Fractionnement et toxicité des différentes fractions

Après avoir étudié la toxicité des farines entières, un fractionnement de celles-ci a été réalisé comme décrit dans Matériel et Méthodes (I.A.3), afin de révéler la présence d'éventuels homologues protéiques de PA1b.

Les proportions des différentes fractions dans la farine totale sont consignées dans la Figure 42. On remarque que l'importance de chaque fraction varie suivant les plantes. En particulier, les proportions des fractions résidu et pentane qui varient inversement. Elles correspondent en effet à deux types de réserves différentes, lipidiques et glucidiques (amidon, cellulose). Le soja, utilisé pour produire de l’huile est bien plus riche en fraction lipidique (21%) que le pois ou le haricot (3%).

Pisum sativum 3% 4% 8%

6%

61%

8%

10%

1 2 3 4 5 6 7

Phaseolus vulgaris 3% 4%

7%

5%

61%

9%

11%

Medicago truncatula 10% 7%

10%

9%

47% 5%

12%

Glycine max

9%

8% 6%

9% 21%

9%

38%

Figure 42 : Importance des différentes fractions dans la farine entière du pois, soja, de M. truncatula et du haricot (% p/p). 1 : fraction pentane (lipides), 2 : MeOH, 3 : MeOH60, 4 : H2O5, 5 : H2O8, 6 : résidu, 7 :

pertes.

Les différentes fractions des quatre plantes étudiées ont ensuite été testées à la concentration qu’elles avaient dans la farine d’où elles ont été extraites (EFE).

(a) Toxicité des fractions méthanol 60 % sur S. oryzae

Etant la fraction d’où a été purifiée PA1b à partir du pois, MeOH60 a été la première étudiée. Pour le pois, elle entraîne la mort de 100 % des charançons sensibles en 8 jours mais n’affecte pas les insectes résistants (Figure 43). Un profil similaire est observé pour le soja et le haricot. Ces résultats permettent de supposer la présence d’homologues de PA1b dans ces 2 plantes. Pour M. truncatula, la mortalité des résistants comme des sensibles étant totale dès le quatrième jour, on ne peut conclure à la présence de tels homologues.

Définition de l’approche : à la découverte de la famille des A1b

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0 25 50 75 100

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

temps (jours)

mortalité cumulée (%)

pois soja haricot

M. truncatula souche S M. truncatula souche R

Figure 43 : Mortalités cumulées, au cours du temps, de la souche sensible S de S. oryzae sur les fractions MeOH 60 du pois, du soja, de M. truncatula et du haricot, et mortalité cumulée de la souche résistante R sur

cette même fraction pour M. truncatula.

Les TL50 montrent que la fraction MeOH60 de la luzerne méditerranéenne est la plus toxique devant celle du pois et enfin du soja et du haricot (Tableau 6).

(b) Toxicité des autres fractions sur S. oryzae

Les différences s’accentuent lorsqu’on considère les autres fractions (Tableau 6).

Tableau 6 : Toxicité des différentes fractions (testées à 100% EFE) vis-à-vis des deux souches de charançons sensible (S) et résistante (R). Temps létaux 50% ± erreur standard.

TL50

(jours) fractions

MeOH MeOH60 H2O5 H2O8 résidu

espèces

S R S R S R S R S R

Pisum sativum

>20 >20 4,5 ± 0,2

>20 5,7 ± 0,4

>20 5,0 ± 0,4

>20 5,4 ± 0,3

>20 Phaseolus

vulgaris >20 >20 6,3 ± 0,3

>20 >20 >20 8,8 ± 0,9

>20 10,6 ± 0,2

>20 Glycine

max

7,3 ± 0,9

>20 6,5 ± 0,9

>20 >20 >20 10,8

± 0,6

>20 8,0 ± 1,3

>20 Medicago

truncatula 3,9 ± 0,4

8,8 ± 0,6

3,5 ± 0,3

3,6 ± 0,2

4,5 ± 0,2

6,5±

0,3

4,7 ± 0,3

5,3 ± 0,2

4,3 ± 0,4

5,2 ± 0,2

L’analyse statistique (Breslow-Gehan-Wilcoxon) utilisée sur cette étude de survie de type actuarielle pour comparer les deux souches dans le cas de M. truncatula ne donne de différence significative (p-

value<0,0001) que pour les fractions MeOH et H2O5.

Pour la fraction MeOH du pois ainsi que du haricot, aucune toxicité n’est observée. Celle du soja présente un différentiel de mortalité total (toxicité sur S mais pas sur R) pouvant correspondre à la présence de peptides de type A1b. Pour M. truncatula cette fraction s’avère toxique aussi bien pour les sensibles que pour les résistants, avec toutefois un

retard de mortalité des résistants (TL50 significativement plus élevé). Ce retard pourrait être lié à la présence dans cette fraction d’homologues de PA1b, auxquels les charançons de souche résistante seraient insensibles, mais associés à d’autres composés toxiques qui finiraient par entraîner la mort des insectes.

La fraction H2O5 du pois entraîne un différentiel de toxicité total laissant supposer la présence d’isoformes de PA1b dans cette fraction. Il pourrait s’agir de peptides homologues différents de ceux de la fraction MeOH60 ou d’une contamination de ces derniers dans la fraction aqueuse, les extractions n’étant pas totales. Toutefois, pour le soja et le haricot, aucune toxicité n'est observée, laissant supposer que la contamination de fraction à fraction suivante est relativement faible. Enfin, pour M. truncatula, la fraction aqueuse acide est fortement toxique pour les charançons sensibles comme pour les résistants malgré un différentiel significatif.

La fraction H2O8 du pois est elle aussi toxique pour les charançons sensibles et inoffensive pour les résistants. Un même différentiel de toxicité est observé pour le soja et le haricot bien que les TL50 de ces deux fractions sont moindres que celui du pois (10,8 et 8,8 contre 5,0 respectivement). Une fois de plus, M. truncatula s’avère hautement toxique pour les deux souches d’insecte pour cette fraction.

La fraction résidu des 4 plantes tue les sensibles, et les résistants dans le cas de la luzerne.

Malgré un aspect physique de l’aliment plus friable et moins homogène, par rapport aux boulettes témoins (farine de blé seule) ou à celles contenant les autres fractions, les fractions résidus sont bien consommées par les insectes des deux souches. Dans le cas de la luzerne méditerranéenne, l'absence de différentiel significatif indique que la fraction résidu contient probablement un ou plusieurs composés toxiques non apparentés à PA1b.

Au contraire, les différentiels totaux de toxicité observés dans les résidus des trois autres espèces végétales témoignent certainement de la présence d'A1b dans ces fractions.

Il ne serait pas surprenant de trouver des homologues de PA1b dans différentes fractions.

En effet, les peptides A1b sont le produit d'une famille multigénique et, vu leur petite taille, le changement d'un nombre limité d'acides aminés peut suffire à modifier fortement leur hydrophobicité et/ou leur ionisation. Leur présence dans la fraction résidu, indiquant une insolubilité dans les solvants utilisés ici, peut paraître surprenante. Nishizawa et al (1995) ont montré, par immunocytochimie, que la leginsuline se localise autour de la membrane plasmique et des parois des cellules de graines de soja immatures. La liaison des A1b à des portions de membrane ou des polymères de parois cellulaires pourrait expliquer leur présence dans les fractions insolubles.

Au vu des fortes toxicités de toutes les fractions de M. truncatula, une purification un peu plus poussée à été réalisée. Les fractions MeOH et MeOH 60 pouvant contenir de nombreuses petites molécules toxiques (acides aminés non protéiques, phénols), ont été dialysées à travers une membrane de pores de 3,5 kDa. Les tests de toxicité ont été réalisés sur le dialysat mais aucune différence notoire n’a pu être observée avec la toxicité des fractions non dialysées.

L’étude de la toxicité des différentes fractions a donc permis de situer plus précisément la présence d'homologues de PA1b solubles (i.e. pour lesquels un différentiel de mortalité entre souche témoin sensible et souche résistante est observé) :

• dans les fractions MeOH 60, confirmant les résultats préalablement obtenus sur pois (purification de PA1b à partir de cette fraction)

Définition de l’approche : à la découverte de la famille des A1b

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• mais aussi, probablement, dans les fractions MeOH du soja et de M. truncatula, H2O5 du pois et de M. truncatula, et H2O8 du pois, soja et haricot.

Le cas de M. truncatula reste toutefois complexe, puisqu’aucun différentiel total (mort des S sans toxicité pour les R) de mortalité n’a été mise en évidence.

Pour confirmer la présence de peptides de type A1b dans ces fractions, une recherche des analogues immunologiques de ce peptide a été entreprise grâce à la technique de l’immunodétection.

3) Détection électrophorétique et immunologique d'homologues de