Prova da Coagulase

As infeções mais comuns causadas por Staphylococcus aureus são cutâneas, no entanto também pode ser responsável por infeções severas (septicémias, endocardites, meningites, pneumonias, osteomielites) em meio hospitalar.

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Staphylococcus spp., 18-24h de incubação.

Objetivo: Diferenciar Staphylococcus aureus de outras espécies de Staphylococcus spp. Princípio: Capacidade do S. aureus produzir uma coagulase extracelular livre, que atua sobre a protrombina presente no plasma de coelho, dando origem a um produto semelhante à trombina, que irá atuar no fibrinogénio originando um coágulo de fibrina [138].

Procedimento: Num tubo contendo cerca de 0,5mL de plasma de coelho citratado inocular uma colónia isolada e incubar a 35 ± 2ºC, com leitura após 4h de incubação, se ainda não se tiver formado o coágulo prolongar a incubação até às 24h, para descartar possíveis falsos negativos. Pode ocorrer lise do coágulo antes da sua observação por produção de enzimas fibrinolíticas pela estirpe em estudo (falsos negativos) [138]_.

9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7

Teste Comercial: E. coli O157 Latex Test, da Oxoid.

A Escherichia coli é parte integrante da microbiota do trato intestinal em humanos saudáveis, contudo, algumas são patogénicas podendo levar a alterações gastrointestinais. O serotipo O157:H7 da E. coli tem sido o mais frequentemente isolado nos casos de colite hemorrágicas e síndrome urémica hemolítica, com produção de uma Verotoxina, sendo esta E.

coli designada de entero-hemorrágica [139].

A transmissão ocorre através da ingestão de água ou alimentos contaminados, ou pelo contacto com animais ou pessoas infetadas (transmissão fecal-oral) estando muito associadas a surtos alimentares [139].

Amostra: Fezes depois de semeadas em meio MCK. As colónias de interesse são as sugestivas de E. coli, não fermentadoras de sorbitol. É necessário testar pelo menos 10 colónias.

Objetivo: Identificação do serogrupo E. coli O157. Método: Reação de aglutinação [140].

O reagente teste contém partículas de latex sensibilizadas com anticorpos específicos reativos contra o antigénio somático O157. O controlo contém partículas de latex sensibilizadas com imunoglobulina de coelho pré-imunizada [140].

Procedimento: Realizar uma suspensão, com 1 gota de solução salina e parte de 1 colónia. Posteriormente, adicionar 1 gota de reagente teste e misturar de forma a cobrir a área de reação. Empreender movimentos circulares ao cartão, 1 minuto, procurando visualizar sinais de aglutinação. Se aglutinar, testar a outra porção da colónia com o controlo para garantir que o isolado não é uma estirpe auto-aglutinante [140]_.

Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%

9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae

Teste Comercial: Oxoid Dryspot™ Pneumo Test

O Streptococcus pneumoniae é o principal agente causador da pneumonia bacteriana, meningite, otite e bacteriémia. Os sintomas são diversos dependendo da parte do corpo infetada e em casos mais graves pode levar à perda de audição, lesões cerebrais irreversíveis e morte

[141]_.

Os grupos de risco são os adultos com 65 anos ou mais, crianças menos de 2 anos de idade e indivíduos imunodeprimidos [141].

A virulência deste microrganismo deve-se às propriedades anti-fagocitárias do polissacárido capsular [142].

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α- hemólise, com 18-24h de incubação.

Objetivo: Pesquisa do antigénio capsular do Streptococcus pneumoniae, para o diferenciar de outros estreptococos α-hemolíticos.

Método: Reação de aglutinação [142]_.

O teste utiliza partículas de látex desidratadas em cartão, sensibilizadas com anticorpos específicos para o pneumococo, na área de teste e partículas de látex desidratadas, sensibilizadas com imunoglobulinas não reativas, na área de controlo [142].

Procedimento: Adicionar 1 gota de solução salina na região branca da área teste e da área de controlo e emulsionar algumas colónias sugestivas de modo a obter uma suspensão ligeiramente opalescente e homogénea. De seguida, misturar a suspensão com o reagente látex desidratado até à completa reidratação e homogeneização sobre a área de reação. Proceder da mesma forma na área de controlo. Empreender movimentos circulares ao cartão, durante 1 minuto, e observar. A presença de aglutinação é indicativa da presença do antigénio. O teste é invalidado se ocorrer aglutinação na área de controlo, sendo indicativo de auto-aglutinação [142].

Sensibilidade: 97.9%; Especificidade: 93.2%

9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos

Antimicrobianos

Equipamento: VITEK® 2, da bioMérieux

A identificação e TSA só devem ser realizados a partir de colónias isoladas em cultura pura.

Não é necessário proceder-se à identificação e TSA caso seja isolada a mesma espécie de microrganismo em amostras idênticas colhidas em dias sucessivos. No entanto, se a segunda amostra tiver vindo com um intervalo igual ou superior a 5 dias já será necessário, pois pode ter havido alterações na flora ou no padrão de suscetibilidade.

O VITEK® é um equipamento capaz de fazer a identificação de microrganismos de interesse e TSA. É constituído por uma estação de enchimento de cartas por vácuo, que força a suspensão da amostra a fluir para as cartas, uma zona de selagem, outra de incubação e leitura automática de cartas.

O reconhecimento das cartas de identificação e de TSA é feito através de uma unidade de leitura de códigos de barras. O software tem a capacidade de cruzar a informação da identificação com a do antibiograma e alerta caso o resultado do antibiograma não seja consistente com a bactéria identificada.

9.7.1. Preparação da Suspensão

O primeiro passo para se proceder à identificação de microrganismos e/ou TSA é preparar uma suspensão das colónias em estudo, em 3mL de solução salina, com a ajuda do densitómetro (Densichek). Para diferentes microrganismos, diferentes densidades são requeridas:

 0.50-0.65 McFarland para a maioria das bactérias Gram positivo e Gram negativo;

 1.8-2.20 McFarland para leveduras;

 2.8-3.30 McFarland para Neisseria spp., grupo HACEK (Haemophilus spp.,

Aggregatibacter, actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens e Kingella kingae), anaeróbios e Corynebacterium spp.

Para cada ensaio faz-se um controlo da suspensão, inoculando 1µL em meio COS, permitindo manter a viabilidade do microrganismo, assim como averiguar a pureza da suspensão.

Depois de preparadas as suspensões, são acondicionadas numa rack que será programada no equipamento, em que é associado o número de cultura às cartas de identificação e/ou TSA.

9.7.2. Identificação de Microrganismos