Análise Morfológica de Fungos Filamentosos

Amostra: Colónias de fungos filamentosos em cultura.

Objetivo: Permite observar o tipo de hifas (septadas ou não), o pigmento (hialinos ou demácios), bem como as estruturas reprodutoras dos fungos filamentosos, de modo a auxilixar na sua identificação.

Procedimento: Tocar com a fita-cola na periferia da colónia e colocar sobre uma lâmina que comtém uma gota de líquido de montagem (Azul de Lactofenol). De seguida cobrir com uma lamela e observar ao microscópio.

9.3. Exame Cultural

A cultura primária de produtos biológicos para o estudo microbiológico destina-se à recuperação de microrganismos para posterior identificação e eventual teste de suscetibilidade aos antimicrobianos, quando justificável e possível. Para tal, é necessário adequar os meios de cultura ao produto biológico a analisar assim como conhecer o tempo e as condições ideias de crescimento dos agentes patogénicos.

Existem meios de cultura de natureza sólida, semi-sólida e líquida. No laboratório, apenas são usados meios sólidos e líquidos. Os sólidos permitem a observação de colónias que se desenvolvem à superfície da gelose e auxiliam na sua identificação. Os meios líquidos são usados para o enriquecimento de produtos biológicos.

Os meios de cultura são escolhidos conforme o protocolo estabelecido pelo laboratório, podendo ser:

 Não seletivos: sem inibidores de crescimento e com nutrientes, permitem o crescimento da grande maioria dos microrganismos encontrados em produtos biológicos.

 Seletivos: contêm uma mistura de antimicrobianos ou substâncias químicas que permitem o crescimento de alguns microrganismos em detrimento de outros, cujo crescimento é inibido.

 Diferenciais: com substâncias químicas ou corantes, que permitem distinguir grupos de microrganismos presentes no mesmo inóculo.

 De enriquecimento: com nutrientes, permitem a multiplicação de microrganismos de interesse que se encontram no produto biológico em baixo inóculo.

 De transporte: mantêm a viabilidade dos microrganismos até 24h, geralmente, inibindo a sua multiplicação e a sua escolha depende do produto biológico (meio

Amies, Cary-Blair, Portagerm Amies Agar).

 De identificação: evidenciam características bioquímicas de determinadas espécies, permitindo o seu reconhecimento e identificação.

No laboratório estão à disposição os seguintes meios (Tabela 14):

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]).

Meio de Cultura Princípio Classificação

BHI (Caldo Cérebro e

Coração, do inglês Brain

Heart Infusion)

Meio de enriquecimento composto por uma base

nutritiva de coração e cérebro. _{Meio líquido de}

enriquecimento não seletivo

Selenito

Utilizado para coprocultura. A seletividade do meio baseia-se na presença de selenito, que inibe a maioria das Enterobacteriaceae, incluindo algumas estirpes de Shigella spp e bactérias Gram positivo. A subcultura para meios sólidos deve ocorrer entre 6-12h (prazo médio de inibição de outras estirpes, tal como o Proteus spp.)

Meio líquido de enriquecimento seletivo para Salmonella spp. COS (Gelose de Columbia +5% de Sangue de Carneiro)

Meio nutritivo, rico, complementado com sangue desfibrinado de carneiro que permite observar a presença ou não de hemólise e o tipo de hemólise (critério básico para orientação da identificação de algumas bactérias, como os Streptococcus spp. e

Staphylococcus spp.). Também é adequada para o

isolamento de microrganismos anaeróbios.

Meio sólido não seletivo

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.

CNA (Gelose COS com ácido nalidíxico e

colistina)

Meio rico que contém uma mistura de peptonas adaptado à cultura de microrganismos exigentes (Streptococcus spp., Listeria spp.). A mistura de antimicrobianos inibe o crescimento da grande maioria das bactérias Gram negativo e dos

Bacillus. Meio sólido seletivo para Gram positivo PVX (Gelose Chocolate PolyViteX)

A Gelose de Chocolate é obtida a partir da Gelose Columbia ao qual foi adicionado sangue de carneiro aquecido a 80ºC (hemólise dos eritrócitos), sendo rica em fatores X (hemina) e V (NAD) fornecidos pela hemoglobina. É ainda adicionado o PolyViteX, que fornece ao meio vitaminas, aminoácidos, co-enzimas, glucose e outros fatores que melhoram o crescimento de estripes fastidiosas como Neisseria spp.,

Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae.

Meio sólido não seletivo

HAE2 (Gelose Chocolate

Heamophilus 2)

Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma mistura de antimicrobianos que permitem inibir a maioria das bactérias Gram positivo e das leveduras. Meio sólido seletivo para Haemophilus spp. VCA3 (Gelose Chocolate VCAT)

Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma mistura de antimicrobianos (Vancomicina, Colistina, Anfotericina B, Trimetoprim) que permitem inibir a maioria das bactérias e leveduras.

Meio sólido seletivo para Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.

HEK (Gelose Hektoen)

O meio permite evidenciar colónias que fermentam 1 dos 3 açúcares contidos no meio (lactose, sacarose, salicina) formando colónias amarelas ou amarelas-salmão; os restantes produzem colónias verdes ou verdes-azuladas. Os microrganismos que reduzem o tiossulfato de sódio produzem sulfureto de hidrogénio (H2S) formam colónias com centro

negro. As colónias de Salmonella são verdes ou verdes-azuladas, com ou sem centro negro. As colónias de Shigella são verdes ou verdes-azuladas sem centro negro. A presença de sais biliares inibe o crescimento das bactérias Gram positivo e

retardam o crescimento de algumas

Enterobacteriaceae. Meio sólido seletivo e diferencial para a Salmonella spp. e Shigella spp. CAM (Gelose Campylosel)

A presença de sangue de carneiro facilita o crescimento da espécie pesquisada. A fertilidade é aumentada devido à utilização de redutores. A seletividade é assegurada pela presença de antimicrobianos no meio que inibem a maior parte das bactérias e fungos. As colónias características de Campylobacter são pequenas e acinzentadas.

Meio sólido seletivo para Campylobacter spp. YER (Gelose Yersinia)

Meio destinado à deteção e diferenciação das diferentes espécies de Yersinia spp. O manitol e o vermelho neutro presente no meio, permitem a sua diferenciação pela coloração das colónias rosa- escuro a vermelhas. A presença de colato, desoxicolato, cristal violeta, Irgasan e de antimicrobianos inibe o desenvolvimento das bactérias Gram positivo e da maioria das Gram negativo.

Meio sólido seletivo

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação. CLED (Gelose Cistina, Lactose, Deficiente em Eletrólitos)

O meio permite diferenciar os microrganismos que fermentam a lactose dos que não fermentam, recorrendo ao indicador azul de bromotimol. As bactérias fermentadoras da lactose originam colónias amarelas por acidificação do meio, enquanto que as não fermentadoras originam colónias verdes, azuis ou incolores. A baixa concentração de eletrólitos impede o swarming do

Proteus.

Meio sólido não seletivo e diferencial

MCK (Gelose MacConkey)

A presença de lactose no meio permite evidenciar as bactérias fermentadoras pela viragem do indicador de pH, originando colónias rosa ou vermelhas. As que não fermentam originam colónias incolores. A seletividade é proporcionada pelos ácidos biliares e cristal violeta, que impedem o crescimento de bactérias Gram positivo.

Meio sólido seletivo para Gram negativo e diferencial STRB (Gelose chromIDTM Strepto B)

Este meio contém base nutritiva que associa diferentes peptonas e 3 substratos cromogénicos. As colónias sugestivas de S. agalactiae

apresentam-se rosa claro a vermelho, redondas e em forma de pérola. A maioria das outras espécies bacterianas e leveduras não se desenvolvem neste meio ou não formam colónias características.

Meio sólido cromogénico e diferencial para Streptococcus agalactiae (Grupo B) SGC2 (Gelose Sabouraud com Cloranfenicol 2)

A acidificação do meio e a presença de peptonas e dextrose favorecem o desenvolvimento de fungos e leveduras. A presença de gentamicina e cloranfenicol inibem o crescimento bacteriano.

Meio sólido seletivo para

leveduras e fungos

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.

CAN2 (Gelose chromIDTM

Candida)

Meio cromogénico para isolamento seletivo de fungos leveduriformes e identificação de espécies de Candida albicans, que apresentam uma coloração azul pela hidrólise de um substrato cromogéneo de hexosaminidase. Também permite a diferenciação presuntiva de um conjunto de espécies que agrupa C. tropicalis, C. lusitaniae e C.

kefyr, que hidrolisam um segundo substrato,

apresentando colónias com uma coloração rosa. Assim, permite diferenciar as culturas mistas e orientar a identificação para outras espécies. A mistura de inibidor permite inibir o crescimento da maior parte das bactérias.

Meio sólido cromogénico

Meio Müller Hinton

Possui uma substancial fonte de proteínas e carboidratos que proporcionam o crescimento bacteriano, e uma baixa concentração de timina e timidina e níveis adequados de cálcio e magnésio.

Meio recomendado para

TSA pelo método de Kirby-Bauer,

segundo a EUCAST.