Biologie moléculaire : recherche de gènes homologues

L’ADN génomique des quatres espèces étudiées a été extrait à partir de jeunes feuilles, selon le protocole utilisant le détergent CTAB (hexadécyltriméthylammonium bromide) décrit par Ausubel et al. (1997). Après extraction des acides nucléiques dans un tampon à 2 % (p/v) de CTAB et 1,4 M NaCl, les protéines sont précipitées au chloroforme/octanol.

7 Un véritable test de compétition nécessiterait la purification totale des différentes isoformes ce qui n’est pas réalisable dans notre cas.

L’ADN est ensuite précipité sous forme d’un complexe avec le CTAB, complexe insoluble se formant quand la concentration en NaCl est réduite à 0,5 M. Ce complexe est ensuite solubilisé, à des concentrations en sels élevées, ce qui permet de récupérer l’ADN, précipité par de l’isopropanol. La seule modification apportée à ce protocole, est l’ajout, au moment du broyage des feuilles dans l’azote liquide, de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) à 15 % p/p (MW=40000), permettant d’éliminer les composés phénoliques (Page et al., 1997).

2) Amplification de fragments de gènes par PCR

La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une méthode d'amplification de l'ADN utilisant les propriétés de réplication de l'ADN.

Différentes amorces ont été utilisées pour ce travail :

• 3 amorces dégénérées (voir la détermination de ces amorces dans la partie résultats).

For 1: 5' TCY-TCI-CCI-TTY-GAR-RTI-CCI-CCI-TG 3' Rev 3: 5' TSR-CAI-ARR-TTI-GGR-TSY-TCI-TC 3' Rev 1: 5’ CRA-ARC-ACC-AIC-CRT-AIT-CIA-TRT-M 3’

Ces amorces sont dites dégénérées car certaines de leur positions ne sont pas pleinement déterminées, ainsi Y représente C ou T; R, A ou G; M, A ou C et S, C ou G. I, l’inosine s’apparie indifféremment à n’importe laquelle des quatre bases. Plus le degré de dégénérescence est grand, moins l’oligonucléotide est spécifique et plus il doit être concentré lors de la PCR. Les primers For 1, Rev 1 et Rev 3 sont utilisés 10 fois plus concentrés que des primers non dégénérés.

• 2 amorces non dégénérées :

L 914 : GCT-TAC-TGT-TCT-ATT-TTT-ATG-GT U 238 : GCT-TCT-TTG-ATT-GTC-CTG-TTT-GC

Cette paire amplifie un fragment de 699 bp contenant toute la séquence codant pour PA1b.

Elle a été utilisée pour tester l'ADN extrait des feuilles de pois lors de la mise au point du protocole d'extraction.

Les réactions de PCR ont été effectuées dans un thermocycleur (Perkin Elmer Gene Ampli PCR 2400) dans un volume réactionnel de 50 µl sur des quantités de matrice variant de 10 à 500 ng, avec 1,25 unités de Taq polymérase et son tampon 10 X (Amersham) selon les schémas de la Figure 38.

Définition de l’approche : à la découverte de la famille des A1b

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A ADN matrice : 500, 50 et 10 ng amorce Rev : 0,3 µM

amorce For : 0,3 µM tampon 10 X : 5 µl

MgCl2 : 1,5 mM

Taq polymérase: 1,25 U

dNTP : 0,2 mM

eau ultra pure : qsp 50 µl

B 35 cycles

94 °C 72 °C 50°C

4min 30s 45s 5min 45s

4 °C ∞

Figure 38 : Protocole d’amplification d’ADN par PCR pour des primers non dégénérés (concentrations finales). A : mélange réactionnel, B : cycle de réaction.

3) Electrophorèse sur gel d'agarose

Pour s'assurer de la qualité de l'amplification, une électrophorèse des produits de PCR a été réalisée sur gel d'agarose à 1,5 %, sous une tension de 80 V. Le tampon de migration utilisé est le TEA (Tris-HCl 1,6 mM pH 8 ; EDTA 4 µM ; acétate de sodium 1,6 mM).

La migration est suivie grâce à une solution de dépôt (bleu de bromophénol 0,25 % (p/v) ; xylène-cyanol 0,25 % (p/v) ; EDTA 25 mM ; glycérol 50 % (v/v)) ajoutée à la solution d'ADN à environ 20 % du volume. Un marqueur de poids moléculaire allant de 0,5 kb à 12 kb (Gibco BRL, 1Kb DNA ladder) a été déposé dans le gel à côté de l’ADN et permet d’évaluer la taille des fragments. Après migration, les fragments d'ADN ont été observés sous UV grâce au bromure d’éthydium (BET) ajouté au gel d'agarose à raison de 0,5 µg.ml^-1.

4) Clonage

Le clonage se fait en plusieurs étapes. Après avoir purifié les fragments d’ADN, ceux-ci sont insérés dans un vecteur plasmidique. Le plasmide est alors introduit par électroporation dans des bactéries compétentes.

(a) Préparation des bactéries électrocompétentes

La bactérie employée ici est Escherichia coli (souche NM 522, lac-). A partir d'une préculture d’une nuit dans 5 ml de milieu de culture de Luria Bertoni (LB) (NaCl 10 g.l^-1 ; bactotryptone 10 g.l^-1 ; extrait de levure 5 g.l^-1 pH 7) à 37°C, 250 rpm dans un agitateur- incubateur type Innova 4000, un erlen stérile de 50 ml de LB a été ensemencé au 1/100^ème. Après incubation à 37°C pendant 4 ou 5 heures (on se situe alors dans la partie de croissance linéaire de la culture), toujours sous agitation, cette culture a été refroidie dans la glace. Les cellules doivent être maintenues au froid tout au long de la suite de la préparation. Les 50 ml ont été centrifugés à 3000 g pendant 15 min et le surnageant a été éliminé. Le culot, repris dans 50 ml de glycérol 10 % stérile, a été centrifugé à 3000 g pendant 15 min et le surnageant est éliminé. Cette dernière opération a été répétée 2 fois.

Les bactéries compétentes reprises finalement dans 0,4 ml de glycérol 10 %, ont alors été aliquotées par 50 µl et conservées à –80°C.

(b) Préparation des plasmides portant l’insert

Les fragments d'ADN amplifiés à liguer ont tout d’abord été purifiés. Ils ont été concentrés dans des concentrateurs centrifuges (Nanosep 30 K), par une centrifugation de 5 min à 6000 g. Le rétentat a été récupéré et déposé sur gel d’agarose 2% (pour des fragments de 500 bp ou moins). Après migration, les bandes visualisées sous UV ont été

découpées. La purification de l’ADN a alors été effectuée à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction de QIAgen selon les recommandations du fournisseur. Avant la ligation, l’ADN purifié, a été dosé par une électrophorèse sur gel d'agarose à 1%.

La ligation a été effectuée grâce au kit pMosBlue blunt-end vector (Amersham). Les plasmides sont fournis linéarisés par l'enzyme EcoRV et à bouts francs. Le produit de PCR purifié a été placé en contact du plasmide (rapport insert/vecteur de 2,5/1) et soumis à la réaction de ligation d’après les recommandations du kit.

Avant la transformation, les plasmides, issus de la réaction de ligation, subissent une microdialyse afin d’éliminer les sels qui pourraient gêner l’électroporation.

(c) Electroporation

L’électroporation est une technique de transformation par choc électrique de courte durée (entre 5 et 10 millisecondes) mais intense (appareil Biorad, résistance de 400 ohms, capacitance de 25 µFd, différence de potentiel de 2,5 V).

50 µl de bactéries compétentes (4.10⁸ bactéries), auxquels ont été ajoutés 1 µl de plasmide (50 ng), ont été déposés dans des cuves à électroporer et soumises à une décharge électrique. 950 µl de milieu LB ont immédiatement été ajoutés, et les cellules ont été laissées à 37°C durant 1 heure. Cette incubation permet aux gènes de résistance aux antibiotiques (ampicilline), portés par le plasmide, de s’exprimer. Les bactéries, après centrifugation 1 min à 3000 g, ont été étalées sur milieu sélectif sur lequel seules les bactéries transformées se développent (LB gélosé, ampicilline 50 µg.ml^-1, Xgalactose (Xgal) 12 µM, IsoPropylThio-β-D-Galactoside (IPTG) 200 mM). Après une nuit à 37°C les boites ont été mises à 4°C pendant 4 ou 5 heures. Cette étape permet de différencier les clones transformés avec un plasmide portant un insert (blancs car lac-), des clones au plasmide vide (bleus car lac+). Le site Eco RV, qui a permis l'ouverture du plasmide, est contenu dans le polylinker inséré à l'intérieur d'un fragment du gène lacZ qui reste fonctionnel malgré cette insertion. Ainsi, lorsque la cellule hôte, lac-, intègre un plasmide vide, elle devient lac+.

5) Minipréparation d’ADN plasmidique par lyse alcaline

Le protocole de préparation de l'ADN plasmidique est celui décrit par Sambrook et al.

(1989), basé sur une dénaturation alcaline du chromosome bactérien qui précipite, avec les protéines complexées par le SDS, tandis que l’ADN plasmidique est renaturé et reste soluble. Un traitement à la RNAse et une extraction phénolique ont été réalisés en plus pour une meilleure purification (élimination des ARN et des protéines).

6) Séquençage

Le séquençage de l’ADN plasmidique est réalisé par Génome Express S.A. (Grenoble) sur des aliquotes de 10 µl (500 ng). La réaction de séquençage a été effectuée par amplification par PCR dans un volume final de 20 µl en utilisant 100 ng de produit PCR, 5 pmol de primers et 9,5 µl d'un mélange de ddNTP colorés (Didesoxy 2' 3' Nucléotides Triphosphate) selon le protocole Applied Biosystems.

7) Recherche des séquences amont des gènes

Afin de disposer de l’entière partie des gènes codant pour des homologues de PA1b, les séquences en amont de celles obtenues par PCR ont été recherchées, à l'aide du kit Universal GenomeWalker^TM (Clontech, USA), selon les indications du fournisseur (principe en annexe 1). L'ADN génomique a été digéré par 4 enzymes de restriction à bouts francs (DraI, EcoRV, StuI, PvuII). Après purification de l'ADN, quatre banques de

Définition de l’approche : à la découverte de la famille des A1b

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digestion ont alors été obtenues. Pour chacune, une réaction de ligation d'adaptateurs fournis dans le kit a été réalisée. L'ADN est alors prêt pour réaliser les 2 PCR consécutives et nichées : les amorces de la seconde amplification s'hybrident, sur le fragment obtenu après la PCR 1, intérieurement aux primers de cette première PCR (Figure 39). Pour chacune, une amorce du kit, s'hybridant sur l'adaptateur, et une amorce spécifique, déterminée d'après les séquences incomplètes obtenues par PCR classique, ont été utilisées.

Fragment de PCR1 Fragment de PCR2

Figure 39 : Principe de la PCR nichée. Les amorces de la première PCR (flèches au trait plein) amplifient un premier fragment sur lequel s'hybrident les amorces de la deuxième PCR (pointillés), qui amplifient alors un

fragment (en noir) plus court et interne au premier produit.

Le produit de PCR majoritaire et de taille supérieure à 600 pb obtenu dans l’une des 4 banques a alors été cloné et deux clones en ont été doublement séquencés. Les séquences ont alors été assemblées et analysées avec le logiciel MacMolly, contrôlées vis-à-vis d’éventuelles erreurs de PCR ou séquençage et vis-à-vis des séquences de départ, annotées pour leur partie codante, la position de leur intron et du peptide signal (grâce aux logiciels Signal P, NetGene2, NetStart disponibles au http://www.cbs.dtu.dk et manuellement d’après les séquences génomiques connues du pois et du soja). Elles ont ensuite été soumises à EMBL avec les numéros d’accessions suivants : AJ574789 à AJ574791 plus AJ574793 pour la séquence du pois complétée dans sa partie 3’ (PA1a) par la séquence d’un cDNA de graine de pois identique sur la partie commune.

II.

Résultats

A. Recherche des homologues de PA1b dans les graines des