Substrats/allocrites

75

Conformationouverte Conformationfermée

Figure 21 : Rotation des TMs lors du passage de la conformation ouverte à la conformation fermée d’ABCB1.

Lors de ce passage, les acides aminés (représentés en rouge et vert) subissent des changements d’orientation défavorables pour l’interaction avec les substrats.

(Gutmann et al., 2009).

76

Hoechst33342

Actinomycine D

Colchicine

Figure 22 : Exemples de substrats d’ABCB1.

Les structures du Hoechst 33342, de l’actinomycine D et de la colchicine sont très différentes, de part leur taille et leurs substituants.

Parmi les substrats d’ABCB1, se trouvent de nombreuses molécules thérapeutiques, expliquant ainsi l’importance de ce transporteur dans les pathologies humaines. Le Tableau 5 présente les principaux substrats pharmacologiques d’ABCB1.

Antibiotiques Drogues

anticancéreuses Antifongiques Cardiovasculaire Immunosuppresseur

ActinomycineD Bisantrène Itraconazole Digoxine CyclosporineA

Erythromycine Daunorubicine Ketoconazole Diltiazem Dexamethasone

GramicidineD Diflomotecan Antihistaminiques Ouabain FK506

Rifampicine Docetaxel Certizidine Quinidine Hydrocortisone

Salinomycine Doxorubicine Fexofenadine Verapamil Prednisolone

Sparfloxacine Epirubicine Loratadine Divers Rapamycine

Valinomycine Etoposide Terfenadine Asimadoline Tacrolimus

Inhibiteursdes

protéasesduVIH Gefitinib Antihypertenseurs Cimetidine Triamconolone

Abacavir Imatinib Losartine Colchicine Statines

Amprenavir Irinotecan Talinolol Domperidine Atorvastatine

Aquinavir Mitoxantrone Chlorpromazine Eletriptan Cerivastatine

Darunavir Paclitaxel Clozapine Flesinoxan Lovastatine

Indinavir Romidepsine Fluphenazine Glabridine

Lopinavir Teniposide Olanzapine Ivermectine

Nelfinavir Tipifarnide Quetiapine Loperamide

Ritonavir Vinblastine Risperidone Ondansetron

Saquinavir Vincristin Quinacrine

Ranitidine

Topiramate

Tableau 5 : Principaux substrats médicamenteux d’ABCB1.

Liste non exhaustive adaptée de (Sissung et al., 2010).

6.6.2. Les caractéristiques des substrats

Ce sont généralement des molécules organiques, ayant un poids moléculaire compris entre 250 (cimétidine) et 1900 Da (Gramicidine D). ABCB1 transporte essentiellement des substrats hydrophobes mais lorsque l’hydrophobicité est très importante, les substrats peuvent se lier trop fortement à ABCB1 pour pouvoir être expulsés. Ils sont amphiphiles et possèdent fréquemment des cycles aromatiques. On peut également noter que la plupart des substrats

77 sont cationiques ou non chargés, bien que certains composés acides sembleraient être transportés (comme le méthotrexate) (Ueda et al., 1997). Il est cependant impossible de généraliser ces caractéristiques puisque des molécules identifiées comme substrats d’ABCB1 ne les partagent pas.

Seelig et collaborateurs, en 1998, suggèrent que la distance entre les groupes donneurs d’électrons est une caractéristique importante des substrats. Cette conclusion est basée sur l’analyse d’une centaine de composés connus pour interagir avec ABCB1. Elle a permis de mettre en évidence que les substrats possèdent tous 2 ou 3 groupements donneurs d’électrons distants de 2,5 à 4,6 Å (Seelig, 1998). Une étude tridimensionnelle, plus récente suggère que les molécules possédant 2 groupements accepteurs de liaisons hydrogènes séparés de 11,5 Å ainsi que 2 groupements donneurs de liaisons hydrogènes distantes de 16,5 Å seront des substrats d’ABCB1 (Cianchetta et al., 2005).

Ces 2 études montrent l’importance des liaisons hydrogènes dans la reconnaissance et la fixation des substrats sur ABCB1.

En 2002, Garrigues et collaborateurs ont défini 2 pharmacophores d’ABCB1 basés sur l’analyse d’une série de peptides cycliques contraints ou de molécules proches de ces peptides (Figure 23). La principale information ressortant de cette étude est que la reconnaissance des substrats ne dépend pas des substituants chimiques, contrairement à ce qui est classiquement observé pour une interaction ligand-récepteur. A la place, ABCB1 lie des molécules variées à différents sites en fonction de leur taille, de leur forme et de la distribution de leurs zones hydrophobes et polaires, rendant ainsi possible la reconnaissance de molécules avec des structures très variées (Garrigues et al., 2002).

78 Figure 23 : Modèle des 2 sites de reconnaissance des substrats d’ABCB1 représenté par 2

pharmacophores.

La cyclosporine A, l’actinomycine D et le vérapamil sont en vert, le tentoxine en blanc ; la vinblastine en rose, la bromocriptine en bleu et la pristinamycine en rouge.

(Garrigues et al., 2002).

La 2^ème information importante de cette étude est que les 2 pharmacophores sont très proches et se recouvrent partiellement. Les grosses molécules entrent en compétition avec les plus petites. De plus, 2 molécules peuvent se lier simultanément sur ABCB1 si l’une des 2 a une taille inférieure à 750 Da.

6.6.3. « MultiDrug Binding Pockets »

Deux hypothèses sont possibles pour les sites de fixation des substrats : la présence de plusieurs sites distincts spécifiques pour une ou plusieurs drogues, ou la présence d’une grande poche de fixation commune.

En 1997, l’utilisation de [¹²⁵I]iodoarylazidoprazosine met en évidence l’existence de 2 sites distincts de fixation allostérique pour la prazosine, un sur la partie N-terminale et un du côté C-terminal d’ABCB1. Ces 2 sites semblent intervenir à des phases différentes de transport (Dey et al., 1997). La même année, Martin et collaborateurs proposent qu’ABCB1 possède plusieurs sites de fixation des drogues, interagissant allostériquement. En effet, ils démontrent que le SR33557 module, de manière non compétitive, l’activité ATPasique stimulée par le vérapamil (Martin et al., 1997).

79 En se basant sur l’impact des substrats sur l’activité ATPasique d’ABCB1, Orlowski et ses collaborateurs ont également montré l’existence de sites de fixation distincts des substrats sur cette protéine (Orlowski et al, 1996 ; Garrigos et al, 1997 ; Pascaud et al, 1998).

Ensuite, Shapiro et collaborateurs démontrent qu’il existe au moins 3 sites de fixation distincts reconnaissant et fixant préférentiellement certains substrats. Ainsi, comme le présente la Figure 24, le site P reconnait préférentiellement la prazosine et la progestérone tandis que le site H lie le Hoechst 33342, la quercétine et la colchicine, alors que le site R fixe préférentiellement la rhodamine 123 et les anthracyclines (daunorubicine et doxorubicine) (Shapiro et al., 1999; Shapiro and Ling, 1997 ). Cette fixation sur un site plutôt que l’autre est réversée à haute concentration : à plus de 2 μM, le Hoechst 33342 se fixe également sur le site R, de même que la rhodamine 123 se lie au site H à cette même concentration.

H

R P

Hoechst33342 Quercetine

colchicine

Rhodamine123 daunorubicine

doxorubicine Prazosine Progestérone

Vérapamil

H

R P

Hoechst33342 Quercetine

colchicine

Rhodamine123 daunorubicine

doxorubicine Prazosine Progestérone

Vérapamil

Figure 24 : ABCB1 possède 3 sites de fixation pour les substrats (P, R et H).

Certains substrats se fixent préférentiellement sur le site H (tel que le Hoechst 333432) ou sur le site R (la rhodamine123 ou les anthracyclines).

Les 3 sites de fixation fonctionnent selon une coopérativité positive, c’est-à-dire que la fixation d’une drogue sur son site favorise le transport d’une autre drogue après fixation sur le 2^ème site. Plusieurs études avaient déjà fait référence à une coopérativité positive ou négative entre différentes drogues (Sharom et al., 1996; Spoelstra et al., 1994 ) corroborant la théorie de Shapiro et collaborateurs (Shapiro et al., 1999; Shapiro and Ling, 1997 ). Le fait que les drogues se fixant sur le site P sont peu ou pas transportées, suggère que ce site serait un site régulateur plus qu’un site de transport (Shapiro et al., 1999).

Cependant, en 1994, Pajeva et collaborateurs suggèrent que cette capacité d’adaptation est due à la présence d’une seule large poche de fixation des substrats (Pajeva et al., 1994). Cette poche contiendrait des « sous-chambres ». Les substrats se fixent avec une meilleure affinité

80 selon les résidus présents dans celles-ci. Cette hypothèse semble se confirmer par la résolution de la structure 3D cristallographique d’ABCB1 (Aller et al., 2009), mais ne remet nullement en cause les découvertes précédentes, notamment celle de Shapiro et collaborateurs. Cette large poche contient en effet des groupements hydrophiles donneurs ou accepteurs d’électrons, des acides aminés aromatiques et chargés qui créent des sous-sites où se fixent spécifiquement certains substrats (Eckford and Sharom, 2009). La reconnaissance des substrats se fait grâce à des interactions hydrophobes, des liaisons hydrogènes et des interactions électrostatiques.

La taille de cette large poche a été déterminée par modification chimiques de cystéines.

Ainsi, selon Loo et Clark, elle aurait une largeur de 9 à 25 Å en son milieu et pourrait atteindre 50 Å à la sortie du site (Loo and Clarke, 2001).

La position exacte des sites de fixation des drogues est difficile à définir. Loo et Clarke ont, par mutagenèse dirigé, étudiés de nombreux acides aminés qu’ils supposaient interagir avec la rhodamine ou encore le vérapamil (Figure 19). Différentes études semblent indiquer que le site R est formé par les TM 6, 9 et 12 tandis que le site H est créé par les résidus des TM 4, 6, 10, 11 et 12 (Gutmann et al., 2009). Il est cependant difficile de déterminer précisément le contour de ces sites. Même lorsque la mutation de certains résidus diminue la fixation des substrats, ceci peut être dû à un changement de conformation d’ABCB1 qui réduit l’accessibilité aux sites de fixation et non pas à une altération directe du site de fixation.