Análise Parasitológica

As diversas matrizes de água usadas na determinação da taxa de recuperação de cistos e oocistos (Etapa I e II) foram coletadas e processadas no mesmo dia, empregando os métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação em Carbonato de cálcio (FCC) sem a aplicação da etapa de purificação (IMS). Para a avaliação da eficiência de recuperação dos organismos pela inclusão da IMS, outras amostras foram coletadas e avaliadas, no mesmo dia, pelas metodologias de FM e FCC, como descritas a seguir:

4.3.1. Técnica de concentração por floculação com carbonato de Cálcio

Este protocolo foi baseado no de Vesey et al. (1993). Os frascos contendo as amostras foram homogeneizados e o conteúdo transferido para um balão de fundo chato, estéril. Separadamente, adicionou-se 100 mL de cloreto de cálcio 1M, e em seguida, 100 mL de bicarbonato de sódio 1M. O pH foi corrigido para 10,0 com adição de hidróxido de sódio 1M e mantido durante 12h “overnight” à temperatura ambiente. Após este período, o sobrenadante foi retirado cuidadosamente (por aspiração) e o precipitado foi dissolvido com 200 mL de ácido sulfâmico 10,0 % e agitado por 15 segundos. Essa suspensão foi transferida para tubos cônicos de centrífuga de 250 mL, centrifugados a 3.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e todo o material depositado no fundo do frasco foi transferido para um único tubo de 50 mL, centrifugado a 3.000 rpm por mais 10 minutos, obtendo-se um volume final de sedimento com cerca de 10 mL. Esse sedimento final foi levado para a etapa de visualização com imunofluorescência, analisando-se alíquotas de 10 µL. Quando aplicada a Separação Imunomagnética (IMS), como etapa de purificação deste sedimento, o volume final obtido foi de 50 µL.

O cálculo para estimar o número de cistos e oocistos/L (=X) para cada amostra foi feito com a fórmula, segundo Palmateer et al. (1996):

(1)

onde,

A = nº de cistos e oocistos visualizados no poço da lâmina. B = volume de sedimento final (mL)

C = volume total da amostra (L)

4.3.2. Técnica de concentração por filtração em membrana

As amostras foram concentradas de acordo com o protocolo de Franco et al. (2001), como descrito a seguir:

As amostras foram filtradas em membranas de ésteres mistos de celulose (Millipore®), com 47 mm de diâmetro e porosidade nominal de 3 μm, através de um sistema de filtração com bomba de vácuo e porta-filtro de vidro marca Millipore® .

Após a filtração, as diversas membranas foram cuidadosamente retiradas e colocadas em placas plásticas estéreis para realizar a etapa de recuperação de cistos e oocistos eventualmente presentes nas amostras. Para tanto, a superfície das membranas foi

X = A x B x 100

raspada por 10 minutos com alça plástica macia seguida de lavagens manuais (por 10 minutos) com solução de eluição (Tween 80, 0,1%).

O líquido resultante foi reduzido por centrífugo-concentração por 15 minutos (650 x g) até a obtenção de volume de sedimento não superior a 500 µL (dependendo da turbidez da água analisada), descartando-se o sobrenadante. Uma segunda centrifugação deste sedimento foi realizada empregando água Milli-Q (15 minutos; 650 x g) e descartando-se o sobrenadante. Esse volume final foi levado para a etapa de imunofluorescência analisando- se alíquotas de 10 µL. Porém, quando aplicado a IMS, como etapa de purificação deste sedimento, o volume final foi de 50 µL.

O cálculo para estimar o número de cistos e oocistos/L (=Y) para cada amostra foi feito com a fórmula:

(2)

onde,

A = n° cistos e oocistos visualizados no poço da lâmina

B = alíquota do sedimento (μL) colocado no poço da lâmina de fluorescência C = vol. sedimento (mL) obtido

D = vol. Amostra (mL)

Y = A x 106 x C B D

4.3.3. Purificação das partículas-alvo mediante a Separação Imunomagnética (IMS) Com a finalidade de comparar o desempenho dos métodos de FM e FCC frente à etapa de purificação dos organismos-alvo, utilizou-se a separação imunomagnética que consiste na separação seletiva de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium, a partir de sedimentos concentrados de amostras de água, usando-se esferas microscópicas, uniformes, mono-dispersas, paramagnéticas, recobertas com anticorpos purificados contra cistos e oocistos. No caso deste estudo, foi usado o Kit comercial Dynabeads® GC-Combo que contém os seguintes reagentes: Dynabeads anti-Cryptosporidium; Dynabeads anti-Giardia; Tampão A 10x; Tampão B 10x. De acordo com o protocolo do fabricante, procede-se à análise da seguinte forma: a partir do volume final de 10 mL e o sedimento de até 500 µL, de acordo com a técnica de concentração usada (no caso deste estudo, foram utilizados os métodos de floculação em carbonato de cálcio e o de filtração em membranas para obtenção do sedimento final), e após a preparação dos tampões requeridos (A 10x e B 10X), a amostra (volume final de 10 mL com o sedimento) foi transferida para o tubo Dynal L10 contendo os tampões. As esferas paramagnetizadas (Dynabeads anti–Crypto e anti–Giardia) foram levadas ao vórtex para agitação por 10 segundos. As microesferas foram adicionadas ao tubo (100 µL), colocado no “mixer” rotatório (Dynal MX-1) por uma hora e rotacionado a 20 RPM. Após esse período, este tubo foi transferido para o concentrador magnético de partículas (MPC 1) com o lado reto do tubo voltado para o magneto e procedendo à agitação manual do tubo longitudinalmente num ângulo de 90º por 2 minutos. Após descarte cuidadoso do sobrenadante, a amostra foi ressuspendida, adicionando-se 1 mL de tampão (A 1X), e a seguir todo o volume presente foi transferido

colocado no outro concentrador magnético (MPC-S), efetuando-se nova agitação manual por 1 minuto, com aproximadamente um giro por segundo. Após esse tempo, retirou-se todo o sobrenadante com o auxílio de pipeta. Foi removida a fita magnética do concentrador e conduziu-se a dissociação ácida adicionando-se 50 µL de ácido hidroclórico 0,1 N (HCl). Após ser levado ao vórtex por 10s, o tubo foi colocado novamente no concentrador de partículas – MPC-S, sem a fita magnética. Após o tempo de espera necessário (10 minutos à temperatura ambiente), levou-se o tubo de microcentrífuga novamente ao vórtex, por 10s e inserindo-se o tubo de microcentrífuga novamente no concentrador MPC-S, agora com a fita magnética por 10s. Finalmente, todo o volume presente no tubo de microcentrífuga foi transferido para o poço da lâmina de imunofluorescência, que foi previamente preparado adicionando-se 10 µL da solução de hidróxido de sódio 1N. Em seguida, a alíquota da amostra purificada por IMS foi espalhada cuidadosamente na lâmina para visualização da IFA.

4.3.4. Visualização e quantificação de organismos mediante a Técnica de Imunofluorescência.

Na seqüência, todas as amostras foram submetidas à RID (reação de imunofluorescência direta) para visualização e quantificação dos cistos e oocistos. Para tanto, empregou-se anticorpos monoclonais anti–Crypto e anti-Giardia, utilizando-se o Kit Merifluor (Meridian Bioscience, Cincinnatti, Ohio), conforme protocolo descrito em Cantusio & Franco, 2004.

As preparações foram examinadas com microscópio de epifluorescência Zeiss Axiolab, com filtros específicos de acordo com o fluorocromo empregado no ensaio: Marca: NIKON USA; Modelo: 50i; Epi-iluminação; Câmera Digital: Nikon DMX 1200F USA com software ATC-1; Comprimento de onda Filtros: B-2E/C exitação 465-495nm; DM 505; Barreira 515-55 nm (FITC); e Y-2E/C excitação 540-580 nm; DM 595; Barreira 600-660 (Texas Red).

Os critérios para a identificação de oocistos e cistos levaram em consideração os seguintes indicadores: Imunofluorescência definida pela cor verde-maçã brilhante (comparável àquela exibida por mais de 50% de cistos e oocistos presentes nas suspensões de “controles positivos”; ausência de poros ou apêndices; tamanho e formato compatíveis: 8-12 µm de tamanho e forma oval para os cistos de Giardia spp. e, 3-8,5 µm de diâmetro, formato esférico e presença (não obrigatória) de sutura no oocisto para Cryptosporidium spp. No contraste de fase: axonema e núcleos (um a quatro) para cistos; presença das estruturas internas para oocistos.

Para as amostras inoculadas com Color Seed, consideraram-se as mesmas características morfológicas, porém com fluorescência vermelha.