Systèmes eucaryotes

1) Les Levures

Les levures sont les premiers organismes eucaryotes à avoir été utilisés pour la production de protéines recombinantes d’origine eucaryote en recherche et en industrie. Ce sont des microorganismes unicellulaires dont la génétique est relativement simple. Les levures poussent rapidement à haute densité sur des milieux simples (Emr, 1990).

De la même manière que les autres organismes eucaryotes, la levure a l'avantage d’effectuer des modifications post-traductionnelles nécessaires au repliement correct de certaines protéines d’intérêt.

Deux types de vecteurs ont été développés pour les levures. Il s'agit des vecteurs intégratifs qui s’incorporent de façon stable dans le génome, et des vecteurs épisomiques qui sont des plasmides autonomes, extra-chromosomiques (Emr, 1990).

La levure possède la capacité de secréter naturellement un certain nombre de protéines, ceci facilite donc le processus de purification des protéines recombinantes. Il existe deux types de signaux pour les sécrétions : les préséquences (ex : invertase) et les préproséquences (ex : facteur α). Ces séquences sont clivées lors de l’exportation des protéines hors de la cellule. Il a été constaté que la sécrétion fonctionnait très bien pour des peptides mais était plus aléatoire avec des protéines de taille plus importante.

Les deux principaux types de levures utilisés sont la levure boulangère Saccharomyces cerevisiae et la levure méthylotrophe Pichia pastoris. Des protéines telles que l’insuline, des interférons ou des immunoglobulines (Wood et al., 1985) ont été exprimées dans la levure S. cerevisiae. Cependant de nombreuses protéines étaient hyperglycosylées dans cette levure (Brake, 1990) et en conséquence biologiquement inactives. Quant à la levure P. pastoris, elle possède une capacité de glycosylation inférieure à celle de S. cerevisiae.

Le système d’expression est basé sur le promoteur fort AOX1 (alcool oxydase), lui-même sous le contrôle d’un inducteur : le méthanol (Chen et al., 1996). De nombreux vecteurs

Expression hétérologue

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utilisant ce promoteur ont été développés et ont permis la surexpression de protéines (Muslin et al., 2000 ; Rodriguez et al., 2000).

Ce système semble donc adapté à l'expression de PA1b. Toutefois, des essais de production en système de sécrétion de PA1b recombinant par P. pastoris avaient été réalisés, dans l'unité BF2I, sans succès (Zhang, 2001, données non publiées) et les systèmes basés sur des levures n'ont donc pas été choisis pour notre étude.

Les problèmes inhérents à la sécrétion et à la glycosylation ont conduit au développement de systèmes d’expression chez les eucaryotes supérieurs.

2) cellules d'insectes

Depuis son développement dans les années 80, l’utilisation du système d’expression du baculovirus, virus infectant les insectes, pour la synthèse de protéines recombinantes dans les cellules d’insectes s’est largement répandu (Luckow and Summers, 1988 ; Murhammer, 1991). Les gènes étrangers sont insérés dans le génome viral par recombinaison sous le contrôle d’un promoteur fort. L’avantage majeur du vecteur du baculovirus est que son promoteur fort (polyhédrine) permet de produire des protéines recombinantes en grande quantité. De plus la manipulation génétique de ce système d’expression eucaryote est simple et rapide. Le baculovirus, comme le virus de la vaccine, a une très grande taille, ce qui permet le clonage de grands fragments d’ADN.

Concernant PA1b, ce système n'a pas été envisagé, le peptide étant toxique pour divers insectes et son mode d'action exact sur les cellules d'insecte inconnu (il entraîne l'apoptose des cellules du tube digestif des charançons sensibles (Vaublanc, 2001). Tout récemment, il a de plus été montré très toxique sur les cellules Sf9, qui sont les cellules les plus courantes d'expression hétérologue du système baculovirus (Gressent F., 2003, communication personnelle).

3) cellules de mammifères

Les cellules de mammifères sont généralement considérées comme le meilleur hôte pour l’expression de protéines eucaryotes nécessitant des modifications post-traductionnelles pour être actives. Deux types d’expression sont distinguées : l’expression transitoire et l’expression stable.

• L’expression transitoire est souvent utilisée pour détecter la fonction d’un gène nouvellement cloné. Elle est de courte durée (48-72 heures). L’ADN n’est pas intégré dans le génome, il se maintient dans le noyau pendant quelques jours avant de disparaître. Des cellules sont transfectées avec des plasmides, puis récoltées 48- 72 heures plus tard alors qu’elles sont encore en phase d’expression transitoire.

• Bien que les systèmes transitoires produisent suffisamment de protéines pour des études physico-chimiques, l’expression stable est préférée. Elle permet une production à plus grande échelle, même si les rendements restent limités par rapport à une expression dans les autres hôtes cellulaires. L’intégration de l’ADN dans le noyau peut se faire par transfection ou par infection par des virus rendus non pathogènes (SV40, adénovirus, virus d’Epstein Barr) ou rétrovirus (Kaufman, 1991). Ces virus sont rendus défectifs, les gènes essentiels à leur réplication ayant été supprimés. Ces virus infectent les cellules de mammifères et y intègrent leurs génomes.

Les principaux inconvénients de ces systèmes sont leur coût élevé, une fragilité des cellules, une capacité de production limitée (10 mg par litre), une possible protéolyse des produits d’expression. Ces systèmes sont donc destinés à la production de protéines à usage thérapeutique et à haute valeur ajoutée, comme l’activateur tissulaire du plasminogène (Pennica et al., 1983).

Une alternative aux problèmes rencontrés dans la surexpression des protéines recombinantes dans la levure ou les cellules animales est l’utilisation de la transgénèse animale ou végétale.

4) Transgénèse

(a) La transgénèse animale

Cette technique est devenue quasiment routinière en recherche fondamentale dans la mesure où elle permet d’aborder la fonction des gènes. En transgénèse animale, 90% des animaux transgéniques sont des souris. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour insérer le gène d’intérêt. La première consiste à microinjecter le gène dans les pronuclei d’embryons. Ceci est applicable à toutes les espèces animales, mais les coûts sont élevés (Hammer et al., 1985). La seconde consiste à obtenir des embryons in vitro à partir d’ovaires collectés dans des abattoirs, ce qui nécessite que la maturation des ovocytes, la fécondation, le transfert de gènes et le développement des embryons jusqu’au stade blastocyste soient effectués in vitro (Krimpenfort et al., 1991). Pour les souris, une troisième méthode a été mise en place basée sur la recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires totipotentes (cellules ES) et donc l’intégration du gène d’intérêt. Des vecteurs rétroviraux peuvent être utilisés pour introduire le gène d’intérêt dans des cellules embryonnaires de souris.

Il convient de choisir l’animal en fonction de la quantité de protéines à produire (de quelques centaines de milligrammes par an par souris à une tonne par an pour une vache).

Dans tous les cas, les coûts engendrés par ce type de production, le problème de la reproduction (temps, perte du gène d’intérêt par recombinaison génétique) et les contraintes liées à la manipulation des animaux génétiquement modifiés, limitent l’utilisation de ces systèmes à des protéines de haute valeur ajoutée.

(b) La transgénèse végétale

Les plantes possèdent un fort potentiel pour la production de protéines d’intérêt pharmaceutique. En effet, la culture de plantes est bon marché et une immense quantité de protéines peut être obtenue à partir d’un seul champ. De plus, la reproduction du matériel génétiquement modifié est plus rapide que pour les animaux, et le gène d’intérêt est préservé.

Du fait de la paroi cellulosique de la cellule végétale, l’introduction d’un gène dans le génome n’est pas évidente, plusieurs techniques existent :

• par des vecteurs bactériens ou viraux spécifiques des végétaux qui permettent d'introduire la construction génétique dans les cellules hôtes (Hayes et al., 1988),

• par un "canon à gènes" qui permet d'injecter, dans les cellules hôtes embryonnaires, la construction génétique préalablement déposée sur des microbilles d’or ou de tungstène (Klein et al., 1989),

Expression hétérologue

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• par électroporation de protoplastes (cellules végétales ne contenant plus qu’une membrane plasmique, la paroi cellulosique ayant été éliminée par des cellulases) (Shimamoto et al., 1989).

Après intégration du gène d’intérêt, les cellules végétales se multiplient sous forme de cals (amas indifférencié de cellules), puis regénèrent des jeunes pousses. Ces jeunes plantes sont stabilisées par rétrocroisement sexué (backcross) puis cultivées dans des serres ou champs de production. Une grande variété de protéines a été produite dans des végétaux tels que le tabac, le maïs, le riz, la pomme de terre (Morassutti et al., 2002 ; Sawahel, 2002 ; Sijmons et al., 1990). Cependant, il reste à améliorer les niveaux d’expression, d’extraction et de purification des protéines. A terme, les plantes pourraient représenter le moyen de production de protéines recombinantes le moins coûteux pour l’industrie.

La réalisation de riz transgénique exprimant PA1b est actuellement en cours au CIRAD de Montpellier (thèse de J. Petit, groupe de J.C. Breitler et E. Guiderdoni). L'objectif principal de cette expression hétérologue est d'estimer l'intérêt de PA1b pour la protection des céréales vis-à-vis des charançons des céréales, et non pas de produire et purifier le peptide ou d'éventuels variants. Ce travail constituera cependant le système de validation d’activité le plus proche de l’expression native¹⁷.