Expression dans les différents compartiments cellulaires

Expression hétérologue

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Figure 76 : Corps d’inclusion dans des cellules d’E. coli visualisés au microscope électronique.

Différentes approches expérimentales ont été effectuées pour minimiser la formation de ces corps protéiques et améliorer le repliement des protéines :

• Diminution de la température d’expression à 20-25°C. Le taux de synthèse est plus lent, ce qui laisse plus de temps au polypeptide pour se replier (Schein, 1989),

• Utilisation de souches différentes,

• Expression sous forme de protéines de fusion pour augmenter la solubilité des protéines d’intérêt (partie détaillée ultérieurement dans ce chapitre),

• Addition de sucres non métabolisables dans le milieu de culture (Bowden and Georgiou, 1990),

• Co-expression de molécules chaperones. Ces protéines empêchent l’agrégation des polypeptides dans le cytoplasme en aidant au transport et au repliement des protéines. L’agrégation intervient quand les protéines surexprimées ne sont pas capables de se fixer aux chaperones parce que celles-ci sont en quantités insuffisantes (Lee and Olins, 1992). La co-expression des molécules chaperones avec les protéines hétérologues peut résoudre ces problèmes.

Ces paramètres devront être adaptés pour chaque type de protéine surexprimée, puisque la formation des corps d’inclusion dépend entre autre de la nature de la protéine. Cependant ces paramètres ne sont pas applicables dans le cas des protéines à ponts disulfures. En effet, le cytoplasme de la bactérie est un environnement réducteur. Les protéines nécessitant la formation de ponts disulfures pour être actives ne peuvent les former et précipitent. Des cellules souches mutantes, permettant la formation de ces ponts dans le cytoplasme d’E. coli ont été isolées (Derman et al., 1993 ; Prinz et al., 1997). Ces mutations inactivent soit le gène de la thiorédoxine réductase, soit le gène de la gluthatione réductase. Les deux thiorédoxines cytoplasmiques sont alors présentes sous une forme oxydée et catalysent la formation des ponts disulfures (Bessette et al., 1999).

Ces souches doivent ainsi permettre théoriquement d’obtenir des protéines solubles et correctement repliées.

Malgré tout, les corps d’inclusion présentent quelques avantages. Du fait de la forte concentration en protéines et de leurs formes agrégées, les corps d’inclusion peuvent facilement être isolés des autres protéines cellulaires (Makrides, 1996). De plus, les protéines ainsi précipitées sont protégées de l’action des protéases cytoplasmiques. Et enfin, cette méthode permet la surexpression de protéines, toxiques sous leur conformation native pour la cellule hôte (De Bernadez Clark, 1998), c’est le cas de nombreuses toxines (Howell and Blumenthal, 1989 ; Turkov et al., 1997).

Puisque les corps d’inclusion contiennent de 5-40 % des protéines totales, dont en moyenne 50 % de protéines surexprimées, il est intéressant de les purifier et de les rendre biologiquement actives. La stratégie nécessite trois étapes majeures pour l’obtention de protéines biologiquement actives : l’isolement et la solubilisation des corps d’inclusion, la

purification et la renaturation des protéines dans une forme active, et la séparation des protéines bien repliées de celles mal repliées (Kohno et al., 1991). Dans le cas de PA1b, dont la structure est complexe, l'étape de renaturation apparaît critique et nous n'avons donc pas considéré les corps d'inclusions, mais les protéines solubles dans le cytoplasme.

(b) Expression périplasmique

Le périplasme offre de nombreux avantages pour l’expression de protéines recombinantes.

Premièrement, il possède un environnement beaucoup plus oxydant que le cytoplasme. Il est donc particulièrement intéressant pour le repliement correct de nombreuses protéines d’origine eucaryote. En effet, le périplasme contient les enzymes catalysant la formation et le réarrangement des ponts disulfures (Aslund and Beckwith, 1999). Deuxièmement, ce compartiment ne contient que 4 % des protéines totales, soit environ une centaine de protéines. La protéine surexprimée sera donc concentrée et sa purification facilitée. Enfin, le périplasme contient beaucoup moins de protéases que le cytoplasme, les protéines seront donc moins exposées à la dégradation protéolytique (Gottesman, 1990).

Les polypeptides destinés à l’espace périplasmique doivent traverser la membrane interne d’E. coli. Une séquence signal située en N-terminal de la protéine hétérologue est nécessaire pour la translocation à travers la membrane interne. La plupart des séquences signal proviennent de protéines naturellement transférées dans l’espace périplasmique, comme OmpA (Ghrayeb et al., 1984), ou la protéine A (Hogset et al., 1990). Le peptide signal a pour but de diriger la protéine et de ralentir son repliement. La protéine chaperonne cytoplasmique SecB interagit et stabilise les protéines destinées à la sécrétion périplasmique, protéines qui doivent être solubles et partiellement repliées pour une translocation efficace (Derman et al., 1993). La suite du processus est ATP-dépendant et fait intervenir différentes chaperonnes membranaires. Les séquences signal sont alors clivées de la protéine d’intérêt par des peptidases liées à la membrane interne. De plus, la méthionine initiatrice de la traduction est généralement clivée en même temps. Ceci permet d’obtenir une extrémité N-terminale identique à celle de la protéine d’intérêt native (Makrides, 1996). Le repliement oxydatif du polypeptide peut ensuite s’effectuer dans le périplasme. Il est catalysé par la protéine DsbA qui est équivalente à la protéine disulfide isomérase (PDI) des systèmes eucaryotes (Baneyx, 1999 ; Mukhopadhyay, 1997) et DsbC qui permet aussi l’isomérisation des ponts disulfures (Cornelis, 2000 ; Lilie et al., 1998).

Cependant dans certains cas, les protéines recombinantes ne sont pas exportées dans le périplasme malgré la présence d’une séquence signal. Ces protéines s’accumulent alors au niveau de la membrane interne et précipitent sous forme de corps d’inclusion ou sont rapidement dégradées par des protéases cytoplasmiques (Baneyx, 1999). Pour tenter d’améliorer cette translocation, différentes solutions peuvent être envisagées. Des composants, intervenant dans le transport et le processus, peuvent être co-exprimés avec la protéine hétérologue (Qiu et al., 1998). Un autre inconvénient possible de la sécrétion périplasmique est le mauvais repliement des protéines d’intérêt et donc la formation de corps d’inclusion ou la dégradation de celles-ci, dans le périplasme. Des stratégies possibles pour résoudre ces problèmes sont la co-expression de chaperonnes moléculaires, de protéines disulfides isomérases ou encore une modification des conditions de culture à plus faible température (Bowden and Georgiou, 1990 ; Makrides, 1996).

Certaines protéines transférées dans l’espace périplasmique peuvent ensuite être sécrétées dans le milieu de culture par une perméabilisation délibérée de la membrane externe.

Expression hétérologue

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(c) Sécrétion extra-cellulaire

E. coli est une bactérie qui sécrète naturellement peu de protéines. Cependant la sécrétion présente de nombreux avantages. Premièrement, de nombreuses protéines sont soumises à la dégradation protéolytique dans le cytoplasme. La sécrétion va permettre de résoudre ce problème en séparant physiquement les protéines hétérologues et les protéases.

Deuxièmement, la méthionine initiatrice de la traduction, qui peut être à l’origine d’une baisse de l’activité biologique, est clivée durant le processus protéolytique qui accompagne la translocation de la protéine à travers la membrane interne. Troisièmement, l’activité biologique dépend du repliement correct de la protéine. Certaines protéines se replient mal dans le cytoplasme réducteur. La sécrétion de protéines dans le périplasme puis dans le milieu de culture permet d’obtenir un environnement plus favorable pour le repliement des protéines, notamment dans le cas des protéines à ponts disulfures (Better et al., 1988). Enfin, la purification des protéines surexprimées est facilitée car peu de protéines sécrétées sont présentes dans le milieu de culture (Makrides, 1996 ; Stader and Silhavy, 1990).

Cependant, il existe quelques problèmes majeurs pour la sécrétion de protéines. La translocation à travers la membrane interne peut être inefficace ou incomplète. Il se peut aussi que la machinerie de sécrétion soit énergétiquement insuffisante. Tous ces problèmes vont diminuer les rendements en protéines surexprimées. D’autres facteurs, tels qu’un repliement anormal ou des modifications post-traductionnelles incomplètes, peuvent aussi diminuer l’activité biologique des protéines hétérologues. Généralement, les protéines de petites tailles (hormones, facteurs de croissance) sont sécrétées plus efficacement que les protéines plus complexes (Makrides, 1996).

(d) Expression sous forme de protéines de fusion

Depuis quelques années, des stratégies d’expression en fusion traductionnelle des gènes d’intérêt avec un partenaire se développent. Ces systèmes permettent d’augmenter les rendements d’expression et limitent la formation de corps d’inclusion, maintenant leur partenaire soluble dans le cytoplasme. Les partenaires de fusion contiennent les déterminants qui faciliteront la purification, et pourront être facilement clivés de la protéine d’intérêt par des méthodes chimiques ou enzymatiques.

Actuellement quatre systèmes sont principalement utilisés : la protéine A de Staphylococcus aureus (SPA) (Nilsson and Abrahmsen, 1990), la glutathion-S-transférase de Schistosoma japonicum (GST) (Smith and Johnson, 1988), la Maltose Binding Protein d’E. coli (MBP) (Di Guan et al., 1988) et la thiorédoxine de E. coli (TRX) (LaVallie et al., 1993). Ces systèmes ont permis la production de protéines recombinantes solubles dans le cytoplasme de la bactérie et correctement repliées. De plus, les niveaux de production ont pu être augmentés. La stabilité et la solubilité des partenaires, ainsi que leurs caractéristiques de repliement, leur permettent d’agir comme des chaperonnes moléculaires covalemment liées à la protéine d’intérêt. Elles donnent une opportunité supplémentaire au polypeptide naissant de se replier plutôt que de s’agréger. Pour assurer une bonne initiation de la traduction, les partenaires sont généralement placés en 5’ du gène d’intérêt (LaVallie and McCoy, 1995). De nombreux autres systèmes de protéines fusion existent. Certains d’entre eux vont permettre l’exportation des protéines hétérologues dans le périplasme ou le milieu de culture (cf. I.B.2)(b) et I.B.2)(c)).

Les bons partenaires de fusion possèdent des propriétés qui vont être exploitées pour faciliter la purification. Les protéines porteuses vont servir de « Tag ». Par exemple, les protéines de fusion MBP pourront se fixer sur des résines d’amylose et être éluées avec du

maltose (Di Guan et al., 1988). Chacun des partenaires pourra être purifié par chromatographie d’affinité sur des résines qui leur sont spécifiques. Si les partenaires ne possèdent pas de propriétés favorisant la purification, des étiquettes pourront être ajoutées.

Généralement, ce sont des étiquettes polyhistidines (His6) (Crowe et al., 1994) ou FLAG (AspTyrLysAsp4Lys) (Hopp et al., 1988) qui sont utilisées. Elles sont placées en N-, C- terminal ou entre les deux partenaires de la fusion et permettront une purification par chromatographie d’affinité sur une colonne de métal chélaté (nickel ou cobalt).

Les clivages entre les partenaires de la fusion vont s’effectuer soit par des méthodes chimiques, soit enzymatiques. Pour ce faire, un site de reconnaissance doit être introduit entre les deux protéines. Les principales coupures chimiques et enzymatiques sont résumées dans le Tableau 9. Les méthodes chimiques ne sont pas très spécifiques. Il est fréquent que les protéines d’intérêt contiennent des méthionines ou les dipeptides Asp-Pro et Asn-Gly. Il est alors nécessaire d’effectuer un clivage avec des protéases qui reconnaîtront spécifiquement une séquence. Ces enzymes clivent généralement à l’extrémité C-terminale du site de reconnaissance et il n’y a donc pas d’acide aminé supplémentaire en N-terminal de la protéine d’intérêt. Les protéases sont beaucoup plus sensibles que les agents chimiques à l’encombrement stérique. Le site de clivage devra donc être construit de manière à être accessible aux enzymes.

Après coupure, une étape de purification par chromatographie d’affinité permettra de séparer les deux partenaires. La protéine d’intérêt ne sera pas fixée sur la colonne, tandis que la protéine partenaire le sera par l’intermédiaire de son « tag ».

Tableau 9 : Enzymes et agents chimiques utilisés pour le clivage des protéines de fusion

Méthode de clivage Séquence de reconnaissance Référence Chimique

Bromure de cyanogène -Met- (Kuliopulos and Walsh, 1994)

Clivage acide -Asp-Pro- (Szoka et al., 1986)

Clivage à l’hydroxylamine -Asn-Gly- (Antorini et al., 2000) Enzymatique

Collagénase -Pro-Val-Gly-Pro- (Germino and Bastia, 1984) Entérokinase -Asp-Asp-Asp-Lys- (LaVallie et al., 1993)

Facteur Xa -Ile-Glu-Gly-Arg- (Zak and Aisen, 2002)

Thrombine -Gly-Pro-Arg- (Ahmad et al., 1999)

Trypsine -Arg- (Varadarajan et al., 1985)

En conclusion, pour exprimer PA1b :

• Les levures, a priori adaptées aux peptides à ponts disulfures, ont été rejetées au vu des essais préliminaires infructueux.

• Les cellules d'insectes n'ont pas été envisagées pour cause de toxicité de PA1b.

• Les cellules de mammifères n'ont pas été retenues essentiellement par la lourdeur de leur manipulation et l'absence de cultures dans l'unité URPVI (Nantes).

• La transgénèse animale comme végétale n'a pas été envisagée, entre autres raisons, pour l'absence de structure adaptée dans l'unité.

• E. coli a été choisie pour sa simplicité de manipulation et le fait qu'elle soit a priori adaptable à la production de peptides soufrés. Les systèmes bactériens sont, de plus, couramment employés dans l'unité URPVI.

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