Precisão Inicial

São grandes as diferenças que existem entre os procedimentos usados para avaliar a sensibilidade dos métodos propostos, tais como: uma significante variação da matriz da água usada no ensaio controle, a concentração e forma de enumeração dos protozoários a serem usados nos experimentos de contaminação artificial, além da qualidade e tempo do armazenamento deste inóculo. Consequentemente existem muitas dificuldades em comparar os dados obtidos e relatados por diferentes laboratórios (LINDQUIST et al., 1999).

Por este motivo, neste estudo, vários fatores foram considerados como a robustez, o requerimento de poucos equipamentos, o menor número de etapas laboratoriais, os menores custos e o grande fator limitante: o comportamento dos métodos quando aplicados em amostras com turbidez (cerca de 50 NTU).

O método 1623 (USEPA, 2005) e as referências metodológicas do Standard Methods of Water and Waste Water (APHA, 2005) foram validados e recomendados para a detecção de oocistos de espécies de Cryptosporidium e de cistos das espécies de Giardia em amostras hídricas. Embora estes procedimentos geralmente consistam de três

etapas (amostragem ou concentração; purificação ou separação dos organismos alvo e, o exame do material por microscopia de epifluorescência), a escolha de cada etapa com seu respectivo procedimento depende especificamente do tipo da matriz amostrada e do objetivo da análise como, por exemplo, a urgência na obtenção dos dados, sob uma situação de risco (FRICKER E GRABB, 1998).

A etapa inicial de concentração no método 1623 é realizada com a filtração da amostra por Filta Max® ou Envirocheck® que permitem a avaliação de um grande volume de água, em dependência direta da turbidez. Em geral, quanto maior a turbidez, menores os volumes efetivamente filtrados (APHA, 2005).

Também existe a possibilidade desta etapa não ser realizada com esses filtros e, ser substituída pelas metodologias de Floculação com Carbonato de Cálcio ou Filtração em Membranas (com menor diâmetro), utilizando neste caso, menores volumes, desde que asseguradas os valores de eficiência de recuperação dos organismos.

Por outro lado, para uma realidade da América Latina e do Brasil, existe uma grande necessidade de atender à demanda dos sistemas de abastecimento de água, e, para isso, métodos que impliquem em menores custos devem ser priorizados. Neste contexto e, considerando a avaliação preventiva dos mananciais, as metodologias de FM e FCC são alternativas viáveis, e no caso específico da FM, muitos dos equipamentos necessários já fazem parte das atividades pertinentes à rotina de controle de qualidade da água, executado pelos laboratórios das empresas de saneamento. Exemplo disto são as membranas avaliadas neste estudo (47 mm de diâmetro) que são rotineiramente utilizadas em Estações de Tratamento de Água para o monitoramento de bactérias indicadoras, mas, mostram-se

ambientais, como águas superficiais, naturais e efluente de esgoto (FRANCO et al., 2001a; CANTUSIO NETO e FRANCO, 2004; BRANCO, 2006; CANTUSIO NETO et al., 2006).

Assim, expressivas eficiências de recuperação são alcançadas pela FM em diferentes amostras: 91,8 % para Giardia spp. e 41,6 % para Cryptosporidium spp. em águas superficiais; 48,3 % para Giardia spp. e 70,9 % para Cryptosporidium spp. em águas de nascentes e, 58,8 e 26,6 % para Giardia spp. e Cryptosporidium spp. respectivamente, para efluente de esgoto (FRANCO et al., 2001a; CANTUSIO NETO e FRANCO, 2004; BRANCO, 2006; CANTUSIO NETO et al., 2006).

Ressalte-se que a utilização da etapa de purificação pela separação imunomagnética (IMS) pode ser adicionada a esses métodos o que contribui para promover uma melhora significativa na recuperação de oocistos e cistos. Por esta razão, neste estudo, realizou-se a comparação entre estas metodologias, acrescida ou não da etapa de purificação por IMS.

Neste estudo, a opção pelo uso da dissociação ácida na etapa de IMS foi fundamentada na recomendação do fabricante do Kit e, também pela experiência adquirida durante visita técnica á Thames Water Utilities Laboratory - Inglaterra, país onde a análise de protozoários é obrigatória.

No entanto, ao se incorporar a etapa de purificação por IMS ao protocolo já adotado em um laboratório, o primeiro passo consiste na verificação da habilidade do pessoal técnico envolvido nas análises em executar a separação imunomagnética. Isto é feito com a inoculação experimental de um número conhecido de cistos e oocistos diretamente em 10 mL de água MilliQ, que corresponde ao volume da etapa inicial do IMS e, a seguir, executando-se o procedimento de forma similar as amostras ambientais. Neste estudo, as recuperações obtidas para ambos os protozoários, nesta etapa inicial, foram superiores a

70,0 %, valor este que é coerente com os estabelecidos pela USEPA, 2005. Assim, confirmou-se a habilidade em executar esta etapa de purificação.

Diferentes inóculos foram utilizados neste estudo: o Easy Seed® para contaminar artificialmente amostras de água reagente durante as avaliações iniciais de precisão dos métodos. O inóculo Color Seed® foi utilizado como controle interno nos experimentos de detecção dos protozoários em amostras de água bruta o que elimina a necessidade de ensaios paralelos para se reverificar a ocorrência natural dos protozoários nestas amostras avaliadas. Porém, este inóculo apresenta a característica de produzir uma pequena queda na eficiência de recuperação para cistos e oocistos (WARNECKE et al., 2003). Isto se deve provavelmente, em função do aumento da hidrofobicidade dos organismos causada pela adesão aos marcadores de hidrocarboneto deste inoculo (WARNECKE et al., 2003), resultando no aumento da aderência nas superfícies, além de perdas durante os processos de concentração e análise. Embora seu uso seja considerado estável para uma ampla variação de condições, ao ser comparado com uma suspensão não comercial de cistos e oocistos, o Color Seed® apresentou uma recuperação de 3,3 e de 4,0 % menor para oocistos e cistos, respectivamente (WARNECKE et al., 2003). Grundilingh e Wet (2004) também observaram recuperações variáveis em amostras inoculadas artificialmente com Color Seed®: de 0,0 a 10,0 % para oocistos e de 0,0 a 30,0 % para cistos.

Sabe-se que a produção de inóculo é desafiadora. A enumeração das formas (cistos e oocistos) é uma etapa crítica uma vez que os métodos de contagem não são totalmente eficientes e, o problema da distribuição não homogênea dos organismos na suspensão, que pode levar à não exatidão do número de cistos e oocistos inoculados, geram uma grande

aspectos biológicos (idade e origem dos organismos) e procedimentos prévios de limpeza e meio de armazenamento também influenciam nos valores de recuperação (BUKHARI et al., 1998; LINDQUIST et al., 1999).