CORREÇÃO DA MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO I IN VITRO APÓS TRATAMENTO COM MICRO- CÁPSULAS CONTENDO CÉLULAS SUPEREX- PRESSANDO ALFA-L-IDURONIDASE
GUILHERME BALDO; VALESKA LAGRANHA; FABI- ANA MAYER; VERÓNICA MUÑOZ-ROJAS; IDA SCH- WARTZ; MAIRA BURIN; ROBERTO GIUGLIANI; UR- SULA MATTE
Introdução: A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal caracterizada pela deficiência de alfa-L-iduronidase (IDUA) e por uma série de mani- festações clínicas características. Tratamentos disponí- veis incluem terapia de reposição enzimática (TRE) e transplante de medula óssea, ambos possuindo limita- ções, o que justifica a busca por novas terapias. Objeti- vo:Verificar a capacidade de células BHK encapsula- das superexpressando IDUA de corrigir fibroblastos de pacientes com MPS I in vitro. Metodologia:O plasmí- deo pRIDUA foi transfectado em células da linhagem BHK. Clones superexpressando IDUA foram selecio- nados, imobilizados em microesferas de alginato e estas foram co-cultivadas com fibroblastos de pacien- tes com MPS I. A atividade enzimática (nmol/h/mg prot) foi medida nos fibroblastos após 15, 30 e 45 dias de co-cultivo (n=3/tempo). Fibroblastos não tratados foram usados como controle negativo (n=3). A enzima beta-galactosidase (B-GAL) foi usada como enzima de referência. A análise estatística foi realizada por A- NOVA e Duncan. Resultados: Um clone expressando níveis 3000X superiores às BHK não-tranfectadas foi obtido e encapsulado. O tamanho médio das cápsulas produzidas foi 399,0 ± 99,5 µm. Os fibroblastos MPS I não-tratados tiveram baixos níveis de IDUA (6,1 ± 0,5). Após 15 dias de co-cultivo, um incremento na atividade enzimática foi observado, alcançando níveis de 60,7 ± 23,3 (p O uso de clones encapsulados possui potencial como alternativa para o tratamento da MPS I, elevando níveis de IDUA em células deficientes. A-
poio: FIPE-HCPA; CAPES e CNPq-Rede de Terapia Gênica.
IMPLEMENTAÇÃO DE HISTÓRIAS EM QUA- DRINHOS QUE RETRATAM PROCEDIMENTOS CIENTÍFICOS NO CENTRO DE TERAPIA GÊNICA LEON DE MORAES LISBOA; ANTÔNIO CARLOS BURLAMAQUE NETO; GABRIELLA REJANE DOS SANTOS; CLARICE RICCI; ROBERTO GIUGLIANI;
CARMEN LUCIA BEZERRA MACHADO; URSULA DA SILVEIRA MATTE
INTRODUÇÃO A avaliação dos protocolos de um procedimento de terapia gênica para fibroblastos de pacientes com GM1 tratados com plasmídeos contendo o gene da β-galactosidase ácida nos levou a desenvol- ver materiais de linguagem mais acessível. Criamos duas histórias em quadrinhos seqüenciais: uma retrata a técnica de extração de plasmídeos, a seguinte aborda os métodos de separação por eletroforese, purificação de plasmídeos e transfecção de células em cultivo. OBJE- TIVOS Este trabalho tem como objetivo viabilizar e avaliar o uso de materiais de arte-educação em pesqui- sa científica. MATERIAIS E MÉTODOS Um roteiro foi criado com base nos protocolos utilizados à banca- da. Quatro pesquisadores do Centro de Terapia Gênica foram selecionados para participar da implementação de cada uma das histórias. Estes indivíduos receberam explicações teóricas, assistiram a uma demonstração prática e executaram as técnicas individualmente. Os alunos foram entrevistados utilizando-se um roteiro semi-estruturado. O conteúdo das entrevistas foi avali- ado qualitativamente e uma atividade de retorno aos participantes foi realizada. RESULTADOS As técnicas citadas acima estão retratadas em quadrinhos em duas histórias seqüenciais, A Libertação de β-galo e Purifi- cação para Transformação de Realidades. A associação das histórias em quadrinhos aos protocolos formais mostra-se viável e capaz de estimular a memória e a inter-relacionar as etapas dos protocolos. CONCLU- SÕES Este trabalho tem produzido materiais de arte- educação com linguagem informal que proporcionam melhor compreensão dos protocolos e reflexões sobre o método científico e o fazer ciência. Roteiros para as demais etapas do procedimento estão sendo escritos.
IDENTIFICAÇÃO DE ALTERAÇÕES NO GENE DA GLICOCEREBROSIDASE EM PACIENTES COM DOENÇA DE GAUCHER.
MARINA SIEBERT; HUGO BOCK; KRISTIANE MICHE- LIN; RICARDO FLORES PIRES; ROBERTO GIUGLIANI;
JANICE CARNEIRO COELHO; MARIA LUIZA SARAI- VA-PEREIRA
A doença de Gaucher (DG) é uma doença autossômica recessiva, causada por mutações no gene da glicocere- brosidase (GBA). O gene GBA está localizado no braço longo do cromossomo 1 (q21.3-23.1), sendo
dividido em 11 exons. Até o momento, mais de 250 mutações diferentes já foram identificadas nesse gene, sendo que 2 delas (a N370S e a L444P) são as mais freqüentes em pacientes com DG. No nosso laborató- rio, os pacientes com DG confirmados por meio da avaliação da atividade enzimática são testados para as mutações N370S, L444P, del55pb, 84GG e IVS2+1.
Este trabalho teve como objetivo a identificação de alterações na seqüência dos exons 8 e 9 do gene GBA.
A amostra analisada foi composta por 47 pacientes com DG previamente testados para as 5 mutações comuns, sendo heterozigotos para alguma dessas muta- ções ou homozigotos para a seqüência normal nessas regiões. O DNA desses indivíduos foi isolado e as regiões correspondentes aos exons 8 e 9 do gene GBA foram amplificadas pela técnica de nested PCR, devido ao emprego de primers específicos envolvendo apenas a região do gene funcional. Os produtos amplificados foram submetidos à técnica de SSCP em gel de MDE 6%, seguida de coloração com solução de nitrato de prata para a visualização dos fragmentos. A aplicação da metodologia descrita acima, possibilitou a identifi- cação de 12 pacientes com alteração no padrão de migração. Essas amostras estão sendo analisadas atra- vés do seqüenciamento direto. Esse protocolo de avali- ação laboratorial permitiu a identificação de pacientes com alterações nucleotídicas nas regiões testadas.
Desta forma, pacientes com mutações raras nas regiões testadas poderão ser identificados, possibilitando o melhor aconselhamento genético para as famílias des- ses indivíduos (Apoio Financeiro: CNPq, FIPE- HCPA).
ANÁLISE DA ADESÃO AO TRATAMENTO DE PACIENTES COM FENILCETONÚRIA ATENDI- DOS EM UM AMBULATÓRIO UNIVERSITÁRIO DE REFERÊNCIA.
LUCIANA GIUGLIANI; TATIÉLE NALIN, SORAIA POLONI, FLÁVIA XAVIER, TATIANE ALVES VIEIRA, LILIA FARRET REFOSCO CRISTINA BRINCKMANN NETTO, CAROLINA FISCHINGER MOURA DE SOUZA, ROBERTO GIUGLIANI, IDA VANESSA DOEDERLEIN SCHWARTZ.
O ambulatório de distúrbios metabólicos do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas Porto Alegre (ATDM-SGM/HCPA) iniciou suas atividades em 1991, tendo como objetivo a assistência médica e nu- tricional a pacientes com erros inatos do metabolismo (EIM), entre eles a Fenilcetonúria (PKU). Sabe-se que níveis elevados de fenilalanina (Phe) são tóxicos ao sistema nervoso central. O tratamento dietético com baixo teor de Phe normaliza os níveis de Phe e previne as manifestações clínicas associadas. Objetivos: Anali- sar a adesão ao tratamento dos pacientes com PKU atendidos no ATDM-SGM/HCPA (Abril/2007- Março/2008, n=64). Métodos: A classificação da ade- são ao tratamento levou em consideração a mediana de Phe no período: boa adesão (se idade < 13 anos: entre
2-6 mg/dL; se idade >13 anos: entre 2-10). Os pacien- tes deveriam ter pelo menos 3 dosagens de Phe para serem incluídos no estudo. Resultados: 53/64 pacientes foram incluídos, sendo 30 do sexo masculino. A média de idade da amostra foi 13±10,1 anos. O uso de Fór- mula Metabólica Especial (FME) foi indicado para 47/53 pacientes. Doze (22,6%) pacientes apresentaram boa adesão ao tratamento. Entre os pacientes sem fa- lhas no fornecimento da FME (16/47 ou 34%), 7/16 (43,7%) foram classificados como apresentando boa adesão. Dos pacientes com falhas no fornecimento da FME (31/47), isto aconteceu em 4/31 (12,9%) pacien- tes. Entre os pacientes classificados como apresentando boa adesão ao tratamento e que necessitam fazer uso de FME (n=11), 7 (63,6%) recebiam regularmente a FME, 7 (63,6%) apresentavam boa adesão à dieta e 5 (45,4%) ambos. Conclusões: Os nossos dados confirmam que a adesão ao tratamento de PKU, em adolescentes, é bai- xa. Falhas no fornecimento da FME e não seguimento da dieta prescrita (mesmo quando a FME é disponível) são freqüentes. Estudos adicionais visando à identifica- ção de outras causas desta baixa adesão, em nosso meio, estão sendo realizados.
CARACTERIZAÇÃO DOS PACIENTES COM FE- NILCETONÚRIA ACOMPANHADOS NO AMBU- LATÓRIO DE DISTÚRBIOS METABÓLICOS DO SERVIÇO DE GENÉTICA MÉDICA DO HOSPITAL DE CLÍNICAS PORTO ALEGRE, BRASIL.
LUCIANA GIUGLIANI; SORAIA POLONI, TATIÉLE NALIN, FLÁVIA XAVIER, TATIANE ALVES VIEIRA, LILIA FARRET REFOSCO, CRISTINA BRINCKMANN NETTO, CAROLINA FISCHINGER MOURA DE SOUZA, ROBERTO GIUGLIANI, IDA VANESSA DOEDERLEIN SCHWARTZ.
Introdução: O ambulatório de distúrbios metabólicos do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas Porto Alegre (ATDM-SGM/HCPA) iniciou suas ativi- dades em 1991, tendo como objetivo a assistência médica e nutricional a pacientes com erros inatos do metabolismo (EIM), entre eles a Fenilcetonúria (PKU).
Sabe-se que níveis elevados de fenilalanina (Phe) são tóxicos ao sistema nervoso central. O tratamento dieté- tico normaliza os níveis de Phe, previne as manifesta- ções clínicas, e promove crescimento adequado. Obje- tivos: Caracterizar a amostra de pacientes com PKU atendidos no ATDM-SGM/HCPA de Abril/2007 a Março/2008. Métodos: Estudo retrospectivo, observa- cional. As seguintes informações foram obtidas a partir de revisão de prontuário: idade, sexo, procedência, consangüinidade parental, idade ao diagnóstico, IMC atual, e presença de retardo mental (RM) de acordo com a impressão da equipe. Resultados: 64 pacientes, de 55 famílias não-relacionadas, foram avaliados. A média de idade foi 13±10,6 anos (sexo masculino:
32/64 pacientes). A mediana de idade ao diagnóstico foi 2,25 meses (nascidos até 1990 (n:13)=3,5 anos;
nascidos entre 1991-2000 (n:43)=2 meses; nascidos a
partir de 2001 (n:8)= 30 dias). A taxa de consangüini- dade parental foi 12,7% (7/55). RM estava presente em 25/61 pacientes (diagnosticados até 2000= 24/25; di- agnosticados de 2001 até 2006= 1/25). Quanto ao esta- do nutricional, 9/57 apresentavam desnutrição/risco nutricional; 35/57 eutrofia; 11/57 sobrepeso; e 2/57 obesidade. Conclusões: A nossa amostra de pacientes é composta principalmente por adolescentes nascidos antes da incorporação da triagem neonatal ao SUS, fato que justifica a média elevada de idade ao diagnóstico e a alta prevalência de RM apresentada pelo grupo. A falta de adesão à dieta pode ser um dos fatores deter- minantes da alta prevalência de alterações nutricionais.
PREVALÊNCIA DE MUTAÇÕES FUNDADORAS NOS GENES BRCA1 E BRCA2 ENTRE INDIVÍ- DUOS DE ALTO-RISCO PARA A SÍNDROME DE PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIA AO CÂNCER DE MAMA E OVÁRIO
PATRÍCIA IZETTI-RIBEIRO; INGRID PETRONI E- WALD; FERNANDO REGLA VARGAS; MIGUEL AN- GELO MARTINS MOREIRA; JESUS PAIS RAMOS;
CARLOS ALBERTO MOREIRA-FILHO; DANIELLE RENZONI DA CUNHA; SARA HAMAGUCHI; MAIRA CALEFFI; ROBERTO GIUGLIANI; PATRICIA ASHTON- PROLLA
Introdução: O câncer de mama é a neoplasia maligna não-cutânea de maior incidência e mortalidade entre as mulheres brasileiras e poucos estudos têm investigado a contribuição de mutações fundadoras nos genes BR- CA para a ocorrência desse tumor. Em mulheres de ascendência judaica Ashkenazi, mais de 30% dos casos de câncer de mama e ovário podem ser atribuídos a mutações nestes genes, sendo as mutações 185delAG e 5382insC em BRCA1 e 6174delT em BRCA2 as mais freqüentes. Objetivos: Determinar a prevalência de mutações fundadoras em uma amostra de pacientes não-Ashkenazi em risco para Câncer de Mama e Ová- rio Hereditários (HBOC, Hereditary Breast and Ovari- an Cancer). Material e Métodos: Foram incluídas famí- lias atendidas nos serviços de oncogenética de centros de referência de Porto Alegre e do Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, entre 2001 e 2007. Todas as famílias preenchiam os critérios para HBOC preconi- zados pela ASCO (American Society of Clinical Onco- logy) e/ou tinham uma probabilidade de mutação em BRCA ≥ 30% e negavam ascendência Ashkenazi. Os fragmentos de interesse foram amplificados por PCR e analisados por seqüenciamento. Resultados: Do total de 137 famílias avaliadas, 5% apresentavam a mutação 5382insC em BRCA1. Entre probandas com câncer de mama bilateral, a freqüência da mutação foi 12%, comparado com uma freqüência de 1,1% (p menor que 0,05) em probandas com câncer de mama unilateral.
As mutações 185delAG e 6174delT não foram encon- tradas nesta amostra. Conclusão: Os resultados deste estudo indicam que em pacientes não-Ashkenazi de alto risco para a síndrome HBOC as mutações funda-
doras 185delAG e 6174delT não são comuns. Já a mutação 5382insC parece ser mais prevalente em paci- entes com câncer de mama bilateral.
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO GENE CFTR ATRAVÉS DE PCR EM TEMPO REAL E SONDAS DE HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTES.
GABRIELA FERRAZ RODRIGUES; MARIANA FITA- RELLI KIEHL; DEISE CRISTINE FRIEDRICH; HUGO BOCK; ROBERTO GIUGLIANI; MARIA LUIZA SARAI- VA-PEREIRA.
A Fibrose Cística (FC) é uma doença autossômica recessiva mais comum em caucasianos, com uma fre- qüência estimada de até 1/2000 nascimentos. As prin- cipais manifestações clínicas são enfermidade pulmo- nar crônica e níveis elevados de eletrólitos no suor. O gene associado à FC localiza-se no cromossomo 7 na região q31-q32 e é denominado Cystic Fibrosis Trans- membrane Conductance Regulator (CFTR). Esse gene codifica um canal de íons cloreto na membrana epiteli- al. Mais de 1000 mutações nesse gene já foram carac- terizadas, sendo que a deleção de três pares de base no exon 10, responsável pela perda de fenilalanina na posição 508 (deltaF508) da proteína, é a mais freqüente na população mundial. Aplicar a metodologia de PCR em tempo real para identificar as mutações deltaF508, G542X, G551D, R553X, N1303K e W1282X no gene CFTR em pacientes com suspeita clínica de FC. A população foi composta por 47 pacientes com suspeita clínica de FC, todos provenientes do estado do Rio Grande do Sul. As regiões de interesse no gene foram amplificadas com primers específicos através do siste- ma TaqMan® o qual foi previamente padronizado no laboratório. Nesse grupo, foram encontradas alterações em 12 pacientes, sendo 8 heterozigotos para a mutação deltaF508, 2 homozigotos para a mutação deltaF508, 1 heterozigoto para mutação a G542X e 1 heterozigoto composto para as mutações deltaF508 e N1303K. Com essa metodologia, foram diagnosticados 3 novos paci- entes com FC, os quais tiveram 2 mutações identifica- das. A metodologia propiciou a análise mais rápida das mutações testadas, o que significa a maior rapidez da liberação do resultado. Além disso, esse sistema é potencialmente adequado para programas de triagem neonatal e outros programas de larga escala (Apoio financeiro: FAPERGS, CNPq, FIPE-HCPA).
AVALIAÇÃO IN VITRO DA VIABILIDADE CE- LULAR E DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA APÓS PRESERVAÇÃO CELULAR HIPOTÉRMICA DE
CÉLULAS ENCAPSULADAS SUPEREXPRES-
SANDO ALFA-L-IDURONIDASE
FABIANA QUOOS MAYER; GUILHERME BALDO;
TALITA GIACOMET DE CARVALHO; VALESKA LA- GRANHA; ROBERTO GIUGLIANI; URSULA MATTE.
Introdução: A microencapsulação celular consiste na internalização de células em um polímero e pode ser interessante para o tratamento de doenças como a mu- copolissacaridose tipo I (MPS I), onde há necessidade da entrega localizada do produto terapêutico (alfa-L- iduronidase - IDUA) no sistema nervoso central. Neste trabalho, pesquisamos métodos para o armazenamento de células viáveis e funcionais que superexpressem IDUA. Objetivo: O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da criopreservação e da preservação hipotérmi- ca em células superexpressando IDUA, encapsuladas em duas concentrações de alginato. Materiais e Méto- dos: células BHK superexpressando IDUA foram encapsuladas em alginato 1% e 1,5%, sendo submeti- das a 30, 60 e 90 dias de criopreservação e 24h de preservação hipotérmica. Como grupo controle foram usadas células livres que tiveram o mesmo tratamento.
As cápsulas e células foram descongeladas e tiveram sua viabilidade e atividade enzimática analisadas. Re- sultados: Após 30 dias de criopreservação, a viabili- dade do grupo controle foi superior aos demais, en- quanto que, após 90 dias, os grupos encapsulados mos- traram maior viabilidade. A atividade enzimática au- mentou no grupo encapsulado em alginato 1,5% após 90 dias de criopreservação. Após a preservação hipo- térmica, a viabilidade dos grupos encapsulados foi maior, enquanto a atividade enzimática aumentou significativamente no grupo com alginato 1,5%. Con- clusões: A encapsulação celular protege as células durante a criopreservação e preservação hipotérmica.
Esta abordagem pode ser importante na criação de um banco de células geneticamente modificadas, que pode- rão ser utilizadas para o desenvolvimento de protocolos para o tratamento de doenças como a MPS I. Apoio:
BIC/UFRGS, FIPE/HCPA, Capes e CNPq.
IDENTIFICAÇÃO DE UMA MUTAÇÃO NOVA
CAUSADORA DE MUCOPOLISSACARIDOSE
TIPO IV B EM DOIS IRMÃOS COM REGRESSÃO