145
146 Le 2nd inhibiteur testé n’est pas non plus soluble en solution aqueuse ou saline. Le CT1364 est préparé dans une solution à 6% d’éthanol à une concentration finale de 30 mM. La solubilité n’est pas totale et un précipité se forme rapidement après préparation de la solution.
La suspension est injectée en IP 5 fois par semaine à la dose de 100 mg/Kg.
Nous utiliserons également un inhibiteur de référence, le géfitinib (AstraZeneca). Une solution aqueuse de concentration 15 mg/ml est administrée aux souris par gavage 3 fois par semaine.
L’agent anticancéreux utilisé est l’irinotécan (fourni par le Dr. Hamedi-Sangsari, MAP- France company) en solution aqueuse (6 mg/ml). Il est injecté aux souris en IP 3 fois par semaine.
3. Tests de toxicité aigüe
Le premier test est la validation de l’innocuité des solutés à tester, à la dose souhaitée in vivo. Huit groupes de 3 souris saines sont crées (Tableau 11).
Groupes composés
Groupe1 Irinotécanseul
Groupe2 Irinotécan+géfitinib Groupe3 Irinotécan+MBLI87doseA Groupe4 Irinotécan+MBLI87doseB Groupe5 Irinotécan+NANO Groupe6 Irinotécan+CT1364 doseA Groupe7 Irinotécan+CT1364 doseB Groupe8 Irinotécan+éthanol6%
Tableau 11 : Groupes de 3 souris pour le test de toxicité des composés.
Les composés sont injectés comme décrit précédemment.
4. Tests de chimioréversion
4.1. Les souris
Chaque groupe est composé de 6 souris, doublement xénogreffées en sous-cutanée dont 3 avec des cellules HEK-293 pcDNA3.1 (contrôle) et 3 avec des cellules HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482 (essai). Le Tableau 12 présente les 12 groupes de souris ainsi que leurs traitements.
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Souris Composésadministrés Voied’administration Doses/fréquence
Groupe1 Eau IP 100μl/3fois/semaine
Groupe2 Irinotecan IP 30mg/Kg(100μl)3fois/semaine
Groupe3 Géfitinib Gavage 75mg/Kg(100μl)3fois/semaine Groupe4 Irinotecan+géfitinib IP+gavage 30mg/Kg+75mg/Kg3fois/semaine
Groupe5 CT1364 IP 100mg/Kg(100μl)5fois/semaine
Groupe6 Ethanol6%(V/V) IP 100μl5fois/semaine
Groupe7 Irinotécan+CT1364 IP+IP 30mg/Kg 3fois/semaine+
100mg/Kg5fois/semaine Groupe8 Irinotécan+éthanol IP+IP 30mg/Kg 3fois/semaine+100μl
5fois/semaine
Groupe9 MBLI87 IP 42,4mg/Kg(300μl)5fois/semaine
Groupe10 NANO IP 300μl 5fois/semaine
Groupe11 Irinotécan+MBLI87 IP+IP 30mg/Kg 3fois/semaine+
2,4mg/Kg5fois/semaine Groupe12 Irinotécan+NANO IP+IP 30mg/Kg3fois/semaine+
300μl5fois/semaine
Tableau 12 : Groupes de souris établis pour le test in vivo de réversion du phénotype MDR.
Chaque souris est identifiée individuellement par un code couleur (rose, bleu ou jaune) et les souris xénogreffées avec des cellules exprimant ABCG2 ont été entaillées à une oreille.
Chaque souris est suivie afin de contrôler une éventuelle toxicité, au niveau de son poids, son comportement et l’état de son pelage.
4.2. Protocole
Le protocole a précédemment été établi par le Dr. Léa Payen. L’expérimentation a été réalisée avec 4 groupes de 3 souris auxquelles on injecte au niveau du péritoine des cellules HEK-293 pcDNA3.1 (2 groupes) ou HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482 (2 groupes). Trois souris de ces 2 groupes ont été traités avec de l’irinotécan et 2 groupes traités avec de l’eau.
Le protocole contient 2 phases dont une de 15 jours de traitements suivit d’une pause initialement de 7 jours augmentée ensuite à 15 jours du fait de la toxicité des produits.
L’expérimentation est stoppée par le sacrifice des souris ou après avoir répété le protocole 2 fois.
Le jour 0 correspond au jour d’inoculation des tumeurs. Le traitement est commencé le jour 1.
148 4.3. Implantation des tumeurs
Les cellules humaines greffées aux souris sont les mêmes que celles utilisées in vitro. Ce sont des HEK-293 pcDNA3.1 et des HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482, cultivées selon les conditions classiques (partie Matériels et méthodes II.2. Culture cellulaire). Le jour de l’inoculation, 8,2×106 cellules sont suspendues dans 100 μl de DMEM auquel est ajoutée une solution de Matrigel (50:50, v/v). Les cellules sont inoculées aux souris en sous-cutané. Deux tumeurs identiques sont implantées sur les flancs droit et gauche de chaque souris. Bien que cela introduise un biais dans l’expérimentation, il n’est pas préférable de greffer une tumeur exprimant ABCG2 et une autre ne l’exprimant pas à la même souris car la croissance des tumeurs sera différente selon le traitement. En effet, les tumeurs HEK-293 pcDNA3.1 traitées avec l’irinotécan ne se développent pas alors que les tumeurs exprimant ABCG2 ont une croissance plus rapide obligeant à sacrifier prématurément les souris.
4.4. Déroulement du test
L’expérimentation s’effectue sur les groupes de souris décrit précédemment et selon le protocole établi. Certaines souris ayant un poids plus faible au début du test, les volumes de solutions administrées sont ajustés afin d’administrer la même dose pondérale aux souris.
Les souris sont pesées 3 fois par semaine pour détecter une éventuelle perte de poids synonyme de toxicité. Le comportement et l’état du pelage sont observés 5 fois par semaine lors des traitements.
4.5. Sacrifice des souris
Les souris ont été sacrifiées par anesthésie kétamine/valium (8/2), du fait du volume de la tumeur. Conformément à la réglementation, elles sont sacrifiées si on observe soit une nécrose de la tumeur, une perte de poids supérieur à 20%, une gêne dans le déplacement de la souris du fait de la localisation de la tumeur. Dans tous les cas, les souris sont sacrifiées dès que la taille de la tumeur atteint 1800 mm3, calculé par la formule suivante volume = (4×3,14 (l + w)/2)3/3 où l est la longueur et w, la largeur de la tumeur. Les tumeurs sont prélevées et conservées à -80°C. L’expression d’ABCG2 dans celles-ci est contrôlée par western-blot comme décrit précédemment (partie Matériels et méthodes II.5 Analyse par immunodetection : le western-blot). Environ 1 ml de sang est collecté en intracardiaque dans des seringues héparinées et le plasma est collecté par centrifugation (5000×g, 5 min). Il est conservé à -80°C jusqu’à analyse des métabolites par HPLC.
149 5. Tests de pharmacocinétique
Ce test est effectué sur des souris SCID saines séparées en 10 groupes. Cinq groupes sont traités avec l’irinotécan uniquement (IP, 30 mg/Kg) (groupes 1 à 5), et 5 autres groupes sont traités par une double injection irinotécan (IP, 30 mg/Kg) + MBLI-87 (IP, 0,45 mg/Kg) (groupe 6 à 10). Chaque groupe est composé de 5 souris identifiées individuellement. Les souris sont sacrifiées à des temps différents : groupes 1 et 6 sacrifiés 30 min après injection, groupes 2 et 7 1 h après injection, groupes 3 et 8, 3 h après injection, groupes 4 et 9 6 h après injection et les groupes 5 et 10 sont sacrifiés 24 h après injection.
Le plasma est récupéré et conservé comme décrit précédemment. L’irinotécan et le SN-38 sont dosés comme décrit ci-après.
6. Dosage de l’irinotécan et du SN-38
6.1. Extraction in vitro
7,5.105 de cellules HEK-293 pcDNA3.1 ou HEK-293 pcDNA3.1 ABCG2 R482 sont ensemencées dans une plaque 6 puits et cultivées 24 h selon les conditions habituelles de culture. L’irinotécan est ajouté à une concentration de 2 μM pendant 60 min à 37°C, en présence ou en absence de 5 μM de GF120418, 5 μM de MBLI-87 ou 10 μM de fumitrémorgine C. Durant cette phase, l’irinotécan peut être métabolisé en SN-38. Après 2 lavages au PBS froid, les cellules sont collectées dans 1 ml de PBS froid, centrifugées (5 min, 1500×g) et lysées par 500 μl de méthanol pur. Vingt microlitres de camptothécine à 1 μg/μl (standard interne) sont ajoutés et les échantillons sont centrifugés 5 min à 12000×g à 10°C. Le surnageant est évaporé sous azote et les résidus sont suspendus dans 300 μl de phase mobile.
6.2. Extraction in vivo
Cinquante microlitres de plasma, 20 μl de standard interne (camptothécine à 1 μg/μl) et 300 μl d’acide formique (2%, v/v) sont mélangés vigoureusement pendant 10 s. Le mélange est appliqué sur colonne d’extraction SPE (Oasis© HLB 30 mg – Waters, Milford, USA). La colonne est lavée par 1 ml d’acide formique 2% : méthanol (80:20, v/v) et l’élution est réalisée par 1 ml de méthanol. L’éluât est évaporé sous azote et les résidus suspendus dans 300 μl de phase mobile.
150 6.3. Dosage par HPLC
Le dosage a été réalisé par le Pr Jérome Guitton.
Dix microlitres des solutions obtenus in vitro ou in vivo sont injectés. L’irinotécan et le SN-38 sont séparés sur une colonne Hypersil Gold 100 mm x 2.1 mm (ThermoFisher, San Jose, USA) par un gradient de phase mobile eau/acétonitrile (0,1% d’acide acétique). Le débit de cette phase mobile est de 200 μl/min. La détection est réalisée avec un spectromètre de masse triple quadripôle Quantum-Ultra (ThermoFisher). La quantification est réalisée en utilisant les transitions m/z 587124 (irinotécan), 393349 (SN-38) et 349305 (camptothécine). Une courbe de calibration permet de relier l’air du pic à la quantité de produit.