagação numa perspectiva mais vasta de produção vegetal com recurso a técnicas de biotecnologia vegetal.

Cuidados para que as culturas não se contaminem por bactérias e fungos:

 Esterilizar durante cerca de 20 minutos, à temperatura de 121ºC e à pressão de 1 atmosfera todo o material necessário – pinças, cabos de bisturi, placas de Petri e frascos de vidro. Esterilizar a água destilada para as lavagens dos explantes e a solução de Benlate. Note-se que as soluções de lixívia e de álcool etílico para a desinfecção do material biológico não se esterilizam;

 Colocar um número reduzido de explantes em cada frasco ou placa de Petri, para preservar o maior número possível de explantes livres de contaminações – a infecção de um explante propaga-se aos restantes, pelo que deve colocar-se apenas um explante em cada frasco ou placa de Petri;

 Em condições assépticas na câmara de fluxo laminar (depois de previamente esterilizada pela radiação ultravioleta), efectuar as etapas de divisão dos meios de cultura, inoculação dos explantes e transferência dos rebentos para o meio de enraizamento;

 Lavar as mãos e depois passá-las com a solução de álcool etílico (a 70%), antes de iniciar os trabalhos de manipulação na câmara de fluxo laminar. Limpar a bancada da câmara de fluxo laminar com a mesma solução.

Materiais, reagentes e equipamentos:

Os materiais, reagentes e equipamentos para este trabalho prático apresentam-se nas Tabelas 3.3, 3.4, 3.5 e 3.6. A preparação de meios de cultura e soluções descreve- se no Anexo 1.

Tabela 3.3 – Materiais, reagentes e equipamentos para a preparação de meios de cultura.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO REAGENTES EQUIPAMENTOS

 1 balão Erlenmeyer de 1000 mL

 1 barra magnética

 1 frasco de vidro de 1000 mL, com tampa, para autoclave (e.g. Schott)

 frascos de vidro com tampa para autoclave (esterilizados)

 1 micropipeta P200 e P1000

 película aderente

 pontas de 200 L e 1000 L

Para 1 litro de meio de cultura:

 sacarose ou açúcar de cozinha – 30 g

 agar – 7 g

 água destilada

 meio MS (Murashige & Skoog) com macronutrientes, micronutrientes e vitaminas – 4,4 g

 reguladores de crescimento (auxinas e/ou citocininas)

 agitador magnético  autoclave  balança de precisão  câmara de fluxo laminar  medidor de pH

Tabela 3.4 – Materiais, reagentes e equipamentos para a desinfecção e inoculação dos explantes no meio de cultura.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 algodão hidrófilo

 cabos de bisturi (esterilizados)

 1 colher de chá em inox (esterilizada)

 frascos de vidro de boca larga, com tampa, para autoclave (esterilizados)

 lâminas de bisturi (esterilizadas)

 marcador de acetato

 papel de embrulho (e.g. Kraft)

 placas de Petri (esterilizadas)

 película aderente

 pinças (esterilizadas)

 autoclave

 câmara de fluxo laminar

REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO

 água destilada (esterilizada)

 solução de álcool etílico a 50 e 70% (v/v) – 250 mL

 solução fungicida de Benlatea 1g/L – 250 mL (esterilizada)

 lixívia comercial com detergente Domestos a 14, 20, 30 e 40% (v/v) – 250 mL

 couve-flor (inflorescência)

 violeta africana (limbo e pecíolo da folha; pétalas de flor)

Tabela 3.5 – Materiais, reagentes e equipamentos para a transferência dos rebentos para o meio de enraizamento.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 cabos de bisturi (esterilizados)

 marcador de acetato

 papel de embrulho (e.g. Kraft)

 pinças (esterilizadas)

 placas de Petri (esterilizadas)

 lâminas de bisturi (esterilizadas)

 autoclave

 câmara de fluxo laminar

 esterilizador de pinças e bisturis

 suporte de pinças e bisturis

REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO

 solução de álcool etílico a 96% (v/v)  rebentos de couve-flor e de violeta africana

Tabela 3.6 – Materiais, reagentes e equipamentos para a transferência de plântulas para o substrato de transplante e aclimatização.

MATERIAL DE LABORATÓRIO E OUTRO EQUIPAMENTOS

 1 frasco pulverizador

 2 sacos de autoclave

 tabuleiro de plástico

 turfa e vermiculite (proporção 2:1) (esterilizadas)

 vasos de plástico pequenos (6-8 cm de diâmetro)

 autoclave

 estufim

REAGENTES MATERIAL BIOLÓGICO

 água destilada – 2000 mL  plântulas de couve-flor e de violeta africana

3.2.2.2. MANIPULAÇÃO DE DNA E ENGENHARIA GENÉTICA

Os trabalhos práticos iniciaram-se com a extracção de DNA de células vegetais provenientes de diversos alimentos. Estas actividades foram desenvolvidas para contextos educativos dos ensinos básico e secundário, desde procedimentos muito simples, até aos de maior nível de exigência, em termos de reagentes e processos, com

vista à obtenção de amostras de DNA para electroforese. Em engenharia genética, desenvolveu-se uma actividade experimental para determinar o tamanho dos fragmentos resultantes da digestão do DNA lambda () por enzimas de restrição. Realizou-se, ainda, uma actividade laboratorial simples de transformação genética, em discos de raiz de cenoura, utilizando uma estirpe selvagem de Rhizobium radiobacter, capaz de levar à formação de tumores numa zona de ferimento.

A) EXTRACÇÃO DE DNA DE CÉLULAS VEGETAIS E AVALIAÇÃO DA SUA

No documento Biotecnologia: concepção e validação de trabalhos práticos (páginas 154-159)