R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 ( 2 ) : 9 1 - 9 4 , a b r - j u n , 1 9 9 2
E D IT O R IA L
L A B O R A T Ó R IO D E
P R O T O Z O O L O G IA IN T E S T IN A L
Estão voltando em evidência, e por causa da AIDS, os novos protozoários intestinais encontrados associados a esta smdrome em humanos7. Esta tem sido sempre a parte mais difícil da protozoologia e, por esta razão, mal feita, na maioria das rotinas de laboratório de parasitologia. Alguns cistos são encontrados numa sedimentação de amostra de fezes ressequidas, e devidam ente relatados. Freqüentemente, não há sequer um micrômetro ocular adequado, tão essencial para a diferenciação das espécies de E n ta m o e b a . A resistência à invasão da mucosa pela E n ta m o e b a h isto ly tic a no homem não parece depender de imunidade mediada por células; conseqüentemente, pacientes com AIDS não são predispostos à amebíase invasiva.
Com pequeno esforço, pode-se obter material fresco, desde que, com luvas, uma partícula de fezes frescas pode ser facilmente extraída do reto, até mesmo de uma criança. Para pacientes com diarréia, a situação ideal é ter um microscópico à mão (de preferência com uma platina aquecida), durante a sigmoidoscopia, e transferir os raspados diretamente para lâminas, a fim de se procurar trofozoítas de E . h is to ly tic a móveis, em úlceras intestinais. Com um microscópio de boa resolução, pode-se ver, não apenas a diferenciação entre nítidos ectoplasma e endoplasma granular, mas também o
movimento brusco não dirigido, e mesmo os
d etalh es da e stru tu ra n u clear e eritró cito s intracitoplasmáticos. Freqüentemente, E. h isto lytic a
vivas invasivas são grandes (20-50/u.).
Na falta desses recursos para se ver trofozoítas vivos, dá-se preferência à cultura. Se as fezes forem coletadas à noite ou de manhã cedo, são colocadas numa estufa a 37 °C. De manhã, a primeira tarefa no laboratório é semear duas culturas que são mantidas a 37 °C durante 48 horas. Estas são analisadas para trofozoítas emintervalos diários. Muitos são vistos, inclusive D i e n t a m o e b a fr a g ili s . Na verdade, sem a cultura, o laboratório perde esse agente patogênico suspeito. Muitos meios de cultura têm sido usados, essencialmete tubos deagar inclinados, enriquecidos com cobertura de proteína e amido basal6. O meio de Robinson se apresenta com bom sucesso8, mas muitos trofozoítas d e£ . h is to ly tic a , E . h a r tm a n i, e
E . p o l e c k i crescem com dificuldade3. Trofozoítas vivos podem estar também em estrias de muco sangüinolento de fezes frescas, tamponadas com
R ecebido para p ub licação em 1 6 /0 6 /9 2
T H E IN T E S T IN A L
P R O T O Z O O L O G Y L A B O R A T O R Y
It is coming back into fashion and it is because of AIDS and the new intestinal protozoa found associated with this syndrome in man7. It has always been the most difficult part o f protozoology and for this reason badly done in most routine parasitology laboratories. A few cysts are found in a sedimentation o f an stool specimen and duly reported. Often there is not even an eyepiece micrometer in place so essential for differentiating E n ta m o e b a species. Resistance to
E n ta m o e b a h is to ly tic a mucosal invasion in man does not apper to depend on cell mediated immunity hence AIDS patients are not prone to invasive amoebiasis.
Little attempt is made to obtain fresh material although with a gloved finger a pellet o f fresh stool can often be extracted from the rectum o f even a child. For diarrhoeal patients the ideal situation is to have the microscope (preferably w ith a warm stage) mounted alongside the sigmoidoscope and transfer fresh scrapings directly to slides to look for motile
E . h isto ly tic a trophozooites from bowel ulcers. With
a good reso lu tio n m icro sco p e n o t only the differentiation between clear ectoplasm and granula endoplasm can be seen and the undirectional thrusting movement but even details o f nuclear structure and intraeytoplasmic erythrocytes may be discerned. Often live invasive E . h i s to ly t ic a are large(20-50p ) .
Failing such facilities to see live trophozoites culture is preferred. Stools, if collected overnight or in the early morning, are put in a 37°C incubator. The first laboratory task in the morning is to seed two cultures which are mintained for 48 hours at 37°C. These are examined at daily intervals for trophozoites. Many are seen including D ie n ta m o e b a f r a g il is . Indeed without culture the laboratory misses this suspected pathogen. Many culture media have been used; essentially enriched agar slants w ith a protein overlay and basal starch6. Robinso n ' s medium is attended by good success8 but many trophozoites o f£ . h is to ly tic a , E . h a r tm a n i, and E . p o l e c k i remain difficult to
grow3.Live trophozoites can also be in a blood mucus fleck from a fresh formed stool mixed with buffered normal saline. Laboratory saline is acid (pH
E d it o r ia l . M a r s d e n P D . T h e in t e s t in a l p r o t o z o o l o g y l a b o r a to r y . R e v is t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 : 9 1 - 9 4 , a b r - ju n , 1 9 9 2 .
solução salinanormal. Asolução salina de laboratório se tom a ácida (pH 6) pelo anidrido carbônico do ar em 24 horas e mata os trofozoítas. Os trofozoítas devem ser corados para lâminas permanetes. Fixador de Shaudinn e coloração pela hematoxilina férrica de Heidenhaim proporcionam a melhor diferenciação nuclear. A cromatina periférica regular e o cariossoma central do núcleo da E . h is to ly tic a contrastam com os dos outros protozoários intestinais não patogênicos. Corante tricromo tende a desbotar com o tempo, mesmo com conservante.
Existem m uitas técnicas de concentração disponíveis para se evidenciar cistos, mas a sedimentação simples é a mais amplamente empregada no Brasil. Embora seja satisfatória com relação a ovos de helmintos, não é muito sensível para cistos de protozoários, especialmente se escassos, porque todos os detritos nas fezes se sedimentam da mesma forma. A concentração pelo formol-éter propocciona uma concentração de cistos de protozoários, vinte vezes maior, embora todos os trofozoítas sejam destruídos. O autor prefere uma modificação da técnica original de Ritchie1. Uma gota de solução iodada de Lugols, adicionada a uma gota de concentrado, facilita o diganóstico. Uma população de cistos deve ser analisada e medida com o micrômetro ocular, pois, freqüentemente, várias cepas estão presentes. G eralm ente, grandes quantidades de G ia r d ia la m b lia estão presentes, embora este parasito possa causar esteatorréia e não ser perceptível numa amostra de fezes. Aqui, o teste com cordão de Beales é útil2.
Embora a concentração de formol-éter geralmente detecte oocistos de Is o p o r a b e lli, do grupo coccídio, uma técnica de flutuação, por centrifugação, de uma solução concentrada de açúcar e sulfato de zinco, e exame da lamínula sobrenadante, é mais sensível. Oocistos de I so p o r a e esporocistos de criptosporidiose são detectados. E n te ro c y to zo o n b ie n e u s i, um parasito m icrosporídico, foi reconhecido recentemente, também, como uma outra causa de diarréia em AIDS. Ele produz um esporo de apenas um micron de diâmetro e, geralmente, até ao momento, tem sido diagnosticado pela biópsia de intestino4 5. Contudo, um trabalho recente confirma a identificação de esporo em fezes, e um novo método desenvolvido de detecção que não use concentração9.
E evidente que um laboratório separado para protozoologia intestinal é uma aquisição vantajosa para a pesquisa atual sobre doenças infecciosas. Como estive envolvido na instalação de vários desses laboratórios, ofereço algumas sugestões práticas:
6) from air carbon dioxide in 24 hours and kills trophozoites. Trophozoites should be stained for pem anent m ounts. S chau d in n ’s fix ativ e and Heidenhain 's iron haematoxylin stain gives the best nuclear differentiation. The regular peripheral chromatin and central karyosome o f tiaeE. h is to ly tic a
nucleus contrast with these or the other non pathogenic intestinal protozoa. Trichrome stain tends to fade with time even under permanent.
For cyst detection many concetration techniques are available but simple sedimentation is the most widely used in Brazil. While satisfactory for helminth eggs it is not very sensitive for protozoal cysts especially ;f scanty because all detritus in the stool sediments as well. Formol ether concentration gives a twenty fold protozoal cyst concentration although all trophozoites are destroyed. The author prefers a modification o f the original Ritchie technique1. A drop o f Lugols iodine added to a drop o f concentrate facilitates morphological diagnosis. A population o f cysts should be examined and measured with the eye piece micrometer as often several species are present. G ia r d ia la m b lia may be present in large num b ers alth o u g h th is p a ra s ite can cause steatorrhorea and not be detectable in a stool specimen. Beales string test is useful here2.
Although formol ether concentration usually detects ls o s p o r a b e ll i oocysts for the coccidial group a flotation technique centrifuging onto a coverslip from a concentrated sugar or zinc sulphate solution is more sensitive. Both lsospora oocysts and cryptosporidiosis sporocysts are detected.
E n te r o c y to z o o n b ie n e u s i a microsporidial parasite has recently been recognised as yet another cause of diarrhoea in AIDS. It produces a spore o f only one micron diameter. It has usually been diagnosed by Bowel biopsy to date4 5. A recent report however confirms stool spore identification and a new detection method developed which does not use concentration9.
It is clear that a separate intestinal protozoology laboratory is a useful addition to current infectious disease investigation. As a w orker who has been involved in establishing several such laboratories a few practical tips are offered:
E d it o r ia l . M a r s d e n P D . T h e i n t e s t in a l p r o t o z o o l o g y la b o r a t o r y . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 : 9 1 - 9 4 , a b r - ju n , 1 9 9 2 .
1. o laboratório deve ser trancado quando não estiver em uso, e o microscópio manuseado somente por pessoas treinadas para a sua manutenção;
2. fazer sem pre um a descrição microscópica completa da amostra de fezes recebida, com referência acor, consistência, presença de sangue, de muco e de outras anormalidades, tais como: bário, corpos estranhos, parasitos visíveis (proglótides, nematóides ou larvas dfpteras); 3. treinar os internos para se apressarem em lavar
as fezes para o laboratório, o mais cedo possível. O pessoal deve começar a trabalhar cedo! 4. usar um microscópio adequado, lâminas e
lamínulas limpas para análise em imersão no óleo;
5. manter sempre no lugar o micrômetro ocular; 6. exam inarem edirapopulaçãodeparasitos, visto
que infecções mistas são comuns;
7. estabelecer técnicas eficazes de culturas para protozoários intestinais;
8. usar técnicas de concentração sensíveis e confiáveis;
9. fazer preparados perm anentes de lâminas positivas ilustrativas, uma vez por semana, por técnico adequadamente treinado em obter boa coloração.
No futuro, muito se esclarecerá com relação a outros protozoários intestinais e AIDS. B a la n tid iu m c o li , que pode geralm ente ser cultivado com facilidade, certamente será relatado como um agente patogênico associado à AIDS. Resta ser definido o papel ú e D ie n ta m o e b a fr a g ilis , T ric h o m o n a s h o m n is, B l a s t o c y t i s e S a r c o c y s t i s em pacientes com im u n o d e fic iê n c ia . U m dos p ro b le m as no preenchimento dos postulados de Koch é que, freqüentemente, não há modelos animais, exceto, possivelmente, os macacos mais diferenciados, atualmente proibidos.
U m último aspecto importante daprotozoologia intestinal se refere à intermitência da excreção do parasito, que nunca foi pesquisada de modo s a tis fa tó rio . A té os m elh o res la b o ra tó rio s recomendam a análise de três amostras de fezes6. Obviamente, em parte, isto se refere à dieta e duração do trânsito. Este último pode ser demorado em pacientes numa área endêmica de doença de Chagas, d e v id o aos d an o s o c o rrid o s n o s g â n g lio s parassimpáticos do músculo liso do intestino. Talvez esta situação seja uma justificativa para o uso de um purgante salino para se encontrar protozoários intestinais.
1. the laboratory should be locked when not in use and the microscope only used by people trained in its maintenance;
2. always provide a full macroscopic description o f the stool specimen received as regards colour, consistency, presence o f blood and mucus and other abnormalities (eg. Barium, foreign bodies, visible parasites (proglottids, nematodes or dipteran larvae);
3. train interns to rush fresh stool to the laboratory holding incubator as early as possible. Staff must start work early!
4. use an optimal microscope and thin clean slides and coverslips that permit oil examination; 5. have the eye piece micrometer always in place; 6. examine and measure a population o f parasites
as mixed infections are common;
7. establish effective culture techniques for intestinal protozoa;
8. use reliable sensitive concentration techniques; 9. make permanent mounts o f significant positive
slides once a week with a suitable trained technician for the difficult staining.
Much will become apparent regarding other intestinal protozoa and AIDS in the future.
B a la n tid iu m c o li which can usually be cultivated with ease will certainly be reported as a pathogen associated with AIDS. The role o f D i e n ta m o e b a
f r a g i l i s , T r ic h o m o n a s h o m in is , B l a s to c y s tis and
S a r c o c y stis in immunosuppressed patientes remains
to be defined. One o f the problems in fulfilling Kochs postulates is that there are frequently no animal models, apart possibly from the high apes which are prohibited today.
A fin al im p o rta n t a sp e c t o f in te s tin a l protozoology relates to the intermittency o f parasite
excretion which has never been satisfactorily investigated. Even the best laboratories recommend die examination of three stool specimens6. Obviously in part this relates to diet and transit time. The latter may be slowed in many patients in a Chagas endemic area due to damage to the parasympathetic ganglia in the gut smooth muscle. Perhaps this situation is a justification for the use o f a saline purge to find intestinal protozoa.
E d it o r ia l . M a r s d e n P D . T h e i n t e s t i n a l p r o t o z o o l o g y la b o r a t o r y . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 5 : 9 1 - 9 4 , a b r - ju n , 1 9 9 2 .
REFERENCES
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2 B e a l C B , V ie n s P , G ran t R G L , H u g h e s J M . A n e w t e c h n iq u e fo r s a m p lin g j e n u n a l c o n t e n t s . T h e A m e r ic a n J o u rn a l o f T r o p ic a l M e d ic in e a n d H y g ie n e 1 9 : 3 4 9 - 3 5 2 , 1 9 7 0 .
3 . B o te r o D . R a te o f g r o w th o f E n ta b o e b a h is to l y ti c a in d iffe r e n t c u ltu r e m e d ia . T r a n s a c tio n s o f th e R o y a l S o c ie t y o f T r o p ic a l M e d ic in e a n d H y g ie n e 5 5 : 5 3 9 -5 4 6 , 1 9 6 1 .
4 . B r y a n R T , C a li A , O w e n R L , S p e n c e r H C . M ic r o s p o r id ia O p p o r tu n is tic P a th o g e n s in P a tien ts w ith A I D S . In : P r o g r e s s in C lin ic a l P a r a s it o lo g y V o l 2 . E d . S u n T .F ie ld e W o o d . N e w Y o r k p . 1 -2 0 , 1 9 9 1 .
5 . E e ftin c k S c h a tte n k e r k J K M , V a n G o o l T , V a n K e te l R J , B a r te ls m a n J F W M , K u ik e n C L , T e rp str a W J ,
R e is s P . C lin ic a l s ig n if ic a n c e o f s m a ll in te stin a l m ic r o s c o p o r id io s is in H I V -I -in fe c te d in d iv id u a ls . T h e L a n c e t 3 3 7 : 3 9 5 - 3 9 8 , 1 9 9 1 .
6 . M e lv in D M , B r o o k e M M . L a b o r a to r y P r o c e d u r e fo r t h e D ia g n o s is o f In te stin a l P a r a s it e s . 3 r d E d . 2 3 3 p . H H S P u b lic a tio n N o ( C D C ) 8 2 - 8 2 8 2 , 1 9 8 2 . 7 . Q u in n T J . P r o to z o a n In f e c tio n s , p . 6 6 - 6 8 . In: S m ith P D . M o d e r a to r G a s tr o in te s tin a l I n fe c tio n s in A I D S . A n n a ls o f In tern a l M e d ic in e 1 1 6 : 6 3 - 7 7 . 1 9 9 2 . 8 . R o b in s o n G L . T h e la b o ra to ry d ia g n o s is o f h u m a n
p a ra sitic a m o e b a e . T r a n sa c tio n s o f th e R o y a l S o c ie t y o f T r o p ic a l M e d ic in e a n d H y g ie n e 6 2 : 2 8 5 - 2 9 4 ,
1 9 6 8 .
9 . W e b e r R , B r y a n R T , O w e n R L , W ilc o x C M , G o r e lk in L , V is v e r s a r a G S . I m p r o v e d lig h t m ic r o s c o p y d e te c tio n o f m ic r o s p o r id ia l s p o r e s in s to o l a n d d u o d e n a l a s p ir a t e s .N e w E n g la n d J o u rn a l o f M e d ic in e 5 2 6 : 1 6 1 - 1 6 5 , 1 9 9 2 .
Philip D. Marsden
Núcleo de Medicina Tropical e Nutrição Universidade de Brasília, DF
