Monitoramento

O monitoramento dos mananciais para verificar a presença de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. é cada vez mais necessário, em função da crescente contaminação destes, pelo esgoto doméstico tratado ou não, além de outras fontes de contaminação como a drenagem de pastagens. Esta ação implica na existência de métodos de detecção que sejam acessíveis às Estações de Tratamento de Água que fazem a captação para o tratamento e distribuição, considerando-se a sua disponibilidade de equipamento e, a possibilidade de investimentos. Além disso, outro fator limitante é a falta de pessoal capacitado, com conhecimento da morfologia dos protozoários, uma vez que estas análises são complexas em todas as suas etapas, principalmente a microscopia, pois existem diversos fatores interferentes e organismos “like” que podem causar resultados falsos positivos. Porém, é de extrema importância que os métodos de concentração sejam eficientes e apresentem resultados robustos.

Os métodos de concentração avaliados (FM e FCC) possuem princípios e etapas distintas, sendo cada uma delas, avaliada criteriosamente quanto a sua execução, como consta na Tabela 21.

Tabela 21: Avaliação comparativa das diferentes etapas dos métodos de FM e FCC para a detecção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. amostras hídricas.

*parâmetro considerado como o principal para o desempenho dos métodos; **do recebimento da amostra à análise dos resultados. ***custos considerando-se uma estrutura laboratorial mínima (microscópio, centrífuga, vidrarias e reagentes) para avaliações microbiológicas e parasitológicas. ****consideradas apenas as avaliações com amostras de água natural inoculadas com ColorSeed®

Parâmetros Metodologias

FM FCC

Equipamento necessário Possibilidade de uso do equipamento para análise microbiológica

(membrana filtrante de 47 mm) e centrífuga.

Balão volumétrico de 12 L, soluções específicas, centrífuga para tubos de 250 mL

Turbidez da amostra* Alta turbidez impacta a membrana facilmente, necessitando a troca da mesma.

Não há interferência.

Volume da amostra 1 litro 10 litros

Inóculo Color Seed® Aplica-se Aplica-se

Sedimento obtido Menor volume de sedimento final, mesmo em condições de alta turbidez.

Volume de sedimento é expressivo quando alta turbidez; necessidade de examinar várias alíquotas.

Reagentes Solução de Tween 80 à 0,01% Cloreto cálcio 1 M, Bicarbonato de sódio 1 M, Hidróxido de sódio 1 M, Ácido sulfâmico 10% Tween 80 0,01% e 0,05%

IMS Opcional Opcional

Etapa de visualização Menor interferência de fundo Dificultada em função da formação de cristais; falsos positivos, sendo ao excessivo número de partículas.

Tempo de execução** Máximo de 5 horas 16 horas

Fatores interferentes Turbidez e composição da membrana.

Agente floculador, tempo de floculação, pH.

Reprodutibilidade Variável Variável

Custo estimado dos equipamentos, incluindo a IMS***

50.000,00 50.000,00

Custo estimado dos reagentes incluindo os inóculos*** 25.000,00 25.000,00 Eficiência Média de Recuperação****: Cryptosporidium spp. Giardia spp. Sem IMS 29,8 % 28,3 % Com IMS 34,5 % 42,4 % Sem IMS 29,9 % 48,2 % Com IMS 24,5 % 49,8 %

Vale ressaltar que quando comparado os métodos frente à aplicação da etapa de purificação, a FCC pode mostrar-se mais trabalhosa e onerosa, principalmente quando o sedimento gerado foi maior que 500µL, sendo necessárias várias alíquotas para a purificação no IMS e a confecção de mais de uma lâmina para a visualização. Já a FM o sedimento raramente excede 500µL o que significa em apenas um processamento de IMS por amostra e a confecção de uma lâmina de IFA possibilita a análise de todo o sedimento. A variação da turbidez <50 e >50 NTU estipulados para as análises neste estudo, são as comumente encontradas ao longo do dia nas águas do Rio Atibaia que é um sistema lótico. De um modo geral, estudos avaliaram o método 1623 aplicando-se as variações naturais dos mananciais, tais como a turbidez e a baixa concentração de Giardia spp. e Cryptosporidium spp./L em águas naturais (DiGIORGIO et al., 2002).

Métodos para a recuperação de protozoários parasitos em amostras ambientais foram significativamente aperfeiçoados com novos formatos de filtros e a integração da etapa de purificação por IMS para separar os organismos alvos, das interferências não específicas, na última década, deste esforço, resultou o Método 1623 que embora amplamente utilizado para detecção de Giardia spp. e Cryptosporidium spp., ainda possui inconveniente de apresentar baixos valores de recuperação de cistos e oocistos frente à turbidez significativa e resultados extremamente variáveis (SIMMONS et al., 2001; FENG et al., 2003).

Neste estudo, a etapa de purificação realizada foi baseada no protocolo do Método 1623, e nem sempre resultou em uma melhora significativa nos valores de recuperação.

fluorescência de fundo da lâmina, dificultando a detecção dos cistos e oocistos. Além disso, o DAPI sofre interferências quando há presença de íons na amostra (SMITH et al., 2005), como é o caso das águas do rio Atibaia que apresenta resíduos orgânicos e inorgânicos, que poderia gerar a cristalização do corante. Altas concentrações de DAPI e longos tempos de exposição ao corante são recomendados para amostras contendo detritos e partículas minerais e mesmo assim, pode ocorrer falha na inclusão do corante (KEPNER e PRATT, 1994). É importante ressaltar que, os corantes vitais são apenas um indicativo da atividade metabólica e/ou da integridade da parede de cistos e oocistos e atualmente, a coloração com DAPI é empregada como um teste confirmatório da morfologia, devido à sua afinidade com o material nuclear (ROBERTSON e GJERDE, 2007). Entretanto, como apenas as formas que apresentam alteração de membrana são capazes de incorporar o corante, isto significa que cistos e oocistos infectantes e que não apresentam alteração nas suas membranas podem não ser contabilizados quando feita a leitura da lâmina.

Deve-se ressaltar que 40,0 % dos oocistos vazios não podem ser detectados por outras técnicas como PCR ou FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) (SMITH et al., 2002). O corante DAPI não deve ser aplicado com a finalidade de determinação de células mortas e/ou vivas porque o DNA, presente no núcleo das células, retém suas propriedades de coloração mesmo quando as células estão mortas e inativas (KEPNER e PRATT, 1994).

Estes resultados justificam o uso da microscopia de contraste de fase empregado neste estudo, e não o uso do DAPI para a confirmação de organismos presentes nas amostras e positivos para IFA.

Altas variabilidades encontradas nos diversos estudos de recuperação de cistos de Giardia spp e oocistos Cryptosporidium spp por FM e FCC têm sido atribuída ao grau de experiência profissional principalmente nas etapas de purificação por IMS e de visualização.

Cada método tem vantagens e limitações que afetam o seu uso em diferentes situações. Dentro deste contexto, requerimento para amostras, transporte, habilidade simultânea de análise dos organismos, tempo necessário, capacidade dos laboratórios, custos entre outros, têm sido considerados. O IMS, a marcação por anticorpo monoclonal e FITC e os métodos microscópicos são consistentes e eficientes minimizando a perda dos organismos (FERGUSON et al., 2004).

Bactérias do grupo coliformes são usadas como microrganismos indicadores para se avaliar a qualidade bacteriológica da água para consumo humano. Estão presentes além do solo e vegetação, na flora intestinal do ser humano e de outros animais de sangue quente, são encontradas em grande número nos esgoto e, em geral, não são consideradas patogênicas (CRAUN et al., 1997). Apesar de abundantes no meio, são facilmente eliminadas pelos desinfetantes usuais empregados nos sistemas de tratamento de água, o que não ocorre com estes protozoários, pois estes são resistentes aos processos químicos de desinfecção, e podem persistir por meses ou anos no ambiente, ainda na forma infectante (CRAUN et al., 1997).

Assim, o monitoramento de corpos d’água realizado apenas a partir de variáveis físico-químicas não tem sido suficiente para medir o grau de impacto e de alteração que

estes ecossistemas têm sofrido, havendo a real necessidade de uma mudança neste tipo de avaliação, incluindo principalmente os parâmetros parasitológicos.

Embora a Portaria 518/2004 do Ministério da Saúde recomende a avaliação da presença dos protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em água destinada ao consumo humano, vários fatores dificultam o atendimento em curto prazo desta recomendação, entre eles: a complexidade inerente aos métodos de detecção, a falta de pessoal especializado para o trabalho e a falta de informações disponíveis sobre a ocorrência destes agentes patogênicos nos recursos hídricos nacionais ( CBH-PCJ, 2002).

Assim, o prévio conhecimento da qualidade dos mananciais de abastecimento para consumo humano, quanto à presença destes protozoários é importante, com objetivo da aplicação futura de um monitoramento. Considerando-se este aspecto as metodologias avaliadas neste estudo podem ser empregadas com esta finalidade. Cabe ressaltar que a metodologia de FM torna-se a mais indicada para os laboratórios de sistemas de tratamento de água, pois, com bons resultados de recuperação, esta metodologia têm se mostrado eficiente em detectar oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. em diversas amostras ambientais, utilizando-se de pequenos volumes de amostra.

A importância do conhecimento dos parâmetros microbiológicos e parasitológicos obtidos durante um monitoramento pode fornecer subsídios para uma avaliação de risco de surtos. Destaca-se como exemplo o grande surto de Milwaukee que, além de causar 100 mortes, causou um gasto de U$ 96,2 milhões aos cofres públicos americano sendo U$ 31,7 milhões de custos médicos e 2 vezes mais (cerca de U$ 64,6 milhões) em perda de produtividade (SUNNOTEL et al., 2006; FAYER, 2004). Pesquisadores ao avaliarem o

risco e controle da criptosporidiose concluíram que através do monitoramento obtem-se uma melhor avaliação da ocorrência da doença em níveis endêmicos e igualmente a determinação das fontes e causas dos surtos, informações estas que poderão ser usadas para minimizar sua transmissão através da água (ROSE et al., 2002). Estas informações também ampliarão os conhecimentos sobre a presença de agentes patogênicos e com isso, contribuirão para o delineamento de programas visando à recuperação dos recursos hídricos.