I UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)
ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO
DA ESPÉCIE VEGETAL
Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg
Por
I
LUIS ARMANDO CANDIDO TIETBOHL
ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE
VEGETAL Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg
______________________________
por
Luis Armando Candido Tietbohl
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde
(PPG-CAPS)
da
Universidade
Federal
Fluminense, como parte dos pré-requisitos
para obtenção do grau de mestre. Área de
Concentração:
Desenvolvimento
de
Produtos para Saúde
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
II
T 564 Tietbohl, Luis Armando Candido
Estudo químico e biológico da espécie vegetal
Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg /
Luis Armando Candido Tietbohl,
Orientador: Dr.Leandro Machado Rocha - Niterói, 2014.
157 f.
Dissertação (Mestrado). Universidade Federal Fluminense, 2014.
1. Myrciaria floribunda 2. Óleo essencial 3. Farmacognosia
III
LUIS ARMANDO CANDIDO TIETBOHL
ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE
VEGETAL Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde
(PPG-CAPS)
da
Universidade
Federal
Fluminense, como parte dos pré-requisitos
para obtenção do grau de mestre. Área de
Concentração:
Desenvolvimento
de
Produtos para Saúde
Aprovado por:
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________
Prof. Dr. LEANDRO MACHADO ROCHA - Orientador
Universidade Federal Fluminense - UFF
_________________________________________________________
Profa. Dra. MARIA DENISE FEDER
Universidade Federal Fluminense - UFF
________________________________________________________
Profa. Dra. ADRIANA PASSOS OLIVEIRA
IV
Este trabalho foi realizado
sob a orientação do Prof. Dr.
V
Dedico este trabalho aos
meus pais, Armando e
Lucelaine, por serem meus
primeiros e eternos mestres,
por todo amor, apoio e
incentivo que sempre me
VI
“Não sabendo que
era impossível, foi lá e fez”
VII
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, por estar sempre ao meu lado, me guiando e dando-me forças para realizar todos meus sonhos e concluir este trabalho.
Aos meus maravilhosos pais, Armando e Lucelaine, que nunca mediram esforços para me dar todo o suporte necessário para que eu pudesse realizar meus sonhos, e que são modelos concretos, e não teóricos, de amor, profissionalismo, determinação, superação e de tantas outras qualidades. Sem dúvida, sem eles nada disso seria possível.
Aos meus irmãos, Luzandro e Leandro, minhas referências, meus companheiros, meus suportes, minhas fontes contínuas de aprendizado. À Daiane que entrou para minha família fazendo meu irmão mais feliz com meu primeiro e amado sobrinho Sebastian. À minha amada namorada Karolina Torres Santos por sempre me apoiar em tudo e por todo amor, incentivo, paciência e entendimento. Te amo.
Ao meu orientador Prof. Leandro Machado Rocha que além de orientador se tornou um grande amigo no qual sempre pude contar e confiar e por ter me dado esta grande oportunidade de realizar este trabalho.
Ao amigo Caio Pinho Fernandes que sempre me ajudou nos experimentos, me incentivando e dando auxílio no que era necessário. Também por todas minhas publicações.
Ao amigo e aluno de iniciação científica Francisco Paiva Machado pela ajuda incansável nos experimentos e amizade.
À Prof.ª Maria Denise Feder e à todos do seu laboratório pela excelente colaboração. Aos meus professores da Universidade Federal do Pampa, Elton, Cleci, Fabiana, Andreas que me ajudaram a vir para Niterói realizar este sonho.
À Prof.ª Adriana Passos de Oliveira por toda ajuda nos experimentos e na elucidação estrutural das substâncias químicas.
Ao Prof. Marcelo Guerra pela amizade e valiosa ajuda com o material botânico nas coletas na Restinga de Jurubatiba.
À família LTPN:, Adriana, Caio, Raquel, Jeane, Rodrigo, Jonathas, Barbara, José Carlos, Ricardo, Fernanda, Henrique, Otávio, Arthur, Iraí, Bruno, Francisco, Diogo por tornar o dia a dia muito mais agradável e pela contribuição não só para este trabalho, mas também para meu aprendizado de uma forma geral.
A professora e amiga Bettina Ruppelt pela e ajuda e revisão deste trabalho. Ao amigo vascaíno Frederico e Joaquim por toda amizade e hospitalidade.
VIII
À todos os meus amigos e familiares que com certeza contribuíram de alguma forma para o meu desenvolvimento pessoal e realização desse trabalho.
À todos meus amigos de Rosário do Sul que sempre acreditaram em meu potencial. À todos os professores e funcionários da Faculdade de Farmácia e do PPG-CAPS, em especial a coordenadora do programa.
À CAPES pelo apoio financeiro.
IX
Resumo
TIETBOHL, Luis Armando Candido. Estudo químico e biológico da espécie vegetal
Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg. Niterói, 2014. Dissertação de
Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense.
A espécie Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg., Myrtaceae, popularmente conhecida como camboim-amarelo, foi coletada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (RJ, Brasil). Esta espécie é rica em estruturas secretoras de óleo essencial. Neste trabalho, é descrita a análise da composição química dos óleos essenciais de folhas, caules e flores. O monoterpeno 1,8 cineol apresenta-se como componente majoritário nos óleos de folhas (38,4%) e flores (22,8%). No óleo de caules
a substância majoritária foi o acetato de farnesila (19,9%). Além das substâncias já
descritas para o óleo essencial de folhas desta espécie, foram identificadas pela primeira vez: α-pineno (0,4%), mirceno (0,7%), (Z)-β-ocimeno (0,8%), γ-terpineno (0,8%), acetato de geranilo (1,5%), γ-himachaleno (7,0%), valenceno (1,8%), δ-amorpheno (4,0%), zonareno (4,6%), selina-3.7(11)-dieno (3,8%), neo-intermedeol (0,8 %) e (2E,
6Z)-farnesol (1,4%). As análises dos óleos essenciais de caules e flores ainda não
haviam sido descritas para esta espécie. Também foram isolados e identificados pela primeira vez na espécie o triterpeno ácido betulínico e o flavonoide miricetina 3-O-β-galactosídeo da fração acetato de etila de folhas. O óleo essencial de folhas foi avaliado quanto as atividades: anticolinesterásica, antimicrobiana e inseticida. Os óleos de folhas, flores e caules foram avaliados quanto a atividade anticolinesterásica, mostrando um
IC50 de 1583 e 681 μg/mL para flores e folhas, respectivamente. O óleo de caules não
apresentou atividade. O teste de susceptibilidade antimicrobiana do óleo essencial das folhas utilizando cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213, apresentou um CMI de 250 µg/mL. A atividade inseticida do óleo essencial das folhas foi avaliada frente aos fitófagos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus e os óleos essenciais das folhas e flores foram avaliados frente ao percevejo hematófago da espécie Rhodnius prolixus. Os tratamentos dos insetos com os óleos essenciais de M. floribunda induziram mortalidade, atraso no desenvolvimento e inibição de muda. Para avaliar a atividade hipoglicemiante e integridade do fêmur em ratos machos, foi utilizado o extrato aquoso das folhas de M. floribunda a uma concentração de 5 % (p/v), onde foi possível verificar ao final dos 42 dias de tratamento uma diferença significativa na glicemia e resultados similares para o fêmur. O grupo tratado apresentou resultados significativamente
aumentados de colesterol, proteína total, fósforo, magnésio e aspartato
aminotransferase, massa de fígado menor e massa dos rins maiores quando comparados com o grupo controle.
Palavras-chave: Myrciaria floribunda, Myrtaceae, óleo essencial, atividade inseticida, atividade anticolinesterásica, atividade antibacteriana, atividade hipoglicemiante.
X
Abstract
TIETBOHL, Luis Armando Candido. Chemical and biological study of plant species
Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg. Niterói, 2014. Dissertação de
Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense
The species Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg., Myrtaceae, popularly known as “camboim-amarelo”, was collected in the “Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba” (RJ, Brazil). This species is rich in secretory structures essential oil. This work describes the analysis of the chemical composition of the essential oil of leaves, stems and flowers in that the monoterpene 1.8-cineole present as the major component in the oil leaves and flowers corresponding 38.4% 22.8%, respectively. Already at oil from stems the substance majority was farnesyl acetate (19.9%). In addition to the substances already described for the essential oil from leaves of the species were first identified the following substances : α-pinene (0.4%), myrcene (0.7%), (Z)-β-ocimene (0.8%), terpinene (0.8%), geranyl acetate (1.5%), γ-himachalene (7.0%), valencene (1.8%), δ-amorphene (4.0%), zonarene (4.6%), 3.7-selina (11) -diene (3.8%), neo-intermedeol (0.8%) and (2E, 6Z)-farnesol (1.4%). The analysis of essential oils from stems and flowers had not yet been described. Were also isolated and identified for the first time in the kind triterpene betulinic acid and flavonoid myricetin 3-O-β-galactoside of ethyl acetate fraction of leaves. The essential oil from leaves was evaluated for activities: acetylcholinesterase, antimicrobial and insecticidal. The oils from leaves, flowers and stems were evaluated for
anticholinesterase activity, showing an IC50 of 1583 and 681 mg/mL for flowers and
leaves, respectively, and stems showed no activity. The antimicrobial susceptibility testing essential oil from leaves using Staphylococcus aureus ATCC 29213, filed an IMC 250 μg/mL. Insecticidal activity of the essential oil from the leaves was evaluated against phytophagous Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus, and the essential oil from the leaves and flowers were evaluated against the Rhodnius prolixus. All treatments of insects with essential oils of M. floribunda induced mortality, developmental delay and inhibition of molting. To evaluate the hypoglycemic activity and femur health in male rats, were evaluated with the aqueous extract of leaves of M.
floribunda at a concentration of 5%, which was verified at the end of the 42 days of
treatment the infusion decreased the glycemia e maintenance results similar to the femur. Treated group apresented results significantly increased to cholesterol, total protein, phosphorus, magnesium and aspartate aminotransferase, mass minor liver and
kidney mass was increased compared with the control group.
Palavras-chave: Myrciaria floribunda, Myrtaceae, essential oil, acetylcholinesterase activity, antimicrobial activity, insecticidal activity, hypoglycemic activity.
XI
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1: Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. 2 Figura 2: Gráfico do perfil químico da família Myrtaceae. 4 Figura 3: Foto da espécie Myrciaria floribunda (H.West ex Willd) O.Berg no
Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba.
6
Figura 4. Principais núcleos monoterpênicos. 8
Figura 5. Esquema de partição do extrato hexânico de Myrciaria floribunda. 16 Figura 6. Extração do óleo essencial das folhas, caules e flores de Myrciaria
floribunda.
17
Figura 7. Cromatógrafo a gás GCMS-QP5000 (SHIMADZU). 20 Figura 8. Espectrômeto de Ressonância Magnética Nuclear. 21 Figura 9. Reação colorimétrica de formação do ácido tionitrobenzóico. 24 Figura 10. A: Ninfa de 4, 5º estágio e adulto de O. fasciatus. B: Adultos de D.
peruvianus.
25
Figura 11. Ninfas de 4 estágio durante o processo de aplicação da amostra. 26 Figura 12. A: Ninfas do 5º estágio de R. prolixus. B: R. prolixus adultos. 28 Figura 13. Cromatografia em camada fina com os extratos em hexano, em
acetato de etila e em metanol.
31
Figura 14. Coluna cromatográfica de vidro contendo Amberlite® XAD® 2
(SUPELCO® ANALYTICAL – SIGMA-ALDRICH) como fase estacionária.
Amostra: extrato em acetato de etila. Eluente: água, metanol, acetonitrila.
32
Figura 15. Cromatografia em camada fina com frações da coluna XAD. 34 Figura 16. Cromatografia em camada fina com substância isolada e com os 35
XII
padrões de ácido betulínico, ácido ursólico e ácido oleanólico.
Figura 17. Espectro de APT do Triterpeno ácido. 36 Figura 18. Coluna de Sephadex (SP-A) e CCF com as frações reunidas. Em
destaque: fração SP-A I.
39
Figura 19. Coluna de Sephadex (SP-B) e CCF com as frações reunidas. Em
destaque: fração SP-B I.
40
Figura 20. Coluna de Sephadex (SP-C) e CCF com as frações reunidas. Em
destaque: fração isolada SP-C 29.
41
Figura 21. Estrutura química do flavonoide Miricetina. 42 Figura 22. Espectro de RMN de 1H do flavonol miricertina 3-O-galactosídeo. 42 Figura 23. Espectro de 2D de RMN (HSQC) do flavonol miricetina
3-O-galactosideo.
43
Figura 24. A: Cromatograma do extrato aquoso das folhas de Myrciaria
floribunda B: Espectro de absorção de UV (200-450 nm) das substâncias
1-10.
48
Figura 25. Regressão linear entre atividade da AChE (%) x logaritmo natural
da concentração eficaz de eserina, óleos essenciais de flor, folha e caule.
49
Figura 26. Avaliação da CMI do óleo essencial obtido a partir das folhas de
M. floribunda frente à S. aureus 29213.
51
Figure 27. Avaliação biológica usando diferentes concentrações do óleo
essencial de Myrciaria floribunda sobre a mortalidade após o tratamento tópico de ninfas de quarto estágio Dysdercus peruvianus.
53
Figure 28. Avaliação biológica usando diferentes concentrações do óleo
essencial de Myrciaria floribunda sobre a metamorfose após o tratamento tópico de ninfas de quarto estágio Dysdercus peruvianus.
54
XIII
essencial de Myrciaria floribunda sobre a mortalidade após o tratamento tópico de ninfas de quarto estágio Oncopeltus fasciatus.
Figure 30. Avaliação biológica usando diferentes concentrações do óleo
essencial de Myrciaria floribunda sobre a metamorfose após o tratamento tópico de ninfas de quarto estágio Oncopeltus fasciatus.
56
Figura 31. Avaliação biológica usando diferentes concentrações do óleo
essencial de Myrciaria floribunda sobre a mortalidade após o tratamento tópico de ninfas de quinto estágio de Rhodnius prolixus.
59
Figura 32. Avaliação biológica usando diferentes concentrações do óleo
essencial de Myrciaria floribunda sobre a mortalidade após o tratamento tópico de ninfas de quinto estágio de Rhodnius prolixus.
60
Figura 33. Malformações dos insetos Rhodnius prolixus provocadas pelo
tratamento contínuo com os óleos essenciais de folhas e flores de Myrciaria
floribunda.
61
Figura 34. Desenvolvimento de massa corporal (g). C, grupo controle e MF,
grupo experimental tratado com infuso de Myrciaria floribunda em uma concentração de 5%.
63
Figura 35. Composição mineral do fêmur. (A) de cálcio, (B), de fósforo e (C)
de magnésio. C, o grupo de controlo e MF, o grupo experimental tratado com
Myrciaria floribunda, numa concentração de 5%.
XIV
LISTA DE TABELAS
Página Tabela I. Frações da coluna XAD-2 realizada com o extrato em
acetato de etila agrupadas de acordo com seu perfil em cromatografia em camada fina.
33
Tabela II. Comparação dos deslocamentos químicos de 13C (500/125 MHz, Piridina d4) do ácido betulínico obtidos com os dados da literatura no mesmo solvente.
37
Tabela III. Dados comparativos de RMN da H1 da substância 2 com os dados literatura no mesmo solvente (Metano-d4).
43
Tabela IV. Partes da planta, rendimento obtido e aparência dos
óleos essenciais da Myrciaria floribunda.
45
Tabela V. Abundância relativa (%) dos constituintes de óleos
essenciais de partes da planta a partir de Myrciaria floribunda.
46
Tabela VI. Glicemia e análises sorológicas dos animais controle e
tratados com o extrato aquoso das folhas de Myrciaria floribunda.
64
Tabela VII. Massa dos órgãos e parâmetros do fêmur dos animais
controle e tratados com o extrato aquoso das folhas de Myrciaria
floribunda.
XV
ANEXOS
Página Anexo I. Artigo publicado: Comparative Study and Anticholinesterasic
Evaluation of Essential Oils from Leaves, Stems and Flowers of Myrciaria
floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg.
86
Anexo II. Artigo enviado para publicação: Laboratory evaluation of the
effects of essential oil of leaves from Myrciaria floribunda on the development of Dysdercus peruvianus and Oncopeltus fasciatus.
91
Anexo III. Artigo enviado para publicação: The intake of hypoglycemic
Myrciaria floribunda drink maintain femur health but alter the liver and
kidney parameters in male rats.
106
Anexo IV. Artigo a ser enviado para publicação: Effects of essential oils
from Myrciaria floribunda (Myrtaceae) on the development of Rhodnius
prolixus ninphae.
122
Anexo V. Substâncias químicas isoladas e identificadas da espécies vegetal
Myrciaria floribunda.
137
Anexo VI. Constituintes químicos dos óleos essenciais de Myrciaria
floribunda identificados por CG/EM.
XVI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – graus Celcius µL – microlitro µg - micrograma A.C. – antes de Cristo ACh - acetilcolina
AChE –acetilcolinesterase
CCF - Cromatografia em Camada Fina CG – Cromatografia Gasosa
DMSO - dimetil-sulfóxido EM – Espectrômetro de Massas eV – elétron volt
FID - Free Induction Decay g - grama DTNB - 5,5'-Ditiobis(2-Ácido nitrobenzóico) h - hora AI – Indice Aritimético L – litro mL - mililitro mm - milimetro mM – micro molar
XVII M - molar
MHz – Mega hertz
NIST - (National Institute of Standards and Technology) NP/PEG – Natural Products/ Polietilenoglicol
PNRJ – Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba RMN – Ressonância Magnética Nuclear
spp – espécie
TNB - ácido tionitrobenzóico TMS – trimetil-sulfóxido
TTC - cloreto de trifenil tetrazolium UFC – Unidades Formadoras de Colônias DAT – Dias Após Tratamento
XVIII
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba ... 1
1.2 Família Myrtaceae ... 3
1.3 Gênero Myrciaria ... 4
1.4 Myrciaria floribunda (H. West ex Willd.) O. Berg ... 6
1.5 Óleo essencial ... 7
1.6 Atividades biológicas ... 9
1.6.1 Atividade Antimicrobiana ... 9
1.6.2 Atividade Inibitória da Acetilcolinesterase ... 9
1.6.3 Atividade Inseticida ... 10 1.6.4 Atividade Hipoglicemiante ... 12 2 OBJETIVO GERAL ... 14 2.1 Objetivos Específicos ... 14 3 METODOLOGIA ... 15 3.1 Material Vegetal ... 15 3.2 Extratos e partições ... 15
3.2.1 Preparação do Extrato aquoso ... 16
3.3 Extração do óleo essencial ... 16
3.4 Métodos de Isolamento e Purificação ... 18
3.4.1 Cromatografia em Camada Fina ... 18
XIX
3.4.3 Coluna Sephadex ... 19
3.4.4 Análise Cromatográfica do Extrato Aquoso: CLAE-DAD ... 19
3.5 Métodos de identificação e elucidação estrutural ... 20
3.5.1 Cromatografia em fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas ... 20
3.5.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C ... 20
3.6 Atividades biológicas ... 21
3.6.1 Atividade antibacteriana ... 21
3.6.1.1 Microrganismos ... 22
3.6.1.2 Preparação de suspensão bacteriana ... 22
3.6.1.3 Teste de susceptibilidade - Concentração Mínima Inibitória (CMI) ... 22
3.6.2 Atividade anticolinesterásica ... 23
3.6.2.1 Método Quantitativo ... 23
3.6.3 Avaliação da atividade inseticida ... 24
3.6.3.1 Obtenção, manutenção e preparação dos insetos para os testes ... 24
3.6.3.1.1 Colônias dos insetos O. fasciatus e D. peruvianus ... 24
3.6.3.1.1.1 Análise Estatística ... 26
3.6.3.1.2 Rhodnius prolixus ... 27
3.6.3.1.2.1 Análise Estatística ... 28
3.6.4 Atividade Hipoglicemiante ... 28
3.6.4.1 Animais e desenho experimental ... 28
3.6.4.2 Análise Estatística... 30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31
4.1 Análise química dos extratos e frações obtidas ... 31
XX
4.1.2 Análise química do óleo essencial de folhas, caules e flores ... 43
4.1.3 Análise Química do Extrato Aquoso ... 46
4.2 Testes Biológicos ... 48
4.2.1 Atividade anticolinesterásica ... 48
4.2.2 Atividade antibacteriana ... 49
4.2.3 Atividade inseticida ... 50
4.2.3.1 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus ... 50
4.2.3.2 Rhodnius prolixus ... 55
4.3 Atividade hipoglicemiante, sérica e óssea dos animais tratados com extrato aquoso de Myrciaria floribnda ... 60
5 CONCLUSÃO ... 66
6 REFERÊNCIAS ... 68
7.1 ANEXO I. Artigo publicado: Comparative study and anticholinesterasic evaluation of essential oils from leaves, stems and flowers of Myrciaria floribunda (H. West ex Willd.) O. Berg ... 83
7.2 Anexo II. Artigo enviado para publicação: Laboratory evaluation of the effects of essential oil of leaves from Myrciaria floribunda on the development of Dysdercus peruvianus and Oncopeltus fasciatus. ... 88
7.3 Anexo III. Artigo enviado para publicação: The intake of hypoglycemic Myrciaria floribunda drink maintain femur health but alter the liver and kidney parameters in male rats. ... 103
7.4 ANEXO IV. Artigo a ser enviado para pblicação: Effects of essential oils from Myrciaria floribunda (Myrtaceae) on the development of Rhodnius prolixus ninphae. 119 7.5 ANEXO V. Substâncias químicas isoladas e identificadas da espécies vegetal Myrciaria floribunda ... 134
XXI
7.5.1 Ácido Betulínico ... 134
7.5.2 Miricetina-3-O-β-galactosídeo ... 134
7.6 ANEXO VI. Constituintes químicos dos óleos essenciais de Myrciaria floribunda
1 1 INTRODUÇÃO
O Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN), ao longo dos anos, vem desenvolvendo um projeto que visa o estudo das espécies da flora do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. O Parque está localizado no litoral norte fluminense, abrangendo os municípios de Macaé, Carapebus e Quissamã (ARAÚJO et
al., 1998).
A família Myrtaceae é constituída por cerca de 144 gêneros e 4.630 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo (JUDD et al., 2009). Esta família é uma das mais importantes do Brasil com 24 gêneros e 986 espécies (SOBRAL
et al., 2013). A família Myrtaceae é uma das mais representativas do Parque Nacional
da Restinga de Jurubatiba. Espécies brasileiras de diferentes gêneros desta família são estudadas por serem ricas em óleos essenciais (APEL et al., 2006a; APEL et al., 2006b; NAKAMURA et al., 2010; WANNES et al., 2009, LIMA et al., 2012). Aos óleos essenciais são atribuídas propriedades anti-reumática, diurética, anti-inflamatória (DONATO; MORRETES, 2007; DE RAMOS et al., 2010; APEL et al., 2006a), antimicrobiana (APEL et al., 2006a) e inibidor da enzima acetilcolinesterase (TIETBOHL et al., 2012). Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg pertence a esta família e é uma espécie amplamente distribuída na América Central e América do Sul (SOBRAL et al., 2013). Na Restinga de Jurubatiba é popularmente conhecida como “camboim-amarelo” e seus frutos são comestíveis (SARTHOU et al., 2010). Esta espécie vegetal, até o presente momento, apresenta poucos estudos que avaliam seu potencial químico e biológico.
1.1 O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
As restingas constituem um dos habitats que compõem a Mata Atlântica. Estes habitats estão situados em planícies costeiras, formadas por sequências de praias e dunas de areia cobertas por vegetação herbácea e arbustiva anual-arbóreo da vegetação. No passado, as restingas cobriam quase toda a extensão da costa do Estado do Rio de Janeiro (com exceção do litoral rochoso) na Serra do Mar. No entanto, como as
2
restingas estão localizadas em áreas costeiras, local de grande interesse imobiliário, o processo de degradação intenso resultou em uma alteração acentuada e perda deste habitat (ROCHA et al., 2007).
A vegetação de restinga é caracterizada por apresentar uma variedade de formações vegetais, desde herbáceas, passando por formações arbustivas, chegando a florestas cujo dossel não ultrapassa 20 m de altura (GOMES et al., 2007). As restingas possuem uma vegetação muito característica devido a uma combinação de fatores físico-químicos, tais como elevada temperatura, salinidade, grande deposição de salsugem e alta exposição à luminosidade (COGLIATTI-CARVALHO et al., 2001).
O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba foi criado no ano de 1998. Está localizado na região norte do Estado do Rio de Janeiro e abrange os municípios de Macaé, Carapebus e Quissamã (Figura 1).
Figura 1. Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte:
http://www.parkswatch.org acessado em 06 de fevereiro de 2012).
O parque possui 44 quilômetros de extensão de litoral oceânico e abriga 18 lagoas costeiras. Desde a década de 80, a região tem sido alvo de diversos estudos
3
científicos. Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local registrou o uso de 117 espécies pertencentes a 47 famílias e 99 gêneros vegetais. Os usos atribuídos foram comestível, madeireiro, ritualístico, medicinal, ornamental, têxtil, aromatizante, artesanal e corante (SANTOS et al., 2009). O uso medicinal foi a principal utilidade citada, correspondendo a 40 espécies. As famílias vegetais mais citadas como medicinais foram Myrtaceae (4), Orchidaceae (3), Rubiaceae (3) e Verbenaceae (3) (ARAÚJO, 2000).
As famílias mais representativas presentes na Restinga de Jurubatiba são: Guttiferae, Myrtaceae, Leguminoseae, Apocynaceae, Malpighiaceae, Ericaceae, Erythroxylaceae, Bromeliaceae, Cactaceae, Humiriaceae e Sapotaceae (HENRIQUES et
al., 1986).
1.2 Família Myrtaceae
A família Myrtaceae é uma das mais importantes nas diferentes comunidades neotropicais e tem sido freqüentemente citada em estudos florísticos e fitossociológicos realizados nas diversas formações florestais do Sudeste do Brasil (ARANTES; MONTEIRO, 2002).
O número de gêneros e espécies pertencentes à Myrtaceae vem sendo atualizado ao longo dos anos sendo, de acordo com Barroso (1984), em torno de 100 gêneros e 3.500 espécies. Para Mabberley (1997), entretanto, a família reúne cerca de 129 gêneros e 4.620 espécies que correspondem a 1,32% do total de espécies das Magnoliophyta conhecidas. Segundo Judd et al. (2009), o número de gêneros seria de aproximadamente 144, com 4.630 espécies, distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo. E por fim, de acordo com Sobral et al. (2013) no Brasil, são encontrados cerca de 24 gêneros e 986 espécies.
O perfil químico da família Myrtaceae caracteriza-se pela presença de taninos, flavonoides, mono- e sesquiterpenos, triterpenóides, derivados do floroglucinol, cromenos, estilbenóides e outros (Figura 2) (CRUZ; KAPLAN, 2004).
4 Figura 2. Perfil químico da família Myrtaceae. (CRUZ; KAPLAN, 2004).
Cruz e Kaplan (2004), também indicaram que cerca de 70% das plantas pertencentes a essa família têm potencial terapêutico, sendo utilizadas na medicina tradicional em distúrbios gastrointestinais, estados hemorrágicos e doenças infecciosas, sendo as partes mais usadas as folhas, cascas e também os frutos, que são comumente consumidos. Além disso, diversos trabalhos científicos contemporâneos têm respaldado o uso popular de espécimes dos diversos gêneros de Myrtaceae, por meio de diferentes investigações farmacognósticas, relacionadas aos aspectos botânicos (PAULA et al., 2008; DONATO; MORRETES, 2007; CARDOSO; SAJO, 2004), fitoquímicos (COLE
et al., 2007; HUSSEIN et al., 2007; MIGLIATO et al., 2007; GUO; YANG, 2006) e
atividades biológicas (SALVAGNINI et al., 2008; BIAVATTI et al., 2007; KREUGER
et al., 2007; MEDEIROS et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007; AMARAL et al., 2006;
APEL et al., 2006b).
1.3 Gênero Myrciaria
Existem diversos gêneros da família Myrtaceae nativas da flora brasileira que produzem frutos comestíveis. Porém poucas espécies são exploradas em escala comercial e, quando exploradas, a produção é pequena e limitada a determinadas
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regiões, como é o caso da Myrciaria dubia (camu-camu) e da Myrciaria cauliflora (jabuticabeira) (BEZERRA et al., 2000).
Entre todos os gêneros da família Myrtaceae que produzem frutos comestíveis, atualmente apenas quatro (Eugenia, Acca, Myrciaria e Psidium) têm importância econômica (MANICA, 2002). No gênero Myrciaria, estão as jabuticabeiras, com mais de uma dezena de espécies nativas do Centro-Sul/Sudeste brasileiro e o camu-camu nativo na região Noroeste da Amazônia, no Peru, na Venezuela e na Colômbia (DONADIO et al., 2002).
Segundo Alvarado-Vertiz (1969) e Gutierrez-Ruiz (1969) a Myrciaria dubia (camu-camu) é consumida na Amazônia peruana na forma de sucos, geléias, sorvetes e balas. No Brasil esse fruto era utilizado somente pelos índios e caboclos como isca para a pesca. Porém, com a divulgação da alta concentração de ácido ascórbico, hoje se aumentou o interesse para seu consumo principalmente na forma de licores e também bebidas alcoólicas fermentadas devido à sua coloração vermelha, pH ácido e alto rendimento em polpa (MAEDA; ANDRADE, 2003).
Os estudos fitoquímicos deste gênero encontrados na literatura são poucos, estando reportada a presença de ácido ascórbico, taninos e glicosídeos cianidínicos e peonidínicos na espécie de Myrciaria cauliflora Berg. (REYNERTSON et al., 2006; MACEDO-COSTA, 2008) e flavonoides como o cianidina 3-O-glucosideo, encontrado nas espécies de Myrciaria cauliflora, Myrciaria dúbia e Myrciaria vexator (CELLI et
al., 2011). Os extratos do caule desta espécie apresentaram atividade contra cepas de Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius e Lactobacillus casei (MACEDO-COSTA et al., 2009).
Este gênero possui número incerto de espécies, distribuídas desde o México e Caribe até o Uruguai (SOBRAL, 1993). No Brasil, ocorrem cerca de 30 espécies, principalmente na região Sudeste (LANDRUM; KAWASAKI, 1997). Nesta última região, principalmente na restinga, encontra-se a espécie de estudo deste trabalho, Myrciaria
6 1.4 Myrciaria floribunda (H. West ex Willd.) O. Berg
A espécie Myrciaria floribunda (H. West ex Willd.) O. Berg (figura 3) é popularmente conhecida como: “camboim”, “jabuticabinha”, “murta”, “duque”, “goiabarana” e “araçazeiro” (LORENZI, 2009). Esta espécie é amplamente distribuída no Brasil, ocorrendo desde a Amazônia até o Sul do Brasil (Rio Grande do Sul) em praticamente todas as fitofisionomias vegetacionais (SOBRAL et al., 2013). Possui diversas sinonímeas botânicas, tais como Eugenia floribunda H. West ex Willd.,
Eugenia oneillii Lundell, Eugenia protracta Steud., Eugenia salzmannii Benth., Myrciaria mexicana Lundell, Myrciaria oneillii (Lundell) I.M. Johnst., Myrciaria protracta (Steud.) O. Berg, Myrciaria salzmannii (Benth.) O. Berg, Myrciaria uliginosa
O. Berg, Myrciaria verticillata O. Berg, Myrciaria ciliolata (Cambess) O. Berg,
Myrciaria tenuiramis O. Berg (LORENZI, 2009).
Figura 3. Vista geral da espécie Myrciaria floribunda (H.West ex Willd) O. Berg no
Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. (Fonte: Próprio autor).
M. floribunda floresce principalmente de dezembro a janeiro. Os frutos
amadurecem predominantemente de julho a setembro. Esta espécie corresponde a uma árvore com altura de 6-14 m, glabra, de copa arredondada, densa e baixa, de tronco cilíndrico, de 30-40 cm de diâmetro revestida por casca lisa, acastanhada ou avermelhada, descamando em placas finas que deixa o tronco manchado. As folhas
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apresentam pecíolo glabro de 0,3-1,0 cm; lâmina elíptica a ovado-lanceolada, de ápice agudo ou longo-acuminado e base cuneada, cartácea, glabra em ambas as faces, pouco discolor, de 5-8 x 2-3 cm, com 15-20 pares de nervuras secundárias visíveis. Inflorescências em fascículos axilares de 2-4 flores, com bractéolas arredondadas. O fruto é globoso, negro ou vermelho, liso, com polpa suculenta de sabor doce-adstrigente, de até 1 cm de diâmetro (LORENZI, 2009).
Existem poucos estudos químicos e biológicos reportados na literatura com esta espécie vegetal, sendo apresentado apenas a composição química dos óleos essenciais de folhas (DE RAMOS et al., 2010; TIETBOHL et al., 2012; APEL et al., 2006a), flores e caules (TIETBOHL et al., 2012) e atividades antimicrobianas (DE RAMOS et al., 2010; APEL et al., 2006a), antitumoral (APEL et al., 2006a) e anticolinesterásica (TIETBOHL et al., 2012).
1.5 Óleo essencial
Os óleos voláteis não apresentam distribuição muito ampla no reino vegetal, sendo encontrados em aproximadamente 50 famílias, dentre elas, Myrtaceae, Lamiaceae, Poaceae, Lauraceae, Rosaceae e Asteraceae, são bastante conhecidas por suas propriedades aromáticas (CANE, 1990).
A composição química dos óleos essenciais pode variar amplamente, desde hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com nitrogênio e enxofre. Toda essa diversidade química, no entanto, pode ser agrupada em duas séries principais: a série aromática, derivados do fenilpropano (C6-C3), oriundos do metabolismo do ácido chiquímico, e a série terpênica, quantitativamente mais numerosa e qualitativamente mais variada onde encontram-se os monoterpenos (formados por 10 átomos de carbono) (Figura 4) e os sesquiterpenos (15 átomos de carbono), arranjados em estruturas acíclicas, monocíclicas, bicíclicas e tricíclicas (CANE, 1990; MAHMOUD; CROTEU, 2002). A composição química dos óleos essenciais depende do clima, da estação do ano, condições geográficas, período de colheita e a técnica de destilação (MACIEL et al., 2002).
8 Figura 4. Principais núcleos monoterpênicos (adaptado de MAHMOUD; CROTEU,
9 1.6 Atividades biológicas
1.6.1 Atividade Antimicrobiana
O uso de plantas superiores como fonte de novas drogas terapêuticas vem crescendo a cada ano e uma grande quantidade de pesquisas tem levado a descoberta de grupos químicos (ácidos fenólicos, quinonas, flavonoides, taninos, cumarinas, terpenos, alcaloides e outros) com ação antimicrobiana (COWAN, 1999). Além disso, substâncias voláteis há muito tempo têm servido de base para diversas aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de anti-sépticos tópicos. Tal realidade serviu de base para diversas investigações científicas, com vistas na confirmação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais (ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006; NUNES et al., 2006; BENKEBLIA, 2004).
Óleos essenciais de plantas apresentam uma atividade antimicrobiana contra um grande número de bactérias incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos (CARSON et al., 1995). Eles podem apresentar ação tanto contra bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas e ainda leveduras e fungos filamentosos (PRASHAR et al., 2003).
Apel et al. (2006a) descreveram a atividade antibacteriana para os óleos essenciais obtidos das espécies Symphyopappus itatiayensis (Asteraceae), Myrciaria
floribunda (Myrtaceae) (objeto de estudo deste trabalho), Talauma ovata
(Magnoliaceae), Psidium cattleyanum (Myrtaceae) e Nectandra megapotamica (Lauraceae), e verificou que todas as espécies estudadas possuíam atividade contra
Staphylococos aureus e Pseudomonas aeruginosa.
1.6.2 Atividade Inibitória da Acetilcolinesterase
A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima presente nas fendas sinápticas, responsável por hidrolisar o neurotransmissor acetilcolina (ACh). O baixo nível de ACh no cérebro está associado ao Mal de Alzheimer que é uma doença neurodegenerativa progressiva. Uma das mais importantes abordagens para o tratamento desta doença é o de melhorar o nível de acetilcolina no cérebro usando inibidores da AChE (LLÉO et al., 2006).
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A terapia anticolinérgica é a alternativa mais aceita para o desenvolvimento de fármacos que melhoram as habilidades cognitivas (SIDDIQUI; LEVEY, 1999). Os inibidores da acetilcolinesterase aprovados para uso clínico são rivastigmina, donepezila e galantamina (BLENNOW et al., 2006).
Uma avaliação clínica de tolerabilidade do óleo essencial de Salvia
lavandulaefolia foi realizada para o tratamento da Doença de Alzheimer, uma vez que o
óleo exerce atividades anticolinesterásica, antioxidante, antiinflamatória e sedativa, todas relevantes na terapia dessa doença. Foram observados resultados significativos sobre a cognição em voluntários saudáveis além de redução dos sintomas psiquiátricos e melhora da atenção em pacientes com a Doença de Alzheimer. Através da avaliação da atividade anticolinesterásica do óleo essencial de Salvia lavandulaefolia por método espectrofotométrico foi determinado que a principal substância responsável por essa atividade foi o 1,8-cineol, o componente majoritário. Seu efeito sinérgico com o α-pineno (também ativo) e com o óxido de cariofileno foi demonstrado por Savelev et al. (2003).
1.6.3 Atividade Inseticida
Na Índia, por volta de 2.000 A.C., se fazia o uso de inseticidas provenientes de plantas no controle de pragas. No Egito, durante a época dos Faraós e na China por volta do ano de 1.200 A.C. inseticidas derivados de plantas eram usados para controle de pragas de grãos armazenados, aplicados diretamente nos grãos ou por fumigação destes. No século 16 os europeus faziam uso de plantas para efetuarem o controle de
pragas. Entretanto, após a 2a Guerra Mundial, com o advento dos inseticidas sintéticos,
o uso de inseticidas botânicos foi reduzido grandemente (CHIU, 1988).
Substâncias de origem vegetal apresentando propriedades inseticidas têm sido isoladas, como terpenóides, limonóides, alcalóides e acetogeninas (VIEIRA et al., 2007). Os monoterpenos e seus análogos são os mais importantes, estando presentes em abundância em óleos essenciais de plantas superiores. São substâncias com características lipofílicas, com alto potencial para interferências tóxicas em processos
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bioquímicos básicos, com consequências fisiológicas e comportamentais em insetos (PRATES; SANTOS, 2000).
Terpenos e fenilpropanóides voláteis podem ter, dependendo do inseto em análise, propriedades atrativas (alimentação, polinização) e/ou inseticidas. Óleos voláteis de plantas apresentam potencial para o controle de Pediculus humanus (piolho), pois alguns deles são seletivos. Frequentemente são produtos não tóxicos e apresentam poucos ou nenhum efeito prejudicial sobre os demais organismos. Assim, óleos voláteis ou seus constituintes isolados têm sido propostos como uma alternativa para os pediculicidas sintéticos comumente utilizados (YUNES; CECHINEL-FILHO, 2012)
A adoção de técnicas biológicas como o uso de lagartas para o controle de pragas do algodoeiro, reduzindo assim a aplicação de agroquímicos, fez com que aumentasse a população de percevejos do gênero Dysdercus. Estes, por sua vez, passaram a causar prejuízos consideráveis, que se relacionam à perda de peso da semente, redução do teor de óleo, possível inoculação de microrganismos nas sementes e, por fim, as manchas nas fibras do algodão (STANISÇUASKI et al., 2005).
Oncopeltus fasciatus, é uma das poucas espécies que se alimentam
exclusivamente de plantas da família Asclepiadaceae. Apesar de não ocasionar danos economicamente importantes como uma praga, tem sido muito utilizado como modelo para estudos em pesquisas entomológicas na busca de novos inseticidas. Como consequência disto, muitos aspectos da sua fisiologia foram estudados e são conhecidos em detalhes (FEIR, 1974).
Outro inseto frequentemente utilizado como modelo para estudos de inseticidas é o Rhodnius prolixus, um importante vetor da doença de Chagas, amplamente distribuído na América do Sul afetando atualmente cerca de 18 milhões de pessoas (MELLO et al., 2008).
Por todas essas razões, torna-se necessário a descoberta de novas substâncias para o efetivo controle de pragas, que possam oferecer maior segurança, seletividade, biodegradabilidade, viabilidade econômica e aplicabilidade em programas integrados de controle de insetos de baixo impacto ambiental.
12 1.6.4 Atividade Hipoglicemiante
O diabetes é um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia e associadas a complicações, disfunções e insuficiência de vários órgãos, especialmente olhos, rins, nervos, cérebro, coração e vasos sanguíneos. Pode resultar de defeitos de secreção e/ou ação da insulina envolvendo processos patogênicos específicos, por exemplo, destruição das células beta do pâncreas (produtoras de insulina), resistência à ação da insulina, distúrbios da secreção da insulina, entre outros (BRASIL, 2006).
Efeitos colaterais e o custo elevado de drogas comuns dos tratamentos tradicionais levaram a um aumento do interesse por terapias alternativas naturais, principalmente nos últimos anos, para o auxílio na redução dos níveis de glicose sanguínea no tratamento da diabetes. Nesta linha, nos últimos anos pesquisadores tem se interessado em buscar possíveis benefícios das plantas e seus metabólitos para o controle desta patologia (NEGRI, 2005).
Diversas espécies vegetais vêm sendo citadas na literatura como adjuvantes no tratamento da diabetes mellitus atuando, tanto no tratamento da doença em si como atenuando seus sintomas e possíveis consequências e, desta forma, inúmeros estudos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de comprovar o efeito de espécies vegetais muitas vezes utilizadas apenas com base em dados empíricos. O diabetes mellitus, por ser doença crônica, de tratamento contínuo, é alvo interessante para a busca de novos métodos de tratamento com a possibilidade de uso de várias espécies de plantas medicinais para o tratamento, contribuindo para triagens etnofarmacológicas e direcionamento de pesquisas que relacionem o potencial de espécies brasileiras para o tratamento desta condição patológica (CECÍLIO et al., 2008).
Atualmente, no tratamento do diabetes, os recursos medicamentosos são empregados, geralmente, em um segundo momento da terapêutica, quando da incapacidade de se controlar os níveis glicêmicos preferencialmente através da prática da dieta e de exercícios físicos. Entre os agentes medicamentosos disponíveis para a terapia do diabetes estão incluídos a insulina e os hipoglicemiantes orais (principalmente, biguanidas e sulfoniluréias) (ASSUNÇÃO et al., 2002).
13
Santos et al. (2012) citaram 35 espécies vegetais com possível ação hipoglicemiante, pertencentes a 24 famílias, sendo as mais freqüentes: Asteraceae (12,5%) e Myrtaceae (9,37%). As plantas medicinais mais prevalentes foram pata-de-vaca (Bahuinia sp, 16,8%), azeitona-roxa (Syzygium jambolanum DC., 15,88%) e insulina (Cissus sicyoides L., 14,01%).
Grover et al. (2002) pesquisaram trabalhos sobre diversas plantas medicinais com efeito hipoglicêmico utilizadas na Índia para o tratamento do diabetes mellitus, entre elas o Syzigium cumini (popularmente chamado de jamelão), pertencente a família Myrtaceae, cujas partes mais comumente utilizadas são as folhas, sementes e polpa na forma de extratos aquoso ou alcoólico e infusões. Segundo esta pesquisa, a administração oral do extrato da polpa do fruto de jamelão em ratos mostrou efeito hipoglicêmico em 30 minutos, possivelmete mediado pela secreção de insulina.
14 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Realizar o estudo químico e avaliar a atividade biológica da espécie vegetal
Myrciaria floribunda (H. West ex Willd) O. Berg.
2.2 Objetivos Específicos
- elucidar as estruturas químicas das principais substâncias isoladas das folhas de
Myrciaria floribunda a partir de extrações com solventes de polaridade crescente.
- avaliar a atividade hipoglicemiante do extrato aquoso das folhas de Myrciaria
floribunda.
- analisar a composição química do óleo essencial das folhas, flores e caules de
Myrciaria floribunda obtido por hidrodestilação.
- avaliar a atividade antibacteriana do óleo essencial das folhas de Myrciaria floribunda. - avaliar a atividade anticolinesterásica do óleo essencial das folhas, flores e caules de
Myrciaria floribunda.
- avaliar a atividade inseticida dos óleos essenciais das folhas e flores de Myrciaria
15 3 METODOLOGIA
3.1 Material Vegetal
As folhas, caules e flores de três espécimes de Myrciaria floribunda foram coletados na Restinga de Jurubatiba, RJ (22°12’58.2”S - 41°35’00.0”W, 22°13’3.3”S - 41°35’14.4”W, 22°13’00.1”S - 41°35’01.0”W), Brasil, em abril de 2011. A identificação da espécie foi realizada pelo botânico Marcelo Guerra Santos, professor adjunto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do material vegetal foi realizada e uma exsicata foi depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (RFFP 13.789).
3.2 Extratos e partições
As folhas, 508 g, foram submetidas ao processo de secagem em estufa com ventilação forçada, com temperatura de aproximadamente 35°C pelo período de 48 h. As folhas secas foram moídas em moinho de facas e em seguida, foram submetidas à extração por maceração com hexano, até o esgotamento. O extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida, obtendo assim o extrato hexânico (35,1 g). O resíduo remanescente foi submetido a partições com solventes de polaridade crescente (acetato de etila e metanol) (Figura 5). Os extratos, em hexano, em acetato de etila e em metanol foram armazenados em dessecador à temperatura ambiente até sua utilização.
16 Figura 5. Esquema de partição do extrato hexânico de Myrciaria floribunda.
3.2.1 Preparação do extrato aquoso
As folhas foram sujeitas ao processo de secagem em estufa com ventilação forçada, com uma temperatura de aproximadamente 35 °C durante 48 horas. As folhas secas foram trituradas em moinho de facas para preparar o chá pelo método de infusão durante 15 minutos a uma concentração de 5% (p/v) (SILVA et al., 2013).
3.3 Extração do óleo essencial
A mistura das folhas (1.100 g), caules (600 g) e flores (186 g) das três espécimes de Myrciaria floribunda foram separadas individualmente e turbilhonados com água destilada. O material assim separado foi colocado em balão de 5L com quantidade suficiente de água e aquecido em manta térmica. Foi realizada a hidrodestilação durante 4 horas em um aparato do tipo Clevenger (Figura 6). Ao final da extração, os óleos foram coletados e filtrados em sulfato de sódio, para remoção da
17
água, e acondicionados em freezer (-4 °C) para posterior realização de análises químicas e testes biológicos.
Os óleos foram analisados por CG-FID e CG-MS. A composição percentual dos óleos foi calculada pelo método de normalização das áreas dos sinais dos cromatogramas obtidos após análise por cromatografia em fase gasosa. A identificação das substâncias foi realizada por comparação do índice aritmético (AI), determinado em relação ao tempo de retenção de uma série de n-alcanos, com dados de referência correspondente (ADAMS, 2007). O padrão de fragmentação do espectro de massas foi comparado com bibliotecas de espectro de massas NIST (National Institute of Standards and Technology).
Figura 6. Extração do óleo essencial das folhas, caules e flores de Myrciaria floribunda
18 3.4 Métodos de Isolamento e Purificação
3.4.1 Cromatografia em Camada Fina
Para os ensaios cromatográficos utilizou-se gel de Sílica 60 como fase normal
em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 com 0,20 mm de
espessura, como fase estacionária. Para a fase móvel foram utilizados os solventes hexano, acetato de etila, ácido fórmico, ácido acético, metanol e água em diferentes
gradientes de concentração, em grau de análise (PA) obtidos do fabricante VETEC®
(RJ, Brasil).
Os reveladores químicos utilizados foram:
- Solução de ácido sulfúrico 10% em etanol/aquecimento (WAGNER; BLADT, 1995). - Solução de anisaldeído sulfúrico: solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98% (Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético glacial, seguida da adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (WAGNER ; BLADT, 1995).
- Reagente NP/PEG/UV 254-365nm (1% p/v NP metanólico, 5% p/v PEG metanólico solubilizado em ultrasom) (WAGNER; BLADT, 1995).
3.4.2 Cromatografia em coluna
A purificação e o isolamento das substâncias provenientes do extrato em acetato de etila de Myrciaria floribunda foram realizados em coluna cromatográfica de
vidro contendo Amberlite® XAD® 2 (SUPELCO® ANALYTICAL –
SIGMA-ALDRICH) como fase estacionária. A coluna de XAD® foi montada e eluída
inicialmente com água, MetOH→H2O (1:1, v/v), MetOH (metanol), e por fim com
ACN (acetonitrila). O extrato em acetato de etila foi suspenso em água para sua posterior aplicação na coluna.
19 3.4.3 Coluna Sephadex
A purificação final das substâncias oriundas das frações provenientes da coluna
XAD®, foi realizada através de coluna de vidro contendo SEPHADEXTM LH-20 (GE
HEALTHCARE) como fase estacionária. Foram montadas colunas de Sephadex somente com metanol e também com uma proporção de metanol-água (maior porcentagem de água na qual a amostra seja solúvel). Foi utilizado como fase móvel um gradiente de metanol-água e também foram realizadas corridas isocráticas com metanol.
3.4.4 Análise Cromatográfica do Extrato Aquoso: CLAE-DAD
Para realizar a análise cromatográfica, o extrato aquoso foi liofilizado e uma
alíquota de 10 mg foi dissolvida em 2 mL de H2O/MeOH (75:25, v/v). O material foi
filtrado através de membrana de celulose regenerada (0,45 µm). A solução da amostra foi armazenada em frasco de 2 mL. O perfil cromatográfico foi avaliado usando um cromatógrafo em fase líquida LC-A20 com um software LC solution, equipado com bomba LC-20AT, desgaseificador DGU-20A3, detector UV / Vis DAD-20A, forno CTO-20A, injetor SIL-20A, kit válvula LPGE e – Shimadzu; coluna cromatográfica MACHEREY-NAGEL NUCLEODUR 100-5 C18 de aço inoxidável de 150/4, 5 micrómetros (250 mm x 4 mm). A fase móvel A foi preparada com 10% de acetonitrila e 90% de água e acidificada com ácido fórmico; fase móvel B acetonitrila 80% e 20% de água, acidificada com ácido fórmico. Foi utilizado um gradiente de eluição utilizando a seguinte escala: 0 a 50 minutos a fase B chega a 50% e em 55 min a fase B vai a 100%, e permanece até 65 minutos; para 70 minutos a fase B retorna ao seu valor inicial de 0% e permanece até 75 minutos, com um tempo total de análise de 75 minutos. A taxa de fluxo foi de 1 mL/min com detecção de UV em um intervalo de 200 a 450 nm. A fase móvel e a amostra foram inicialmente filtradas através de um filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 mM) e, em seguida, injetadas no cromatógrafo (GARRET
20 3.5 Métodos de identificação e elucidação estrutural
3.5.1 Cromatografia em fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
Os óleos essenciais foram analisados pelo CGEM-QP5000 (SHIMADZU), cromatógrafo em fase gasosa equipado com detector de massas por ionização por impacto de elétrons (70 eV) (Figura 7). As condições da cromatografia em fase gasosa foram: temperatura de injeção, 260 °C; temperatura FID, 290 °C; Hélio como gás de arraste, taxa de fluxo de 1 mL/min e injeção split com 01:40 de razão de split. A temperatura do forno inicial foi 60 °C e final de 290 °C, com aumento a uma taxa de 3
°C/min. Um microlitro de cada amostra, dissolvida em CH2Cl2 (1:1 mg/mL), foi
injetado na coluna RTX-5 (id = 0,25 mm, comprimento 30 m, espessura = 0,25 mm). As condições da espectrometria de massa (EM) foram: voltagem de 70 eV e taxa de varredura 1 scan/s.
Figura 7. Cromatógrafo a gás CGEM-QP5000 (SHIMADZU) (Fonte: Próprio autor). 3.5.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C
21
As substâncias isoladas foram submetidas à análise em aparelho de
Ressonância Magnética Nuclear. Os espectros de RMN 1H e RMN 13C foram obtidos no
equipamento Varian VNMRS (Figura 8) com frequência de 300 e 500 MHz 1H e 125
MHz para 13C, utilizando solvente deuterado como solvente e TMS como padrão
interno. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A edição dos espectros foi realizada utilizando-se SpinWorks 3.1.5.0 (UNIVERSITY OF MANITOBA, 2009) e MestReNova 6.0.2-5475 (MESTRELAB RESEARCH S.L., 2009).
Figura 8. Espectrômeto de Ressonância Magnética Nuclear (Fonte: Próprio autor).
3.6 Atividades biológicas
22 3.6.1.1 Microrganismos
Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 foram utilizadas neste estudo.
3.6.1.2 Preparação de suspensão bacteriana
As bactérias usadas para inóculo foram ajustadas de acordo com a escala de 0,5
Mac Farland, a qual equivale a aproximadamente 1,5x108–107 unidades formadoras de
colônias (UFC) por mililitro.
3.6.1.3 Teste de susceptibilidade - Concentração Mínima Inibitória (CMI)
O teste utilizado foi o de microdiluição em caldo e realizado de acordo com as recomendações do CLSI (2002). Em uma placa de microdiluição esterilizada de 96 orifícios, foram depositados 100 µL de caldo Muller Hinton em cada poço. No primeiro poço da primeira coluna foram acrescentados 100 µL do óleo essencial de folhas de M.
floribunda diluida em DMSO de concentração conhecida. A partir deste orifício,
diluições sucessivas foram feitas, rejeitando-se no final 100 µL da mistura. Em seguida,
100 µL de uma suspensão bacteriana diluída para concentração final de 104 células/mL
foram acrescentadas a cada poço, obtendo assim as amostras nas concentrações de 500, 250, 125, 62,5 e 31,2 µg/mL. As placas foram incubadas por 24 h à 37 ºC. Após este período foram acrescentados 50 µL de uma solução aquosa de TTC (cloreto de trifenil tetrazolium) a 2,5% e a placa incubada novamente por 3 horas na referida temperatura. A CMI foi definida como a menor concentração da amostra capaz de impedir o aparecimento de coloração vermelha detectável ao olho nu, ou seja, capaz de inibir o crescimento bacteriano. O controle do experimento foi feito com meio de cultura inoculado com bactéria e solução salina; meio de cultura adicionado de vancomicina e
23
bactéria e finalmente meio de cultura inoculado com bactéria e DMSO (FRANÇA, 2010).
3.6.2 Atividade anticolinesterásica
3.6.2.1 Método Quantitativo
Para quantificar a atividade da enzima acetilcolinesterase, foi realizado o ensaio espectrofotométrico baseado no método colorimétrico de Ellman et al. (1961) descrito por Rhee et al. (2001) com adaptações, utilizando uma placa de microdiluição de 96 poços. Um volume total de 200 µL de meio de ensaio composto por 65 µL de tampão de fosfato salino (PBS), 60 µL de 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) 1,5 mM, 25 µL de acetilcolinesterase de peixe elétrico (Sigma) (AchE) 0,2 U/mL, 25 µL da amostra e 25 µL de iodeto de acetiltiocolina (ASCH) (Figura 9). Diferentes concentrações de amostras (óleos essenciais de folhas, caules e flores) e de controle positivo fisostigmina (eserina) (125, 62,5, 31,25, 12,5, 6,5, 3,125, 1,25, 0,625, 0,31, 0,12 µg/mL), dissolvidos em metanol, foram testados para uma curva de dose-resposta e de controle positivo. O controle negativo, usado para calcular a percentagem de inibição, foi medida utilizando amostra de apenas metanol, sem inibidor ou teste químico. A hidrólise espontânea de substrato foi calculada substituindo a solução de enzima por PBS, com a amostra de metanol. A absorvância foi medida cineticamente 17 vezes em 13 minutos a 412 nm.
A atividade enzimática é determinada pela velocidade da reação. Uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1μmol do produto. Neste caso, está relacionada com a taxa de formação da tiocolina.
Para estimar as concentrações capazes de inibir 50% (CI50) da atividade
enzimática dos óleos e do padrão fisostigmina (eserina), estes foram preparados e testados em 5 concentrações diferentes. Enquanto, as substâncias isoladas foram
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testadas na maior concentração que puderem ser solubilizadas em metanol e não precipitarem no meio.
Figura 9. Reação colorimétrica de formação do ácido tionitrobenzóico.
3.6.3 Avaliação da atividade inseticida
Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em
colaboração com a Prof. Dr.a Maria Denise Feder do Laboratório de Biologia de Insetos
do GBG/UFF. Foram utilizados os insetos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus
peruvianus, espécies de percevejos e os barbeiros Rhodnius prolixus.
3.6.3.1 Obtenção, manutenção e preparação dos insetos para os testes
3.6.3.1.1 Colônias dos insetos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus
As colônias dos insetos O. fasciatus e D. peruvianus (Figura 10) foram estabelecidas no Laboratório de Biologia dos Insetos da Universidade Federal Fluminense (UFF), após a doação da Dr.ª Patrícia Azambuja (Fiocruz) e Dr.ª Célia Carlini (UFRGS).
25 Figura 10. A: Ninfa de 4, 5º estágio e adulto de Oncopeltus fasciatus. B: Adultos de
Dysdercus peruvianus.
D. peruvianus foram criados a 25 ºC (MILANO et al., 1999), 60% de umidade
relativa, com um fotoperíodo de 16h luz: 8h escuro. Os insetos foram mantidos em cubas de vidro transparente, cobertas com tecido do tipo filó; e alimentados com sementes de algodão (Gossypium hirsutum) e tiveram livre acesso à água armazenada em frascos de vidro dentro das cubas. As sementes foram mantidas dentro das cubas durante os períodos de cópula e postura até o primeiro ínstar. A partir do segundo ínstar, os insetos foram transferidos para cubas limpas a cada semana, e as sementes colocadas sobre o filó, do lado de fora das cubas; para que assim se evitasse o contato das sementes com as fezes dos mesmos e facilitasse o processo de limpeza e manutenção da colônia (STANISÇUASKI, 2005).
Além disso, foi utilizado papel filtro para forrar a cuba (cortado em formato circular) e para aumentar a área de movimentação dos insetos (cortado em formato retangular e dobrado para se tornar sanfonado). Para facilitar o processo de postura pelas fêmeas, bem como o da coleta dos ovos, placas de petrí foram colocadas no fundo das cubas, e no interior destas placas gazes ou algodão que foram recolhidos de dois em dois dias e transferidos para uma cuba limpa e sem nenhum inseto, contendo apenas sementes e o frasco com água. O. fasciatus foram mantidos sob condições similares àquelas de D. peruvianus e a uma temperatura de 25 ºC (FEIR; BECK, 1963), com umidade relativa de 70-75% e um fotoperíodo de 16h luz: 8h escuro, mas alimentados com semente de girassol (Helianthus annuus).
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Para análise da atividade inseticida frente aos insetos Oncopeltus fasciatus e
Dysdercus peruvianus foi utilizado óleo essencial puro e nas diluições de 500, 250, 125
e 62,5 mg/mL, obtido a partir de folhas da Myrciaria floribunda, utilizando-se etanol como solvente. Os testes foram realizados através de tratamento tópico (1µL), conforme descrito por Raguraman e Singh (1998). Ninfas do 4º estágio foram separadas em grupos de 10 indivíduos e após aplicação das amostras, foram colocadas em frascos (Figura 11). Em seguida, iniciou-se a contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto, o que levou 22 dias de observação. O controle negativo foi efetuado com aplicação de 1µL de diluente (etanol) no dorso dos insetos, submetidos às mesmas condições do grupo experimental.
Figura 11. Ninfas de 4° estágio de Oncopeltus fasciatus durante o processo de
aplicação da amostra.
3.6.3.1.1.1 Análise Estatística
A significância dos resultados foi analisada pelo teste de ANOVA e Tukey, segundo Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 para Windows 98 (ARMITAGE
