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Um Luminômetro Fluxo-Batelada para Determinação de Vitamina B12 em Medicamentos.

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(1)

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Um Luminômetro Fluxo-Batelada para Determinação

Quimiluminescente de Vitamina B

12

em Medicamentos

Renato Allan Navarro Andrade

(2)

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Um Luminômetro Fluxo-Batelada para Determinação

Quimiluminescente de Vitamina B

12

em Medicamentos

Renato Allan Navarro Andrade*

Orientador:

Prof. Dr. Mário César Ugulino de Araújo

2° Orientador:

Prof. Dr. Valdomiro Lacerda Martins

*Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

João Pessoa – PB - Brasil Novembro/2011

(3)
(4)

Universidade Federal da Paraíba como parte dos requisitos para a obtenção do grau de

Mestre em Química, área de concentração Química Analítica.

(5)

Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a

vida com paixão, perder com classe e vencer com

ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e

a vida é "muito" para ser insignificante.

(6)

Ao meu pai Roberto e a minha mãe Dayse, pelo amor, carinho e incentivo.

A toda minha família.

Com amor e gratidão,

(7)

vitórias a cada dia.

 Aos meus amados pais, Roberto Andrade e Dayse Navarro.

 Aos meus irmãos Robledo Jorge e Renan Henrique pelo apoio e companheirismo.

 Aos meus sobrinhos Ryan Gabriel e Karen Beatriz, presentes de Deus e luzes em minha vida.

 A Lucivânia Oliveira pela paciência e companheirismo sempre.

 Aos Amigos Lucas, Larissa, Enoque, Felipe, Janaina, Suervy e Natalia pela amizade e os bons momentos vividos.

 Ao professor Mário César Ugulino de Araújo pela oportunidade de trabalho, confiança e ensinamentos.

 Aos professores Pablo Nogueira Teles Moreira e Valdomiro Lacerda Martins pelo conhecimento, disponibilidade e paciência dedicada a esse trabalho.

 Aos professores Luciano Farias de Almeida e Edvan Cirino da Silva pelas relevantes contribuições acadêmico-científicas.

 Aos amigos Daniel Jackson, Stéfani Yuri, Wellington Lyra e Paulo Henrique pela contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.

 Ao Engenheiro Eletrônico Carlos Zurita pela colaboração no desenvolvimento da eletrônica deste trabalho.

 Aos amigos Flaviano, Edilene, Cleilson, Urijatan, Adriano, Francisco, Adamastor, Hebertty, Marcelo, Sófacles e a todos do LAQA, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

(8)

i

SUMÁRIO ... i

LISTA DE FIGURAS ... v

LISTA DE TABELAS ... x

LISTA DE ABREVIATURAS ... xii

RESUMO... xiv

ABSTRACT ... vx

CAPÍTULO 1 ... 1. I NTRODUÇÃO ... 2

1.1. Contextualização ... 2

1.2. Obj etivo e m et as ... 3

1.2.1. Obj etivo geral ... 3

1.2.2. Metas ... 3

1.3. Quim ilum inescência ... 4

1.3.1. Reações quim ilum inescentes do lum inol ... 6

1.3.2. O Mecanism o da reação quim ilum inescente do lum inol. ... 7

1.3.3. Fatores que influenciam a em issão quim ilum inescente ... 11

1.3.4. Aplicação do lum inol para fins analít icos ... 12

1.4. A vitam ina B12 ... 15

1.5. Determ inação de vitam ina B12 por quim ilum inescência ... 17

1.6. I nstrum ent ação básica para análises quim ilum inescentes... 19

(9)

ii

1.6.4. Sistem a de aquisição de sinais ... 23

1.7. Métodos autom áticos de análises quím icas ... 24

1.7.1. Analisadores em fluxo- batelada ... 25

1.7.1.1. Sistem a de propulsão... 27

1.7.1.2.. Sistem a de condução dos fluidos ... 28

1.7.1.3. Sistem a de com utação ... 30

1.7.1.4. Câm ara de m ist ura ou reação ... 30

1.7.1.5. Sistem a de detecção ... 31

1.7.2. Características dos sistem as FB... 32

1.8. Analisadores em fluxo- batelada e determ inações quim ilum inescentes ... 34

CAPÍTULO 2 ... 2. EXPERI MENTAL ... 36

2.1. Reagentes, soluções e am ostras ... 36

2.2. O Lum inôm etro fluxo- batelada ( LFB) ... 37

2.2.1. Microcom put ador ... 39

2.2.2. Câm ara de m istura ... 40

2.2.3. Agitador m agnético ... 40

2.2.4. Bom ba perist áltica ... 41

2.2.5. Acionador de válvulas ... 41

2.2.6. Válvulas solenoides ... 42

(10)

iii

2.2.8.1. Eletrônica do MASQ ... 43

2.2.8.1.1. Módulo de pré- am plificação ... 45

2.2.8.1.2. Módulo de controle de ganho ... 46

2.2.8.1.3. Microcont rolador ... 47

2.2.8.1.4. Fonte de alim ent ação ... 49

2.2.8.2. Operação do MASQ ... 49

2.2.9. Metodologia de análise ... 52

2.2.11. Procedim ento analítico ... 53

2.2.11.1. Estudo das vazões dos canais das válvulas solenoides ... 53

2.2.11.2 Procedim ento de fluxo ... 53

2.2.11.3. Procedim ento e utilização do program a de controle do LFB ... 55

2.2.11.4. Procedim ento de ut ilização do MASQ ... 57

2.2.12. Procedim entos para avaliação do desem penho analítico ... 57

CAPÍTULO 3 ... 3. RESULTADOS E DI SCUSSÃO ... 62

3.1. Aj uste da vazão do LFB ... 62

3.2. Estudo dos volum es adicionados à câm ara de m istura ... 66

3.3. Estudo da estabilidade da solução de lum inol ... 67

3.4. Avaliação do desem penho do LFB para am ostras sintéticas de cobalto( I I ) e vitam ina B12 ... 69

3.4.1. Figuras de m érito ... 73

(11)

iv

4. Conclusão ... 76

CAPÍTULO 5 ...

(12)

v

FFIGURA 1.1. Mecanism o proposto por ALBERTI N e colaboradores[13]

para a reação quim ilum inescente do lum inol em m eio alcalino e na presença do íon de um m etal de transição ( Mn+) , utilizando H2O2 com o

agente oxidante. ... 8

Figura 1.2. Proposta m ecanísitca de Merényi e colaboradores sobre os

cam inhos da reação quim ilum inescente do lum inol. A representa espécies aceptoras de elét rons e B representa nucleófilos. ... 9

Figura 1.3. Esquem a representativo dos t ipos de reações

quim ilum inescentes do lum inol, onde P representa o produto da reação. Adapt ada da Ref. [20]. ... 13

Figura 1.4. Estrut ura m olecular da cobalam ina. Adaptada da Ref. [57].

... 16

Figura 1.5. Esquem a básico de configuração de um lum inôm etro.

Adapt ada da Ref. [20]. ... 19

Figura 1.6. Sinal analítico provenient e de reações quim ilum inescentes.

( a) É m ostrada a curva da intensidade de quim ilum inescência em função do tem po após a m istura dos reagentes para iniciar a reação. A dim inuição do sinal analítico ocorre em consequência do consum o dos reagentes e m udanças na eficiência quânt ica quim ilum inescente com o passar do tem po. ( b) A curva de calibração é estabelecida em relação às concentrações crescentes ou decrescentes do analito. Adaptada da Ref.

(13)

vi

solenoides de três vias; ( d) bom ba peristált ica; ( e) acionador de válvulas; ( f) detector; ( g) com putador. Adaptada da Ref. [75]. ... 26

FIGURA 1.8. Bom ba peristált ica com ercial utilizada na propulsão dos

fluidos em sistem as FBA. ... 27

FIGURA 1.9. Bom ba pistão acoplada à câm ara de m istura desenvolvido

por ALMEI DA e colaborades[61,79] para propulsão dos fluidos em um

sistem a FB. ( a) m otor de passos ( b) câm ara de m istura ( c) visualização interna da câm ara de m istura com o pistão inserido em seu interior. As set as indicam os sentidos de m ovim ent o do pistão. ... 28

FIGURA 1.10. Tubos de bom beam ent o para bom bas peristálticas. Para

bom bas com velocidade de rotação fixa, o diâm etro interno desses tubos e a rotação da bom ba determ inam a ordem de grandeza da vazão. ... 29

FIGURA 1.11. Visualização externa e interna de um a válvula solenoide de

três vias utilizadas em sistem as FBA. ... 30

FIGURA 1.12. Câm ara de m istura de sistem as FB. ( a) cavidade; ( b)

entrada de fluidos; ( c) entrada/ saída de fluidos. ... 31

FIGURA 2.1. Fotografia da disposição física dos com ponentes do LFB

(14)

vii

solenoides; ( AV) Acionador de válvulas; ( AS) am plificador de sinal; ( AM) agitador m agnético; (CM) câm ara de m istura; ( D) detector. ... 39

FIGURA 2.3. Diagram a esquem át ico das dim ensões da câm ara de

m ist ura. ( 1) Canal de entrada; ( 2) canal de saída. ... 40

FIGURA 2.4. Agitador m agnético utilizado no LFB. ... 40

FIGURA 2.5. Diagram a esquem ático do acionador de válvulas. P0 – P6

representam os pinos de saída para a interface de controle e GND é o aterram ento do circuito. ... 41

FIGURA 2.6. Válvula solenoide de três vias da ut ilizadas no LFB proposto.

... 42

FIGURA 2.7. Fotodiodo de silício ut ilizado no sistem a de detecção do LFB

proposto. ... 42

FIGURA 2.8. Resposta espectral t ípica do fot odiodo utilizado no sistem a

de detecção do LFB proposto. ... 43

FIGURA 2.9. Diagram a esquem ático representando as quatro part es

(15)

viii

circuitos integrados; D1 = diodo, D2 = fot ossensor; K1 = relé; P = conect ores; GND = terra. ... 45

FIGURA 2.11.. Circuito eletrônico do m ódulo de controle de ganho do

MASQ. C = capacit or de poliéster; R = resistores; U2 e U3 = circuitos integrados; D3 = diodo; GND = terra. ... 46

FIGURA 2.12. Circuito eletrônico do m icroprocessador do MASQ. C =

capacitor de poliést er; R = resistores; U4 = PI C 16F877; GND = terra. 48

FIGURA 2.13. Circuito eletrônico da fonte de alim entação do MASQ. C =

capacitor de poliéster; R = resistores; Q = transistores; U6 e U7 = circuitos integrados; GND = terra. ... 49

FIGURA 2.14. Detalhes do painel externo de controle e operação do

MASQ. ... 50

FIGURA 2.15. Diagram a esquem ático do sistem a de fluxo do LFB

proposto. AM – agit ador m agnético, CM – câm ara de m ist ura, BM – barra m agnética, D – det ector, BP – bom ba peristáltica, V1 – válvula da água,

V2 – válvula da am ostra, V3 – válvula do peróxido de hidrogênio, V4

válvula do lum inol, V5 – válvula de esvaziam ento da câm ara de m istura e

L – descart e. ... 54

(16)

ix

+ 0,0008 e R2 = 1,00. ... 62

FIGURA 3.2. Sinal proveniente da entrada de am ostras e reagentes na

câm ara de m ist ura nas rotações de 40 rpm () , 80 rpm (―) ,120 rpm () ,160 rpm () . ... 65

FIGURA 3.3. Sinais analíticos obt idos de 0 a 168 horas de preparo do

lum inol. A concentração de vitam ina B12 corresponde ao intervalo de 2,4 –

12 g L-1, com DPR’s inferiores a 1,5% (n=5). ... 68

FIGURA 3.4. Curva analítica para os padrões de cobalt o( I I ), cuj a faixa

linear com preende o intervalo de 1,0 a 9,0 gL-1. ... 70

FIGURA 3.5. Curva analítica para os padrões de vitam ina B12, cuj a faixa

linear com preende o intervalo de 2,4 a 12,0 gL-1. ... 70

FIGURA 3.6. Gráfico dos resíduos deixados pelo m odelo linear da curva

analítica para os padrões de cobalto (I I ) . ... 71

FIGURA 3.7. Gráfico dos resíduos deixados pelo m odelo linear da curva

(17)

x

TABELA 1.1. Aplicações da quim ilum inescência do lum inol na

determ inação de diferentes analitos. ... 15

TABELA 1.2. Sistem as de detecção utilizados em diversos sistem as FB

descritos na literat ura. ... 32

TABELA 2.1. Valores dos canais em relação ao ganho do sinal. ... 51

TABELA 2.2. Equações para a ANOVA dos dados experim entais

adaptados aos m odelos lineares determ inados pelos m étodos dos m ínim os quadrados. ... 59

TABELA 3.1. Valores do desvio padrão e do desvio padrão relativo ( DPR)

obtidos para a válvula 1 nas quatro diferentes rotações da bom ba peristált ica. ... 63

TABELA 3.2. Valores do desvio padrão e do desvio padrão relativo ( DPR)

obtidos para a válvula 2 nas quatro diferentes rotações da bom ba peristált ica. ... 63

TABELA 3.3. Valores do desvio padrão e do desvio padrão relativo ( DPR)

obtidos para a válvula 3 nas quatro diferentes rotações da bom ba peristált ica. ... 64

TABELA 3.4. Valores do desvio padrão e do desvio padrão relativo ( DPR)

(18)

xi

TABELA 3.6. Valores obtidos do sinal provenient e da reação

quim ilum inescente para os volum es inseridos na câm ara de m istura. .... 66

TABELA 3.7. Parâm etros de fluxo aj ustados para a determ inação de

vitam ina B12 em m edicam entos com o sistem a LFB. ... 67

TABELA 3.8. Parâm et ros de regressão linear e lim ites dos intervalos de

confiança para os coeficientes dos m odelos obtidos. ... 69

TABELA 3.9. Som as e m édias quadráticas calculadas pela ANOVA para

m odelos de calibração obtidos para o cobalto( I I ) e a vitam ina B12. ... 72

TABELA 3.10. ANOVA para o m odelo linear das curvas analít icas para os

soluções padrão de cobalto( I I ) e vitam ina B12. ... 72

TABELA 3.11. Figuras de m érito obtidas para as det erm inações de

cobalto( I I ) e vitam ina B12 utilizando o LFB proposto. ... 73

TABELA 3.12. Resultado da análise de vitam ina B12 e do teste de

(19)

xii

AAS Espectrom etria de absorção atôm ica

AD Analógico/ digital

AFB Analisador fluxo- bat elada

ANOVA Análise de variância

AuNPs Gold nanopart icles

CCD Charge- coupled device

DPR Desvio padrão relativo

ET AAS Espectrom etria de absorção atôm ica eletrotérm ica

FB Fluxo- batelada

FI A Flow inj ection analysis

GF AAS Espectrom etria de absorção atôm ica em forno de grafite

HRP Horseradish peroxidase

I m áx I ntensidade m áxim a

I QL I ntensidade da quim ilum inescência

LCD Liquid crystal display

LED Light em itt ing diode

LFB Lum inôm etro fluxo- batelada

LOD Lim ite de detecção

LOQ Lim ite de quant ificação

MASQ Módulo am plificador de sinal quim ilum inescente

PI C Program m able interrupt controller

PMTs Photom ultiplier t ubes

PTFE Politetrafluoretileno

(20)

xiii

REM Radiação elet rom agnética

rpm Rotações por m inut o

(21)

xiv

Título: Um Lum inôm etro Fluxo- Batelada para Det erm inação de Vitam ina

B12 em Medicam ent os.

Autor: Renato Allan Navarro Andrade

Neste trabalho foi desenvolvido um lum inôm etro para análise por quim ilum inescência, acoplado a um sistem a autom át ico de análise em fluxo- batelada. O desem penho do inst rum ento desenvolvido foi avaliado por m eio da determ inação de vitam ina B12 em m edicam ent os. O princípio

quím ico do sistem a baseia- se no efeito catalítico do íon cobalto ( I I ) sobre a oxidação do lum inol pelo peróxido de hidrogênio em m eio alcalino cuj o produto da reação em ite radiação eletrom agnética na região visível ( m ais precisam ente em 425 nm ). O sistem a de detecção do instrum ento desenvolvido consiste de um fot odiodo de silício e de um m ódulo para am plificação dos sinais analíticos. O m odelo de calibração univariado foi validado por m eio da Análise de Variância ( ANOVA) e usado posteriorm ente na quant ificação de vit am ina B12 em am ostras reais. Os

lim ites de detecção e quantificação obtidos foram 0,11 e 0,36 µg L-1 de vitam ina B12. A frequência analítica foi estim ada em 90 am ostras h-1. A

exatidão do instrum ento proposto foi atestada por m eio de testes de recuperação cuj as taxas obtidas foram entre 98 e 102% . O instrum ent o proposto forneceu resultados com precisão satisfatória, com o revelado pelo baixo valor de desvio padrão conj unto. Tais resultados obtidos dem onstram que é possível quantificar vitam ina B12 utilizando um m étodo

sim ples, econôm ico, robusto e que produz baixa quant idade de resíduos para o m eio am biente.

Palavras-chave: Lum inôm etro Fluxo- Batelada, Quim ilum inescência,

(22)

xv

Title: A Flow- Batch Lum inom eter for Det erm ination of Vitam in B12 in

Pharm aceutical Form ulat ions.

Author: Renato Allan Navarro Andrade

I n t his work was developed a lum inom eter for analysis by chem ilum inescence, coupled to a flow- batch analysis autom atic system . The perform ance of the developed instrum ent was evaluat ed by m eans of the determ inat ion of vitam in B12 in pharm aceutical form ulat ions. The

chem ical principle is based on the catalyt ic effect of cobalt ( I I ) ion over lum inol oxidat ion by hydrogen peroxide in alkaline m edium whose reaction product em its elect rom agnetic radiat ion in visible region ( m ore precisely at 425 nm ). The detection system of t he developed instrum ent consisted of a silicon photodiode and a m odule for am plificat ion of analyt ical signals. The univariate calibrat ion m odel was validated by m eans of Analysis of Variance ( ANOVA) and used later in t he quant ification of vitam in B12 in

real sam ples. The lim its of detect ion and quant ification obt ained were 0.11 and 0.36 µg L- 1 of vitam in B12. The analyt ical frequency was estim ated in

90 sam ples h- 1. The accuracy of the proposed instrum ent was attested by m eans of recovery tests whose obtained recovery rat es were between 98 and 102% . The proposed instrum ent yielded results with sat isfactory precision, as revealed by low value of overall st andard deviation. Such results dem onstrated that is possible t o quant ify vitam in B12 em ploying a

sim ple, econom ic and robust m ethod which generat e low am ount of waste to the environm ent .

(23)

CAPÍTULO 1

(24)

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Contextualização

Nas últim as décadas, as espectrom etrias de fluorescência, fosforescência, quim ilum inescência e biolum inescência têm sido rotineiram ente aplicadas a problem as qualitativos e quantitat ivos de análise em quím ica analítica. Estas técnicas de lum inescência m olecular apresentam várias características que as tornam úteis para vários tipos de análises, tais com o baixos lim ites de detecção, possibilidade à detecção por m eio de um laser ou fibra ópt ica, aplicabilidade a am ostras com plexas e geração de vários tipos de inform ações – espectros de excitação e em issão, tem pos de decaim ento, dados de polarização – úteis para a identificação de m oléculas[1].

Especificam ente, a técnica quim ilum inescente está crescendo rapidam ente e vem se destacando por oferecer um a alta versatilidade para a determ inação de um a grande variedade de espécies, assim com o têm perm it ido a detecção baseada em suas reações evoluir para um a técnica altam ente sensível e de baixo custo.

No entanto, quando a técnica quim ilum inescente é adotada em consonância com técnicas de autom ação, as vantagens citadas anteriorm ente podem ser estendidas, fornecendo inform ações analít icas confiáveis e rápidas, havendo um a grande aplicação em am ostras clínicas, am bientais e industriais, em que vários analitos são determ inados em concentrações cada vez m enores.

(25)

3 Dest a form a, grandes esforços em aperfeiçoar sistem as convencionais e desenvolver novos sist em as, visando atender à crescente dem anda analítica, apresentam - se com o um a árdua tarefa de pesquisa[2].

Nesse contexto, a quim ilum inescência destaca- se por apresentar características de grande aplicabilidade na determ inação e controle da qualidade de um grande núm ero de analitos.

Sendo assim , neste trabalho é propost o o desenvolvim ent o de um lum inôm etro de baixo custo utilizando um analisador em fluxo- batelada com detecção baseada em fot odiodo para determ inação de vitam ina B12

em m edicam entos aplicando as vantagens da técnica quim ilum inescente.

1.2. Objetivo e metas

1.2.1. Objetivo geral

 Desenvolver um lum inôm etro com detecção baseada em fot odiodo associado a um sistem a autom ático de análise em fluxo- batelada para determ inação quim ilum inescente de vitam ina B12 em

m edicam entos.

1.2.2. Metas

 Construir um lum inôm etro à base de fotodiodo;

 Montar um sistem a autom át ico de análise em fluxo- batelada acoplado ao lum inôm etro;

 Desenvolver um program a para controle e aquisição dos dados analíticos;

 Aplicar o sistem a desenvolvido na determ inação de vitam ina B12 em

(26)

4

1.3. Quimiluminescência

A quim ilum inescência é um t ipo de lum inescência m olecular em que a radiação eletrom agnética em it ida ( geralm ente na região do visível) é gerada a part ir de um a reação quím ica. Este fenôm eno pode ser observado quando um dos interm ediários ou produtos da reação é form ado num estado eletronicam ente excitado, que em ite radiação eletrom agnética ( REM) ao retornar ao estado fundam ental, ou transferir a sua energia para outra m olécula, que um a vez excitada tam bém em it e REM.

O processo pelo qual a quim ilum inescência é produzida é idêntico à fot olum inescência ( fluorescência ou fosforescência) , exceto que nenhum a excitação por font e de luz é necessária. No entanto ao contrário da fot olum inescência, a produção do est ado eletronicam ent e excitado em reações quim ilum inescentes depende de processos físicos e quím icos, com o m istura da solução e da cinét ica da reação quím ica[3-5].

Para um a reação quím ica resultar na em issão de radiação, alguns requisitos são essenciais[7]:

1. A reação deve ser exotérmica para liberar energia suficiente

para formar o estado eletronicamente excitado. A energia necessária

para produzir um a espécie em seu estado excitado e em itir radiação eletrom agnética na região do visível requer cerca de 40 a 71 kcal m ol-1. Esta quant idade de energia é geralm ente liberada por reações de oxidação, part icularm ente aquelas que envolvem oxigênio, peróxidos e outros oxidantes fortes.

2. O meio reacional deve ser favorável para direcionar energia

(27)

5 3. O estado excitado deve ser luminescente ou transferir a sua

energia para outra molécula luminescente.

Nos processos lum inescentes, a intensidade da em issão de fót ons depende da eficiência na geração de m oléculas no estado excitado, a qual é representada pela eficiência quânt ica ( ou rendim ento quântico) , e pela velocidade da reação. Em se trat ando de reações quim ilum inescentes, a intensidade da em issão pode ser expressa de acordo com a Equação 1.1.

( 1.1)

onde IQL é a intensidade da em issão quim ilum inescente, em núm eros de

fót ons em it idos por segundo, QL, é o rendim ento quântico da reação

quim ilum inescente em núm ero de fót ons em itidos por m olécula excitada e

– dA/ dt, é a t axa de consum o do precursor A .

O rendim ento quântico pode ser expresso com o o produt o de duas eficiências, conform e m ostra a Equação 1.2.

( 1.2)

onde EX é a eficiência da produção de espécies eletronicam ent e

excitadas, expressa pelo núm ero de estados excitados form ado por m olécula e L é a eficiência de lum inescência das espécies

quim ilum inescentes[6,7].

As principais características que tornam as reações quim ilum inescentes interessantes para aplicações analít icas são os excelentes lim ites de detecção que podem ser atingidos e a sim plicidade instrum ental necessária para o m onitoram ento da radiação[8,9].

(28)

6 devido à dispersão de luz, excitação não seletiva e instabilidade e/ ou ruído proveniente deste tipo de com ponent e. I sso possibilita a utilização de m aiores diferenças de potencial nas fot om ultiplicadoras ( detectores usualm ente utilizados) , aum entando a razão sinal/ ruído, e a sensibilidade analítica[8,9]. Lim ites de detecção na ordem de fentom ol ( 10-15 m ol) são

possíveis em técnicas quim ilum inescentes.

A reação quim ilum inescente, que m ostra m aior potencial para aplicação analít ica na fase líquida, é a oxidação do lum inol ( 5- am ino- 2,3-dihidroftalazina- 1,4- diona) em m eio alcalino.

A em issão de luz após a oxidação do lum inol é iniciada por um fort e agente oxidante e pode se intensificar significat ivam ente sob a ação catalisadora de cát ions de m etais da prim eira série de transição. I sso explica a elevada sensibilidade a m icroquantidades (gL-1 e gL-1) dos

constit uintes da reação[8,9,11].

1.3.1. Reações quimiluminescentes do luminol

A reação de oxidação do lum inol é um a das reações quim ilum inescentes clássicas m ais est udadas. Data de 1928 o trabalho pioneiro sobre a reação do lum inol publicado por Albrecht[2,10]. A oxidação

do lum inol por H2O2 em m eio alcalino foi a prim eira reação

quim ilum inescente descrita e suas propriedades term odinâm icas e cinéticas cont inuam sendo intensam ent e estudadas até os dias de hoj e[2].

O m ecanism o dessa reação é considerado um dos m ais com plexos, e m esm o sendo um a reação clássica, apenas algum as etapas foram estabelecidas, restando ainda aspectos a serem elucidados[2,9,13,14].

(29)

7 O m ecanism o das reações envolvidas em um a m etodologia analít ica é um im port ante fator para obtenção da exatidão dos resultados. Porém , em alguns casos, este é difícil de interpretar ou im possível de ser desvendado devido à sua com plexidade. Assim , as aplicações analít icas destas reações dependem de estudos qualitat ivos e aproxim ações pert inentes ( observações experim entais e teóricas) sobre o m ecanism o da reação para encontrar parâm et ros que estabeleçam algum a relação entres as espécies de int eresse e o sinal analítico. A reação lum inescente do lum inol com o H2O2 é um destes sistem as[9].

1.3.2. O Mecanismo da reação quimiluminescente do luminol.

Vários estudos sobre o m ecanism o da reação quim ilum inescente do lum inol j á foram pulicados[2,12-14]. Alguns parâm et ros físico- quím icos,

com o constantes de velocidade e dependência do pH reacional, além de estudos sobre a participação de outras espécies, com o o íon carbonato, no aum ento da lum inescência tam bém foram discut idos, a fim de j ust ificar as propostas de m ecanism o, porém ainda não há um consenso que abranj a todos os interm ediários e etapas da reação[2,11,15-17].

ALBERTI N e colaboradores[13] elaboraram um esquem a para um

possível m ecanism o da reação quim ilum inescente do lum inol com o H2O2

(30)

8 N N O O NH2

+ 2 OH- + 2 M n+

NH NH O O NH2 O O NH NH O O NH2

H2O2 + OH

-N N O O NH2

H2O +

+ O OH O O O O NH2 * O O O O NH2 N N O O NH2 O O O O O O NH2 -H+ 1 2 2 1 3 4 5 3 5 N2 N2 h (A) (B) (C) (D) Luminol O OH

FIGURA 1.1. Mecanism o propost o por ALBERTI N e colaboradores[13] para a reação

quim ilum inescent e do lum inol em m eio alcalino e na presença do íon de um m et al de t ransição ( Mn+) , ut ilizando H

2O2 com o agent e oxidant e.

Na etapa ( A) , a ação do íon m etálico de transição, que atua com o catalisador, sobre a m olécula de lum inol em m eio alcalino leva a form ação da diazoquinona (1) . Na etapa de reação ( B) ocorre a form ação do ânion peróxido de hidrogênio em m eio alcalino (2) . Duas possíveis rotas de reação para os interm ediários (1) e (2) são apresentadas nas etapas (C) e ( D) .

(31)

9 (5) em seu estado fundam ental e luz. Na etapa ( D) há reação entre os interm ediários (1) e (2) , produzindo apenas o íon 3- am ino- ftalato e N2,

sem que haj a a produção da quim ilum inescência.

Para Merényi e colaboradores[14-17] o processo de oxidação pode ser

dividido em duas et apas (Figura 1.2) :

(i) os caminhos que levam ao intermediário principal, luminol

-hidroxi-peróxido (10).

(ii) a decomposição desse intermediário.

N N O O NH2 N NH O O NH2 O O O O NH2 * O O O O NH2 4 5 h A N N O O NH2 N NH O O NH2 H -H O2 N N O NH2 O OOH N N O NH2 HO OOH H -H -H

A O2

-H -N2

-2H -N2

6 7 8

9 10 11

B

A

+

Figura 1.2. Propost a m ecanísit ca de Merény i e colaboradores sobre os cam inhos da reação quim ilum inescent e do lum inol. A represent a espécies acept oras de elét rons e B

represent a nucleófilos.

(i)

(32)

10 No início a m olécula do lum inol, em m eio alcalino, está na form a do seu m onoânion. O m onoânion do lum inol (6) em reação com um a espécie aceptora de elét rons A ( radicais livres do lum inol, O2, cátions de m etais de

transição e vários de seus com plexos) form a o radical lum inol (7) que estabelece um equilíbrio com sua espécie desprotonada (8) . A part ir de então, Merényi e colaboradores afirm am que existem dois cam inhos prováveis à form ação do lum inol - hidroxi- peróxido (10) .

(i) caminho que aumenta a reação entre HO2- e a

3-aminodiazoquinona (9), regida pela concentração de H2O2 no meio;

(ii) caminho reacional entre o radical (8) e o superóxido (O2•)

regido pela concentração de O2 no meio.

Um a vez form ado o lum inol - hidroxi- peróxido (10) , este se decom põe ou na form a excitada do íon 3- am ino- ftalato (4) que se desativa em it indo a radiação, ou convert e na sua form a protonada (11) , que se decom põe no íon 3- am ino- ftalato no estado fundam ental (5) , produto final da reação.

Xiao e colaboradores[18] propuseram outras possibilidades tanto

para interação com H2O2, quanto à int eração dos cátions m etálicos com o

lum inol e seus interm ediários. Fundam entados na aplicação analít ica, Xiao e colaboradores, apresentaram três propostas para efeito dos cátions de m etais de transição sobre a quim ilum inescência do lum inol: ( i) a ativação de radicais do H2O2; ( ii) a form ação do lum inol - hidroxi- peróxido (10) ;

e/ ou ( iii) a decom posição do m esm o. Conform e a proposta ( i) , a decom posição catalítica do H2O2, provocada pela ação do cátion m etálico,

levaria à form ação do radical OH que é m uito reativo com o lum inol e seus interm ediários. Na proposta ( ii) a form ação do principal interm ediário (10) é iniciada após o íon m etálico elétron ou do m onoânion do lum inol (6) ou do radical (7) form ando a diazoquinona (9) . Esta proposta coincide com a rota A apresentada por Merényi e colaboradores, na Figura 1.2.

(33)

11 Essa proposta não corrobora nem com as propostas de Merényi e nem com as de Albert in e colaboradores.

1.3.3. Fatores que influenciam a emissão quimiluminescente

As determ inações quim ilum inescentes são fortem ente influenciadas por diversos fatores experim entais que afetam o sinal analít ico da em issão lum inescente[19]:

Volume de amostra: a em issão de luz é diretam ente proporcional ao volum e da am ostra quando a concentração e a razão dos reagentes não são alteradas;

Taxa de reação: a cinét ica das reações quim ilum inescent es podem se apresentar de form a lenta ou rápida, dependendo do tipo de m olécula em issora, do analito e das condições na qual estas reações ocorrem ;

Concentração dos reagentes: a concentração do m aterial

lum inescente afeta diretam ente a int ensidade da em issão de luz produzida na reação quim ilum inescente;

Homogeneização dos componentes: a hom ogeneização entre os

reagentes e a am ostra deve ser extrem am ente reprodutível;

pH do meio reacional: o pH do m eio reacional afeta a intensidade da em issão de luz em reações quim ilum inescentes;

Luz externa: as reações quim ilum inescentes devem ocorrer em am biente livre da interferência de luz externa para evitar o deslocam ento da linha de base.

(34)

12 Apesar das grandes dificuldades para elucidar o m ecanism o m ais provável da reação do lum inol e verificar os fatores que influenciam o seu rendim ento quântico, esta reação apresenta um a grande potencialidade para o desenvolvim ento de novos m étodos analíticos. Este com port am ento pode ser verificado pelo grande núm ero de art igos científicos envolvendo esse reagente, publicados no decorrer dos últim os 40 anos[9].

1.3.4. Aplicação do luminol para fins analíticos

A exploração da quim ilum inescência do lum inol para fins analít icos foi iniciada por volta da década de 50, quando est e reagente foi em pregado com o indicador em reações de tit ulom etria volum étrica[21,22].

No entanto, som ente a part ir da década de 70, as reações quim ilum inescentes passaram a ter aplicações em análises de rotina. Desde então, o núm ero de reações que produzem quim ilum inescência descrito na literat ura tem aum entado, part icularm ente em aplicações em quím ica analít ica, biom edicina, análise de alim entos, am biental e toxicológica[5,20].

(35)

13 Reação Direta:

A + B P* P + h ( lum inol) ( oxidant e)

cat alisador

Reação Indireta:

A + B P*

( lum inol) ( oxidant e) Transferência

de energia

P + acept or* acept or + h

cat alisador

Figura 1.3. Esquem a represent at ivo dos t ipos de reações quim ilum inescent es do lum inol, onde P represent a o produt o da reação. Adapt ada da Ref. [20].

Na reação direta, o lum inol e um oxidante, reagem para form ar um produto na presença de um catalisador, do qual um a fração do produto irá form ar um estado eletronicam ente excitado, que ao retornar ao estado fundam ental em itirá REM.

A reação indireta é baseada num processo de transferência de energia da espécie eletronicam ente excitada para um aceptor. Neste tipo de reação, o estado eletronicam ente excitado do produto da reação quim ilum inescente, age com o doador de energia para o aceptor, o qual não está diretam ente envolvido nest e tipo de reação. Ao receber esta energia, o aceptor, form a seu estado eletronicam ente excitado e ao retornar para o seu estado fundam ental em itirá REM[20].

As aplicações indiretas destacam - se na determ inação de substâncias, geradas em reações prelim inares e, subsequentem ente determ inadas pela reação quim ilum inescente. Um exem plo dessa aplicação é a determ inação de H2O2 produzido pela oxidação da espécie de

(36)

14 quim ilum inescente[9,19]. Com este tipo de aplicação j á foram analisados

vários tipos de substrat os de enzim as na determ inação de H2O2 em

m edicam entos, glicose e colesterol em alim entos[19], am inoácidos[23] e

DNA[24].

Nas aplicações diretas, em geral, o analito catalisa a reação quim ilum inescente, podendo ser com um ente em pregado na determ inação de m etais de t ransição, ou prom ove a inibição da radiação quim ilum inescente, que é utilizada para a determ inação de alguns com postos orgânicos[9,19].

São conhecidos m ais de 30 cátions m etálicos que inibem ou catalisam a lum inescência, entre eles podem os citar: Al( I I I ) , Ag( I ) , Au( I I I ) , Bi( I I I ) , Ce( I V) , Cd( I I ) , Co( I I ) , Cr( I I I ) , Cu( I I ) , Fe( I I ), Fe( I I I ) , Hg( I I ) , Mn( I I ) , Ni( I I ) , Os( I I I ) , Pb( I I ) , Pd( I I ) Sb( I I ) , Sn( I I ) , U( VI ) , V( I I I ) , Zn( I I ), Zr( I V)[2,7,11].

As reações quim ilum inescentes para fins de análise quantitat iva destacam - se por serem técnicas selet ivas, precisas e com baixos lim ites de detecção e quantificação. A quim ilum inescência da reação do lum inol apresenta aplicabilidade reconhecida para análise de diversos com postos orgânicos, em vários t ipos de am ostras[20,25,26]. Na

Tabela 1.1 são

(37)

15

TABELA 1.1. Aplicações da quim ilum inescência do lum inol na det erm inação de diferent es analit os.

Analito Amostra Sistema Químico Ref.

2,4 diclorofenol Águas AuNPs-Lum inol-NaOH [27]

Ácido Ascórbico Medicam entos Lum inol-Fe( I I ) -O2 [28]

Ácido Mefenâm ico Medicam entos Lum inol- Periodato [29]

Am icacina Medicam entos Lum inol-H2O2-Cu(I I ) [30]

Antígeno Carcinoem briônico Plasm a hum ano Lum inol- HRP-H2O2 [31]

Captopril Medicam entos Lum inol-K3[ Fe( CN)6] [33]

Cisteína Medicam entos Lum inol-Cisteína-NaI O4 [33]

Cloreto de Oxim etazolina Medicam entos Lum inol-KMnO4 [34]

Cortisol Sangue hum ano Lum inol-Ag(I I I ) [35]

Dopam ina Medicam entos Lum inol-K3[ Fe( CN)6] [36]

Estradiol Sangue hum ano Lum inol- HRP-H2O2 [37]

Levofloxacina Medicam entos, urina hum ana e sangue Lum inol- Mioglobina [38]

Lisozim a Clara de ovo Lum inol-AuNPs [39]

Melanina Produtos a base de leite Lum inol-H2O2 [40]

N-m etilcarbam ato Águas e vegetais Lum inol-KMnO4 [41]

Om ega-Cloroacetofenona Extratos etanólicos Lum inol-H2O2 [42]

Paracetam ol Medicam entos Lum inol-Paracetam ol-NaOCl [43]

Rutino Urina hum ana Lum inol-K3[ Fe( CN)6] [44]

Sibutram ina Medicam entos Lum inol-Sibutram ina [45]

Terbutalina Plasm a Lum inol-K3[ Fe( CN)6] [46]

Assim com o ocorreu nas últ im as décadas, espera- se que a descoberta de novas reações quim ilum inescentes m ais seletivas possa elevar potencialm ente o núm ero de analitos que poderão ser determ inados por essa técnica.

1.4. A vitamina B12

A vitam ina B12 é um com plexo tetrapirrol de cobalt o( I I ) que

(38)

16 cobalto( I I ) presente na vitam ina B12 atua no m etabolism o do ferro e da

síntese da hem oglobina, com o tam bém é o constituint e principal em outros com postos biológicos[11,52]. No sentido am plo, a vitam ina B

12

com põe um grupo de com postos conhecidos com o cobalam inas (Figura

1.4) , a qual inclui a cianocobalam ina, a hidroxocobalam ina e as duas form as biológicas encontradas na natureza com o cofatores enzim áticos, a m etilcobalam ina e 5- desoxiadenosilcobalam ina[55-58].

A deficiência de vitam ina B12 pode causar anem ia perniciosa e

neuropatia periférica, causando alterações neurológicas progressivas quando não há tratam ento adequado. Pessoas que m ant êm um a dieta exclusivam ente veget ariana estão m ais propícias a este tipo de doença, um a vez que as principais fontes desta vitam ina são de origem anim al.

A vitam ina B12 apresenta características negativas com o, a

instabilidade em sua concentração quando exposta a luz, tem perat ura e oxidação. Dest a form a, são necessários m étodos de análises eficientes para o controle de qualidade desse m edicam ento.

R Co+ N N N N N O P N O O O NH O O O O O H O O O C H3 C H3 C H3 CH3 NH2 N H2 N H2 CH3 NH2 N H2 NH2 C

H3 CH3

CH3 O H CH3 CH3 C H3 H H H H O H H N N NH2 N N O OH OH R = 5-desoxiadenosil

Metil: - CH3 Hidroxila: - OH

Ciano: - CN

(39)

17

1.5. Determinação de vitamina B12 por quimiluminescência

Diferentes m etodologias são propost as para a determ inação de vitam ina B12, tais com o aqueles que usam ensaios m icrobiológicos[47],

fluorim etria[49], crom atografia[51], espectrofot om et ria[48], espectrom etria

de absorção atôm ica[50] e et c.

Por apresentar grande sensibilidade, boa seletividade e requerer instrum entação sim ples, a quim ilum inescência vem se tornando um a alternativa atraent e para determ inação da vitam ina B12 em alim entos,

m edicam entos e fluidos biológicos[11,43,52,53].

Para esse sistem a quim ilum inescente o íon cobalto( I I ) , pode ser extraído da vitam ina B12 por hidrólise ácida, que posteriorm ente

desem penha a função de catalisar a reação de oxidação do lum inol pelo peróxido de hidrogênio. Essa reação dem onstra- se extrem am ente sensível a pequenas quantidades do íon cobalto( I I ) , o que torna pert inente a análise da vitam ina B12 a baixos lim ites de det ecção[11].

QI N e colaboradores[52] apresentaram um novo sensor

quim ilum inescente para vit am ina B12 em m edicam entos com binado a um

sistem a de análise por inj eção em fluxo ( do inglês, Flow Injection

Analysis, FI A) , tendo com o sistem a de detecção um a fot om ult iplicadora. O

sistem a quím ico baseou- se no efeito catalítico do Co( I I ) ( liberado por acidificação, e posteriorm ente im obilizado eletrostaticam ente em um a coluna de troca iônica) na reação entre o lum inol e o peróxido de hidrogênio, que foi gerado através de um eletrodo negativo de oxigênio dissolvido na célula de fluxo. O sensor respondeu linearm ente a um a faixa de concentração de 1,0x10-3 10 m g L-1 e o lim ite de detecção foi de

3,5x10-4 m g L- 1 de vitam ina B12. A frequência de analít ica foi de 60

determ inações h-1 e um desvio padrão relativo m enor que 3,5% .

SONG e HOU[53] desenvolveram um sistem a FI A para determ inações

quim ilum inescentes de vitam ina B12 .Neste trabalho, verificou- se que o

cobalto( I I ) , liberado a part ir da vitam ina B12, catalisa consideravelm ente a

(40)

18 vitam ina B12 em um a faixa de concentração de 2,0x10-10 – 1,2x10-6 g L-1,

com lim ite de detecção de 5,0x10-11 g L-1. A em issão quim ilum inescente foi detectada por um a fot om ult iplicadora alim entada a 750 V. Esse sistem a apresentou um a alta frequência analítica, realizando 120 determ inações h-1 e um desvio padrão relativo inferior a 5,0% . O m étodo desenvolvido tam bém foi aplicado para determ inação de vitam ina B12 em

produtos farm acêut icos, plasm a sanguíneo, gem a de ovo e tecidos de peixes.

AKBAY e GÖK[54] propuseram um m étodo para determ inar vit am ina

B12 em m edicam entos através de m edidas quim ilum inescentes utilizando

um sistem a FI A com detecção baseada em fot om ultiplicadora. O sistem a proposto tam bém foi baseado no efeito catalítico do Co( I I ) presente na vitam ina B12 na reação entre o lum inol e o peróxido de hidrogênio em

m eio básico. A intensidade quim ilum inescente foi proporcional à concentração de vitam ina B12 na faixa de 8,68 – 86,9 g L-1, com um

lim ite de detecção de 0,89 g L-1. Nesse procedim ento, um volum e total

de am ostras e reagentes de 6,5 m L por análise foi usado.

PULGARÍ N e colaboradores[56] desenvolveram um m étodo sensível

para determ inação de vitam ina B12 utilizando um sistem a FI A acoplado a

um fot odetector baseado em CCD ( do inglês, Charge-Coupled Device) . O princípio para determ inação da vitam ina B12 é baseado no efeito

catalisador do cobalto( I I ) na reação quim ilum inescente ent re o lum inol e o íon percabonato, com o fonte de peróxido de hidrogênio, em m eio alcalino. A intensidade da em issão foi proporcional à concentração da vitam ina B12,

(41)

19

1.6. Instrumentação básica para análises quimiluminescentes

A intensidade do sinal analítico, que é a radiação em itida a part ir de reações quím icas ou bioquím icas, está relacionada com a concentração das espécies part icipantes na reação, onde a quant idade da radiação em itida é proporcional à concentração de um a determ inada espécie. Por este m otivo, a m edida da radiação em itida é um indicador da quant idade de analito present e na am ostra e os instrum entos básicos para estas m edidas são denom inados lum inôm etros.

Um a das vantagens m ais im port antes da quim ilum inescência com o técnica analítica é a sim plicidade instrum ental, que em alguns casos é sim ilar à utilizada por outros m étodos ópticos, com o espectrofot om et ria e fluorescência. Entretanto, os equipam entos são ger alm ente m ais sim ples devido à ausência de fontes de radiação externas e de dispositivos para a discrim inação de com prim entos de onda.

A instrum entação básica para técnicas quim ilum inescentes inclui com o com ponentes principais: um a cela de reação ou reator , livre da interferência de luz externa; um dispositivo para introduzir e m isturar os reagentes e a am ostra; um detector de luz; e um sistem a de aquisição e processam ento de sinais[20,59]. A

Figura 1.5 m ostra um diagram a esquem ático básico de um lum inôm etro.

(42)

20

1.6.1. Sistema de introdução de amostras e reagentes

Dependendo da configuração do instrum ento e do m étodo de introdução da am ostra e dos reagentes, é possível classificar os sistem as

em[60-62]:

sistema com amostragem contínua: são caracterizados pelo uso de um fluxo contínuo dos fluidos. Nesse tipo de sistem as as am ostras são inseridas no percurso analítico através de um bom beam ento cont ínuo, consum indo quant idades relat ivam ente altas de am ostra.

sistema com amostragem discreta: cada am ostra preserva sua integridade em um recipiente, onde são m ecanicam ente transport adas para várias zonas do analisador de form a sequencial. Cada am ostra é conduzida ao detector do instrum ento, onde os sinais são registrados. Nesta form a de am ostragem , as am ostras estão sem pre retornando aos seus recipientes.

Em geral, os instrum entos ut ilizados na realização de determ inações quim ilum inescentes ut ilizam um sistem a discreto para introdução das am ostras e dos reagentes. Norm alm ente, um inj etor autom át ico é utilizado para esta função, tornando os volum es a serem introduzidos na cela de reação m ais reprodutíveis. A m istura da am ostra com os reagentes são alcançados pela força da inj eção dos fluidos, em bora um a barra m agnética de agitação e um agitador possam ser utilizados, possibilitando, dessa form a, que todo o perfil da intensidade quim ilum inescente versus o tem po de reação sej a m onitorado. O sinal analítico pode ser t om ado com o a intensidade m áxim a ( altura do pico) ou pela integral da área total da curva quim ilum inescente, com o m ostra a

(43)

21

Figura 1.6. Sinal analítico provenient e de reações quim ilum inescent es. ( a) É m ost rada a curva da int ensidade de quim ilum inescência em função do t em po após a m ist ura dos reagent es para iniciar a reação. A dim inuição do sinal analítico ocorre em consequência do consum o dos reagent es e m udanças na eficiência quântica quim ilum inescent e com o passar do t em po. ( b) A curva de calibração é est abelecida em relação às concent rações crescent es ou decrescent es do analit o. Adapt ada da Ref. [20].

1.6.2. Cela de reação

A cela de reação é o disposit ivo onde ocorre prat icam ente toda a m ist ura entre os reagentes e am ostra. Dependendo da reação quim ilum inescente é possível utilizar diferentes tipos de celas, procurando sem pre m axim izar a intensidade do sinal analít ico.

A cela de reação é um fator crítico em técnicas quim ilum inescentes devido à m agnit ude da intensidade do sinal analítico ser proporcional ao volum e da cela[20]. I sso acontece porque a quantidade de fluoróforos, que

são as espécies quím icas responsáveis pela em issão de luz, está diretam ente ligada ao volum e da cela, ou sej a, quanto m aior o volum e, m aior será o núm ero de espécies fluoróforas e, consequentem ente, m aior será a intensidade de em issão da radiação.

(44)

22 Norm alm ente é possível utilizar celas de reação de qualquer m aterial que perm ita a passagem da luz na faixa do visível e sej a com patível com a am ostra, tais com o o vidro, quart zo, acrílico e polietileno. Estes m ateriais perm item que um a m aior quantidade de radiação chegue ao detector, resultando em um a m elhor sensibilidade[20].

Alguns m odelos de celas de fluxo têm sido explorados em sistem as quim ilum inescentes[63,64] com o as celas

fountain[65], droplet[66],

bundle[67] e vortex[68], porém , estes tipos de celas de reação ainda não

alcançaram um a aceitação geral, devido à sua com plexidade de fabricação e a atual falta de evidências de vantagens significativas sobre a sensibilidade do sinal analít ico[63]. Alternativam ente, celas em form a de

espiral[64] tem sido com um ent e utilizado em determ inações

quim ilum inescentes, a fim de m elhorar a m istura e aum entar o volum e dentro da zona de detecção. No entanto, apesar de procedim entos bastante sensíveis serem im plem ent ados com estes dispositivos, sua aplicação apresenta algum as lim itações com o: ( i) a m istura é iniciada antes da am ostra e reagentes entrarem cela de reação; ( ii) os tubos utilizados são geralm ente translúcidos, em vez de totalm ente transparentes e ( iii) apresentar problem as com a dispersão e a reflexão da radiação[63].

1.6.3. Sistema de detecção

Segundo CAMPBELL[73] existem três requisitos básicos para que um

detector sej a utilizado na instrum entação de m edidas quim ilum inescentes:

1. resposta do detector deve estar diretam ente relacionada à intensidade da luz em itida, tendo um a resposta linear dentro de um a am pla faixa de concentração;

(45)

23 3. A velocidade de resposta do detector deve ser m uito m aior que a

velocidade da reação quim ilum inescent e.

Em instrum entos destinados a m edidas quim ilum inescent es, com o os lum inôm etros, a luz é detectada por m eio de dispositivos fot ossensíveis através da geração de um a fot ocorrente. Fotodiodos e tubos fot om ult iplicadores ( do inglês: Photomultiplier Tubes) ou sim plesm ente fot om ult iplicadoras, são os dispositivos de detecção com um ente utilizados em lum inôm etros com erciais. Melhorias realizadas nos fot odiodos têm os tornado eficazes para algum as aplicações devido a sua pequena dim ensão e baixo consum o de energia. Esses atributos tornam a sua utilização atraente especialm ente para desenvolvim ento de lum inôm etros port áteis. No entanto, os PMTs são m ais ut ilizados devido a sua eficiência em am plificar o efeito de um único fót on incidente. Esta am plificação ocorre m uito rapidam ente e é prat icam ente isenta de ruídos elétricos gerados externam ente. I sso torna os PMTs adequados para detecção em baixos níveis de luz[74].

Outro m odo de detecção é o uso de disposit ivos de carga acoplada que vem sendo apresentado com o um a alternat iva inovadora para m elhorar a seletividade requerida na m aioria das determ inações analíticas. Esses dispositivos perm item obter perfis espectrais com pletos, aum entando as inform ações a part ir da reação quim ilum inescente[56].

1.6.4. Sistema de aquisição de sinais

(46)

24 Esse m esm o program a pode controlar facilm ente todos os parâm et ros instrum entais, com o tam bém pode arm azenar e m anipular a resposta analítica.

1.7. Métodos automáticos de análises químicas

Nas últim as décadas tem - se assist ido a um crescente int eresse por part e dos laborat órios analít icos, em desenvolver m étodos autom át icos de análise com o propósito de sim plificarem os procedim ent os analít icos, de form a a realizarem um núm ero cada vez m aior de determ inações analíticas, m antendo os custos em valores aceitáveis. Além disso, a im plem entação de m etodologias autom áticas apresentam algum as outras vantagens, tais com o[75,76]:

Baixa intervenção humana. Substit uição do operador em

tarefas de rotina ou perigosas, com o por exem plo, aquelas que envolvem a m anipulação de substâncias tóxicas ou explosivas, resultando em m aior segurança e prevenção de erros subj etivos;

Aprimoramento do desempenho analítico, part icularm ente

em relação ao aum ento significativo na precisão e exatidão dos resultados;

Gestão de reagentes químicos. Minim iza o consum o de

reagentes quím icos, im plicando na dim inuição dos cust os por análise, com o tam bém na redução da produção de resíduos gerados.

(47)

25 autom ação analít ica em nível m undial. Hoj e grande parte das análises quím icas e bioquím icas de rotina e dem anda em laborat órios industriais, governam entais, am bientais, farm acêuticos, forenses e acadêm icos são realizados em sistem as parcialm ente ou totalm ente autom áticos[75,76].

1.7.1. Analisadores em fluxo-batelada

No final da década de 90, Honorato e colaboradores[77] prom overam

o desenvolvim ento dos Analisadores em Fluxo- Batelada ( AFB) com o um a nova estrat égia para autom ação de processos de análise quím ica. Estes sistem as foram caracterizados com o um híbrido dos sistem as autom áticos em batelada e em fluxo, port ando, desta form a, grande part e das vantagens analít icas de am bos.

No AFB, as am ostra( s) e reagente( s) são bom beados ou aspirados para um a câm ara de m istura a part ir do tem po de abertura de válvulas solenoides. Nesta câm ara ocorre a hom ogeneização destas substâncias, que é realizada por m eio de um a barra m agnética de agitação e um agitador. Após o processam ento a reação, a m istura é bom beada para o detector. Em alguns casos, a detecção é realizada dentro da pr ópria câm ara de m istura.

(48)

26

FIGURA 1.7. Esquem a sim plificado com os com ponent es principais de um sist em a AFB. ( a) câm ara de m ist ura; ( b) agit ador m agnét ico; ( c) válvulas solenoides de t rês vias; ( d) bom ba perist áltica; ( e) acionador de válvulas; (f) det ect or; ( g) com put ador . Adapt ada da Ref. [75].

Na Figura 1.7 é apresentado um diagram a esquem ático que m ostra os com ponentes com um ente utilizados para as várias operações unitárias no processo de análise em fluxo. Um sistem a AFB típico consiste norm alm ente de cinco part es essenciais:

1. Um sistema de propulsão, que im pulsiona os fluidos por todo o

percurso analít ico do sistem a.

2. Um sistema de condução dos fluidos conect ando fisicam ente todos os elem entos que com põem o percurso analítico.

3. Um sistema de comutação, que utiliza válvulas solenoides de três vias para direcionam ento dos fluidos ora para a câm ara de m ist ura, ora para os respectivos recipientes de origem .

(49)

27 5. Um sistema de detecção, perm itindo o m onitoram ento de um a dada propriedade da am ostra ou de seu produto, fornecendo inform ações qualitativas e/ ou quantitat ivas sobre a m atriz.

1.7.1.1. Sistema de propulsão

As bom bas peristált icas (Figura 1.8) são as unidades de propulsão de fluidos m ais com um ente ut ilizadas em sistem as FB devido a sua capacidade m ult icanal. I sso favorece o bom beam ento de várias linhas de am ostra( s) e reagente( s) de form a sim ultânea, m antendo a vazão constante e perfeit am ente reprodutível. Bom bas peristált icas m odernas podem ser controladas por m icrocom putador e diferentes vazões podem ser estabelecidas durante um a m esm a m edida analítica.

FIGURA 1.8. Bom ba perist áltica com ercial utilizada na propulsão dos fluidos em sist em as AFB.

Recentem ente, ALMEI DA e colaboradores[61,79] desenvolveram um

sistem a AFB ut ilizando um a bom ba pistão acoplada à câm ara de m istura para propulsão dos fluidos (Figura 1.9) . Nesse tipo de analisador, a

(50)

28 passos e o pistão form a a unidade de propulsão do analisador, que funciona de form a sim ilar a um a bom ba seringa.

Os volum es dos fluidos que são aspirados para a câm ara de m istura são controlados pelo tem po de acionam ento das válvulas solenoides, que atuam com o interruptoras de fluxo, e pela rotação de um m otor de passos, responsável pelo m ovim ento do pistão, que é controlado por m eio de um m icrocom put ador.

FIGURA 1.9. Bom ba pist ão acoplada à câm ara de m ist ura desenvolvido por ALMEI DA e colaborades[61,79] para propulsão dos fluidos em um sist em a FB. ( a) m ot or de passos ( b)

câm ara de m ist ura ( c) visualização int erna da câm ara de m ist ura com o pist ão inserido em seu int erior. As set as indicam os sent idos de m ovim ent o do pist ão.

Essa relevante contribuição perm ite o desenvolvim ento de sistem as FB de baixo custo, sem perdas de sensibilidade e reprodutibilidade, m antendo a robustez, flexibilidade e relativa port abilidade.

1.7.1.2. Sistema de condução dos fluidos

Os arranj os para acondução de fluidos m ais com uns de sistem as FB são geralm ente com preendidos de t ubos com diâm etro interno de 0,2 a 2,5 m m .

( b)  

( a)

(51)

29 Os principais t ipos de t ubos utilizados em sistem as FB são ditos tubos de bom beam ento ( norm alm ente em pregados em bom bas peristált icas) e tubos de condução.

Para a propulsão dos fluidos, tubos flexíveis estão disponíveis em diferentes m ateriais, dependendo do t ipo de fluido a ser im pelido[80]. Dois

colares são geralm ente colocados pert o das extrem idades de cada tubo da bom ba, os quais servem com o pontos de ligação entre os arreios da bom ba e aj udam a ident ificar o diâm etro interno e, port anto, a vazão a part ir do código de cores dos colares (Figura 1.10) .

FIGURA 1.10. Tubos de bom beam ent o para bom bas perist álticas. Para bom bas com velocidade de rot ação fixa, o diâm et ro int erno desses t ubos e a rot ação da bom ba det erm inam a ordem de grandeza da vazão.

A incom patibilidade entres os tubos de bom beam ento com ácidos e bases concentradas e solventes orgânicos geralm ente força a calibração periódica do sistem a FB ou a utilização de tubos resistentes a estes reagentes. A adsorção física dos analitos orgânicos em tubo de PVC ( cloreto de polivinila, com ercializado com o nom e de Tygon®) é outra lim itação prát ica com um ente descrita[81]. Já para a condução dos fluidos,

alguns tubos, com o os de PTFE ( politetrafluoretileno, com ercializado com o nom e de Teflon®) são ut ilizados por serem quim icam entes inert es. Contudo, t ubos de Tygon® tam bém são adequados para um a am pla

(52)

30

1.7.1.3. Sistema de comutação

Visando o desenvolvim ento da inst rum entação analítica para sistem as de análise em fluxo, Reis e colaboradores[82] propuseram o uso

de válvulas solenoides de três vias (Figura 1.11) , que são disposit ivos discretos de inserção de fluidos, e são controladas independentem ente por m eio de um m icrocom putador. Esse processo perm ite autom at izar os procedim entos analíticos através do controle na inserção de alíquotas de am ostras e soluções de form a intercalada ou sequencial[83-84].

FIGURA 1.11. Visualização ext erna e int erna de um a válvula solenoide de t rês vias utilizadas em sist em as AFB.

Os sistem as FB por fazer uso da com utação apresentam a vantagem de não necessitarem de um a reconfiguração fisica do sist em a, perm it indo apenas que se altere o funcionam ento do m ódulo de análise sem alterar a configuração do m esm o.

1.7.1.4. Câmara de mistura ou reação

A câm ara de m istura é um com ponente fundam ental em um sistem a FB. Neste dispositivo ocorre a m aior part e dos procedim entos analít icos, com o m istura, hom ogeneização, reação e condicionam ent o dos fluidos e preparo de soluções de calibração.

(53)

31

FIGURA 1.12. Câm ara de m ist ura de sist em as FB. ( a) cavidade; ( b) ent rada de fluidos; ( c) ent rada/ saída de fluidos.

Através do uso da câm ara de m ist ura é possível que as am ostras e/ ou reagentes sej am processados em batelada. Assim , as m edidas podem ser realizadas com a m áxim a sensibilidade, pois os equilíbrios físico e quím ico do processo analít ico podem ser alcançados.

1.7.1.5. Sistema de detecção

Um sistem a de análise em fluxo perm ite utilizar diferentes dispositivos de det ecção, dependendo do tipo de análise quím ica ou da quant idade de analito a ser investigada. Nesse contexto, um a característica m arcante do analisador FB é a sua versatilidade quanto ao seu acoplam ento a diversas form as de detecção, conform e apresent ado na

Tabela 1.2.

(b) (a)

Imagem

FIGURA  1.1.  Mecanism o  propost o  por  ALBERTI N  e  colaboradores [13] para  a  reação  quim ilum inescent e  do  lum inol  em   m eio  alcalino  e  na  presença  do  íon  de  um   m et al  de  t ransição ( M n+ ) , ut ilizando H 2 O 2  com o agent e o
Figura  1.2.  Propost a  m ecanísit ca  de  Merény i  e  colaboradores  sobre  os  cam inhos  da  reação  quim ilum inescent e  do  lum inol
Figura  1.3.  Esquem a  represent at ivo  dos  t ipos  de  reações  quim ilum inescent es  do  lum inol, onde P represent a o produt o da reação
Figura 1.4. Est rut ura m olecular da cobalam ina. Adapt ada da Ref. [57].
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