7. Valência de Bioquímica
7.1. Bioquímica Clínica
A área da Bioquímica Clínica é uma área multidisciplinar, que tem por objetivo determinar os parâmetros bioquímicos, permitindo a sua utilização no diagnóstico, prognóstico, tratamento e monitorização da doença.
Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Dr. José de Almeida, Cascais Responsáveis da secção:
Dr. Luis Santos (Patologista Clínico) Dra. Stela Lopes (Patologista Clínico)
Dra. Joana Domingues (Técnica Superior de Saúde)
Período de Estágio: 09/01/2017 - 10/03/2017
Volume de trabalho: Em média cerca de 6900 pedidos/mês (estatística feita com base no número de pedidos ionograma/mês)
Atividades realizadas na seção no referendo período:
Colheitas de produtos biológicos no internamento e consulta externa; Receção de produtos e avaliação da sua conformidade;
Manutenção dos equipamentos;
Execução e avaliação CQI e das amostras da AEQ; Processamento de amostras;
Validação técnica de resultados; Gestão de stocks.
Equipamento em funcionamento na secção:
Equipamento: Dimension® EXLTM with LM, da Siemens
O Dimension® EXLTM possui um sistema automatizado que permite a determinação dos parâmetros bioquímicos em amostras de soro, plasma, urina e líquidos orgânicos, nomeadamente, líquido cefalorraquidiano (LCR).
Os produtos que se destinam a determinações bioquímicas neste equipamento são centrifugados a 3500rpm, 10 minutos. As urinas não precisam de nenhum tratamento específico a não ser que se apresentem muito turvas ou com uma consistência viscosa, e neste caso também têm de ser centrifugadas, a fim de prevenir o entupimento das agulhas do equipamento.
Quanto aos líquidos orgânicos, sempre que haja pedido de citoquímico1, primeiro tem
de se avaliar a cor e o aspeto do líquido e posteriormente centrifugar para ser processado no equipamento. Quando é pedido a densidade e o pH esta determinação é efetuada recorrendo a tiras de teste de análise de urina tipo II.
Diversos parâmetros bioquímicos são doseados no Dimension® EXLTM with LM (Figura 3) com o objetivo de auxiliar o médico no diagnóstico e prognóstico de determinada patologia ou condição clínica.
1 Geralmente, o pedido do citoquímico vem sempre acompanhado do exame citológico (líquido colhido em tubo contendo
como anticoagulante o EDTA), em que após a contagem de células pelo analisar automático, proceder-se à montagem da câmara de Nageotte para contagem dos leucócitos, com contagem diferencial entre células polimorfonucleares e mononucleares, assim como efetuar uma avaliação semi-quantitativa dos eritrócitos.
7.1.1. Avaliação do Ionograma
A função dos eletrólitos no corpo humano é múltipla, sendo que quase todos os processos metabólicos são dependentes dos eletrólitos ou afetados por eles. O aporte destes eletrólitos no organismo é feito através da dieta [5].
Os iões de cloretos (Cl-) e sódio (Na+) são os principais iões extracelulares, sendo responsáveis pela osmolalidade do plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da distribuição da água e da pressão osmótica no compartimento líquido extracelular [5]. A hiponatrémia leva a convulsões, letargia, desorientação, edema pulmonar, cefaleias, coma ou até mesmo à morte. A hipernatrémia pode levar à agitação, espasmos musculares, letargia e irritação [6].
Os iões de potássio (K+) são os principais catiões intracelulares, sendo responsáveis por manter o equilíbrio da água, em conjunto com o sódio, regular processos metabólicos e excitabilidade muscular. A hipocaliémia leva a fraqueza muscular, diminuição dos reflexos e arritmias cardíacas. A hipercaliémia pode levar a confusão mental, fraqueza, dormência, formigueiro nas extremidades, fraqueza muscular e paragem cardíaca [5].
Diferentes causas podem estar na origem das alterações hidro-eletrolíticas, sendo que algumas delas encontram-se apresentadas na Tabela 2.
Amostra: Soro, plasma heparinizado2 ou urina [7]. Método: Potenciometria.
Existem 3 elétrodos incorporados no Multisensor Integrado QuikLYTE® que são seletivos para os iões de sódio, potássio e cloro, para além do elétrodo de referência. Depois de uma amostra ser posicionada no sensor, os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície do elétrodo. É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da atividade da substância a analisar na amostra, que é comparado com o potencial gerado numa solução padrão. A concentração dos iões é calculada com recurso à Equação de Nernst [7].
2Heparina é um anticoagulante. Ativa (co-fator) a antitrombina III que exerce ação anticoagulante, principalmente pela inibição
Intervalo de Medição Analítica: Soro:Na+: 50-200mmol/L, K+: 1.0-10.0mmol/L, Cl-: 50-200mmol/L; Urina: Na+: 5-300mmol/24H, K+: 1.0-300mmol/24H, Cl-: 10-330mmol/24H[7]
Valores de Referência: Soro: Na+: 136-145mmol/L, K+: 3.5 -5.1mmol/L, Cl-: 98- 107mmol/L; Urina: Na+: 40-220mmol/24H; K+: 25-125mmol/24H, Cl-: 110-250mmol/24H
Tabela 2. Causa do aumento e da diminuição dos eletrólitos no soro (Adaptado de [5]).
Eletrólitos Aumento Diminuição
Sódio
Desidratação
Níveis diminuídos de ADH
Produção excessiva de mineralocorticóides Infusão intravenosa de Na+
Ingestão excessiva de sal sem entrada de água Insuficiência renal Hiperaldosteronismo Queimaduras Diurese osmótica Ingestão diminuída Perdas gastrointestinais Sudação excessiva Insuficiência de mineralocorticóides Hipoaldosteronismo Acetoacidose diabética Acidose tubular renal Insuficiência cardíaca Insuficiência renal Hipoalbunimémia
Níveis aumentados de ADH Administração excessiva de água
Potássio Infusão intravenosas de K+ Desidratação Rabdomiólise Queimaduras graves Insuficiência renal Hemorragias Acidose metabólica Défice de mineralocorticóides Diuréticos Ingestão diminuída Perdas gastrointestinais Perdas renais Alcalose metabólica Incorporação celular Doença hepática Insuficiência cardíaca Queimaduras Diurese osmótica Cloro Desidratação
Insuficiência renal aguda Acidose metabólica Diabetes insipidus
Nefropatia
Perdas intestinais de bicarbonato Insuficiência adrenal
Alcalose metabólica
7.1.2. Avaliação do Metabolismo do Ferro
O ferro é um elemento fundamental e vital para o bom funcionamento do organismo. O tecido com maior necessidade de aporte em ferro é a medula óssea para a síntese de hemoglobina, sendo este aporte garantido pela dieta [8]. O ferro que não é utilizado é armazenado nas formas de ferritina e hemossiderina [9]. Porém, capacidade de armazenamento é limitada e em excesso torna se tóxico para o organismo [8].
A transferrina é fundamental para o transporte do ferro para os locais de armazenamento (células do sistema reticuloendotelial do fígado, baço e medula óssea) e para as células que sintetizam compostos contendo ferro, tais como hemoglobina, mioglobina e citocromo. Esta glicoproteína é produzida no fígado, sendo os seus níveis plasmáticos influenciados pela disponibilidade de ferro.A carência de ferro leva a um aumento da sua síntese [10].
Os níveis de ferritina circulante refletem com exatidão os níveis de ferro que se encontram armazenados no organismo e são úteis em situações de suspeita de deficiência ou sobrecarga de ferro [9]. É um indicador precoce, manifestando alterações antes da diminuição
dos níveis séricos de ferro e do aparecimento de anomalias morfológicas nos eritrócitos [11]. Existe um forte mecanismo homeostáticos, no entanto podem surgir distúrbios do metabolismo do ferro que levam a situações patológicas, das quais de destacam a anemia ferropénica, anemia da doença crónica [12], hemossiderose, hemocromatose, anemia sideroblástica [11], anemia hemolítica e necrose hepática aguda (por libertação aumentada do ferro armazenado) [13].
Na anemia ferropénica verifica-se uma diminuição dos níveis plasmáticos de ferro resultante da depleção das reservas, podendo ser consequência de deficiências nutricionais, perdas sanguíneas ou problemas de absorção [12].
Frequentemente, as doenças infeciosas, inflamatórias, traumáticas, neoplásicas ou com comprometimento hepático, são acompanhadas por uma anemia leve a moderada, com diminuição dos níveis plasmáticos de ferro e níveis normais ou ligeiramente aumentados de ferritina, denominada de anemia de doença crónica, causada pela resposta de fase aguda associada à inflamação crónica [12].
Ferritina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [14]. Método: Imunoensaio enzimático.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a ferritina (FERR) e com um conjugado (β-galactosidase marcada com anticorpo monoclonal específico para um segundo local de ligação na ferritina). O que não se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com um substrato cromogénico, o vermelho de clorofenol-β-D-galactopiranosido (CPRG, do inglês chlorophenol red-β-D-
galactopyranoside). A hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o vermelho de clorofenol
(CPR, do inglês chlorophenol red). A concentração de ferritina é diretamente proporcional à taxa de variação de cor devido à formação de CPR medida a 577/700nm [14].
Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000ng/mL [14]
Valores de Referência: Mulher: 8 – 252ng/mL [µg/L]; Homem: 26 – 388ng/mL [µg/L]; Combinadas: 8 – 388ng/mL [µg/L]
Ferro
Método: Adaptação do método desenvolvido por Smith et al. utilizando o cromóforo Ferene®3, que possui uma elevada sensibilidade para a determinação do ferro. A potencial interferência do cobre é minimizada pela adição de tioureia.
Em condições ácidas, o ferro férrico (Fe3+) ligado à transferrina é libertado. Na presença do agente redutor, ácido ascórbico, o Fe3+ é reduzido para ferro ferroso (Fe2+). O Fe2+ forma um complexo azul com o sal dissódico do àcido 5,5’(3-(2-piridil)-1,2,4-triazina-5,6-diil)-bis-2- furano-sulfónico (Ferene®). A absorvência do complexo é medida por uma técnica bicromática de ponto final (600, 700nm) sendo diretamente proporcional à concentração do ferro presente na amostra [13].
Intervalo de Medição Analítica: 5 – 1000µg/dL [0.9 – 179.0µmol/L] [13]
Valores de Referência: Homens: 65 – 175µg/dL [11.6 – 31.3µmol/L]; Mulheres: 50 – 170µg/dL [9.0 – 30.4µmol/L]
Transferrina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [15]. Método: Turbidimétrico.
A transferrina liga-se a anticorpo policlonal levando à formação de imunocomplexos. A adição de polietilenoglicol (PEG) que acelera a sua formação. O aumento da turvação é proporcional à concentração de transferrina, medida através de uma técnica bicromática de ponto final (340, 700nm) [15].
Intervalo de Medição Analítica: 40 – 750mg/dL [0.40 – 7.50g/L] [15] Valores de Referência: 202 – 364mg/dL [2.02 – 3.64g/L]
7.1.3. Avaliação da Função Cardíaca
O enfarte agudo do miocárdio (EAM) é uma das principais causas de morte e de incapacidade em todo o mundo, sendo a sua deteção precoce crucial. A nível laboratorial define- se com a subida e/ou descida do biomarcador cardíaco (de preferência troponina, ou como alternativa a isoenzima MB da creatina cinase - CKMB), pelo menos um valor acima do percentil 99 do Limite Superior de Referência [16].
No entanto, existem outros marcadores bioquímicos cardíacos e o conhecimento da sua cinética tem grande importância não só para auxiliar no diagnóstico, como na estratificação do risco, prognóstico, monitorização do doente, mostrando a extensão e comprometimento cardíaco.
A mioglobina é uma proteína heme encontrada no músculo cardíaco e esquelético sendo libertada para a circulação quando ocorre lesão celular. Na ausência de traumatismos do músculo esquelético ou de outros fatores que levam a um aumento de mioglobina circulante de origem não cardiaca, a sua determinação é utilizada como um marcador precoce de EAM (Tabela 3) [17].
A CKMB encontra-se essencialmente ao nível do músculo cardíaco e em concentrações substancialmente mais baixas no músculo esquelético. Esta isoenzima para além de ser um biomarcador de eleição para o perioperatório de EAM nas primeiras 48h, a sua determinação também tem sido utilizada para avaliar a extensão do enfarte e reenfartes subsequentes, apresentando uma boa sensibilidade, especificidade e eficiência para o diagnóstico (Tabela 3)
O complexo da troponina é constituído por três componentes polipeptídicos distintos: a troponina C, troponina I e a troponina T, que desempenham um papel essencial na contração do musculo estriado. O doseamento da troponina I pode ser utilizada como auxiliar no diagnóstico de EAM e na estratificação de risco em doentes com síndrome coronário agudo relativamente ao risco relativo de mortalidade. Também está aumentada em traumatismos no peito, cirurgia, insuficiência cardíaca congestiva (ICC), insuficiência renal, toxicidade cardíaca provocada por fármacos, miocardite, embolismo pulmonar, doenças infiltrativas e doenças neurológicas agudas. Este biomarcador é mais específico do que a CKMB para a deteção de lesões do miocárdio na presença de lesões do músculo esquelético (Tabela 3) [19].
Os péptidos natriuréticos cerebrais (BNP, do inglês Brain natriuretic peptide) têm propriedades natriuréticas, diuréticas e também são eficazes no controlo do funcionamento do sistema cardiovascular. O proBNP é segregado principalmente ao nível do ventrículo esquerdo, que posteriormente se dissocia em BNP (fisiologicamente ativo), e no fragmento N-terminal proBNP (NT-proBNP), que pode ser utilizado para fins de diagnóstico, prognóstico e estratificação do risco em doentes com síndromes coronários agudos e insuficiência cardíaca. A determinação do NT-proBNP ajuda a identificar indivíduos com disfunção no ventrículo esquerdo, que pode ocorrer devido a uma doença coronária, hipertensão arterial, doença valvular e doença primária do miocárdio, insuficiência cardíaca crónica. Nestes casos, ambas as concentrações de BNP e NT-proBNP aumentam. Também se verifica um aumento dos níveis de NT-proBNP em doentes com angina instável e após EAM [20].
Tabela 3. Marcadores bioquímicos após situação de EAM sem complicações (Adaptado de [17-19]).
EAM: enfarte agudo do miocárdio; CKMB: isoenzima MB da creatina cinase. Marcadores
Bioquímicos
Aumento após a
EAM Pico
Regresso aos Valores Basais
Mioglobina 1-3h 6-12h 24-36h
CKMB 4-8h 12-24h 48h
Mioglobina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [17]. Método: Imunoensaio enzimático.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a mioglobina (MYO), formando um complexo partícula/MYO. O que não se ligou é removido. Posteriormente, o complexo é incubado com o conjugado (anticorpos monoclonais específicos para a MYO marcados com β-galactosidase). O que não se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico CPRG. A hidrólise do substrato liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de MYO presente na amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação do CPR, medida a 577nm [17].
Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000 ng/mL [µg/L] [17]
Valores de Referência: Homem 16 – 96 ng/mL [µg/L]; Mulher 9 – 82 ng/mL [µg/L]
Isoenzima MB da Creatina Cinase
Amostra: Soro, plasma EDTA4 (ácido etilenodiaminotetracético) ou heparinizado [18]. Método: Imunoensaio enzimático.
4Anticoagulante EDTA K3 é um quelante de cálcio ionizado (Ca2+). O facto de deixar de haver cálcio disponível para a cascata
da coagulação, leva a que o sangue não coagule. Assegura a conservação das células até 24h após a colheita, a 4ºC, e a sua morfologia até 2h após a colheita.
A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a subunidade CKMB e um conjugado (anticorpos monoclonais específicos para a isoenzima CKMB marcados com β-galactosidase). O que não se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico CPRG. A hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de CKMB presente na amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação do CPR, medido a 577nm [18].
Intervalo de Medição Analítica: 0.5 – 300ng/mL [µg/L] [18]
Valores de Referência: 0.00 – 3.6ng/mL
Troponina I Cardíaca
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [19].
Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®5.
Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti- troponina I e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads que contém esferas revestidas com estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas revestidas com um anticorpo monoclonal anti-troponina I e um corante quimioluminescente. A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo biotinilado formando uma uma
sandwich esfera/troponina I/anticorpo biotinilado. Posteriormente, o reagente Sensibeads é
adicionado e liga-se à biotina formando imunocomplexos. A iluminação do complexo a 680nm produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para o
reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração da troponina I presente na amostra [19].
Intervalo de Medição Analítica: 0.017 – 40ng/mL [µg/L] [19] Valores de Referência: 0.000 – 0,056ng/mL [µg/L]
N-terminal pro-péptido natriurético cerebral
Amostra: Soro ou plasma EDTA ou heparinizado [20].
Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®.
Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti- NT-proBNP e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads contém esferas revestidas com estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas revestidas com um anticorpo específico para um segundo epítopo no NT-proBNP e um corante quimioluminescente. A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo biotinilado para formar uma sandwich esfera/NTP/anticorpo biotinilado. O Sensibeads é adicionado e liga-se à biotina para formar imunocomplexos. A iluminação do complexo a 680nm produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para o reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração de NT-proBNP na amostra
[20].
Intervalo de Medição Analítica: 5 – 35000pg/mL [20] Valores de Referência: 0 – 125pg/mL
7.1.4. Avaliação da Função Renal
O rim é responsável pela formação de urina, regulação do equilíbrio hidro-eletrolítico e ácido-base, excreção de produtos do metabolismo, assim como também é responsável pela produção de hormonas e de vitamina D [21].
A ureia, creatinina e o ácido úrico são compostos azotados não proteicos e são considerados marcadores endógenos mais frequentemente utilizados na avaliação da função renal ena discriminação entre alterações pré-renal, pós-renal ou renais [22].
A ureia, por vezes referida como BUN (Blood Urea Nitrogen), constitui o principal produto do catabolismo oxidativo proteico, responsável pela excreção de mais de 75% do azoto não proteico. No figado, as proteínas são degradadas a aminoácidos que sofrem reação de desaminação, formando amónia, que é rapidamente convertida a ureia (ciclo da ureia), para evitar a toxicidade, sendo posteriormente transportada no sangue até aos rins onde é filtrada livremente pelo glomérulo. Em condições normais, 40 a 50% é reabsorvida ao nível do túbulo proximal [22].
Uma ampla variedade de doenças renais e fatores não-renais podem levar ao aumento dos níveis de ureia em circulação, limitando a sua utilização como indicador da função renal. A sua concentração no sangue é condicionada pela função e perfusão sanguínea renal, fluxo urinário, distúrbios pós-renais, assim como pelo teor proteico da dieta, catabolismo proteico, hemorragia gastro-intestinal, estado de hidratação, jejum prolongado e lesão hepática grave [22]. A creatinina, marcador clássico do volume de filtração glomerular, resulta da degradação não enzimática da creatina no músculo. A quantidade de creatinina endógena produzida é proporcional à massa muscular, por isso varia em função da idade e do sexo, não sofrendo grandes alterações com a dieta. A sua taxa de excreção, na ausência de doença renal ou pós-renal, é relativamente constante, correlacionando-se com a produção endógena. É filtrada pelo glomerulo e praticamente não é reabsorvida pelos túbulos renais, contudo, a sua concentração também depende da secreção tubular proximal (7- 10%) [22]. A nível sérico, a concentração de creatinina só se altera quando a função renal apresenta uma redução de pelo menos 30% do volume de filtração glomerular [23], sendo por isso considerado um parâmetro mais estável e especifico do que a ureia na avaliação da função renal [24].
O ácido úrico é sintetizado no fígado, e constitui o produto final do metabolismo das purinas, e a excreção é feita ao nível dos rins, sendo excretada apenas 6-12% da quantidade filtrada. Em líquidos corporais supersaturados, o urato monossódico precipita e deposita-se nas articulações e tecidos, sendo responsável pelo aparecimento de sinais e sintomas clínicos. A deposição de cristais de urato pode levar ao aparecimento de artrite gotosa, nefrolitíase, deposição intratubular aguda de cristais de urato ou nefropatia gotosa [22].
A hiperuricémia pode ser atribuída a defeitos enzimáticos específicos na via do metabolismo das purinas (embora seja raro), doença renal, síndrome mieloproliferativo e terapêuticas citotóxicas. A hipouricémia, pode ser secundária a doença hepatocelular grave, defeitos na reabsorção tubular renal e tratamento para a hiperuricémia [22].
Ureia
Amostra: Soro, plasma ou urina [25]. Método: Enzimático.
A urease hidrolisa a ureia com formação de amónia e dióxido de carbono. A amónia é utilizada pela enzima glutamato desidrogenase (GLDH) para aminar por redução o α- cetoglutarato (α-KG), com oxidação simultânea da forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). A redução da absorvência, pelo desaparecimento da NADH, é diretamente proporcional à concentração de ureia na amostra, medida utilizando uma técnica cinética bicromática (340, 383nm) [25].
Intervalo de Medição Analítica: 0 – 150mg/mL [0 – 53.5mmol/L] [25]
Valores de Referência: Soro: 7 – 18mg/dL [2.5 – 6.4mmol/L]; Urina: 7 – 20g/24h [249 – 714mmol/24h]
Creatinina
Amostra: Soro ou plasma heparinizado [24]. Método: Técnica cinética de Jaffé modificada.
Na presença de NaOH, o picrato reage com a creatinina para formar um cromóforo vermelho. O aumento da absorvência, causada pela formação deste cromóforo, é diretamente proporcional à concentração de creatinina na amostra, medida utilizando uma técnica cinética bicromática (510, 600nm). A bilirrubina é oxidada pelo ferricianeto de potássio para evitar interferências [24].
Intervalo de Medição Analítica: Soro ou plasma: 0.15 – 20.00mg/dL [13 – 1768µmol/L]; Urina: 5.00 – 400.00mg/dL [442 – 35360µmol/L] [24]
Valores de Referência: Soro ou plasma: Homens: 0.70 – 1.30mg/dL [62 – 115µmol/L]; Mulheres: 0.55 – 1.02mg/dL [49 – 90µmol/L]; Urina: Homens: 0.95 – 2.49g/24h [8.4 – 22.0mmol/24h]; Mulheres: 0.60 – 1.80g/24h [5.3 – 15.9mmol/24h]
Ácido Úrico
Amostra: Soro, plasma ou urina [26]. Método: Método da uricase modificado.
O ácido úrico que absorve a 293nm é convertido pela uricase em alantoína, que não absorve neste comprimento de onda. A diminuição da absorvência é diretamente proporcional à concentração de ácido úrico presente na amostra, medida utilizando uma técnica bicromática