Dedico este trabalho a minha estimada esposa Leila e aos meus filhos: André e Ana Carolina, pelo apoio, muita compreensão e estímulo nas difíceis etapas cumpridas desse trabalho.
À SANASA, Sociedade de Abastecimento de Água e Saneamento S/A, que autorizou e apoiou a realização desse curso de Pós-Graduação.
Aos meus colegas de laboratório: Ivânio e Alexandre; e ao estagiário Maurício, pelo importante auxílio em diferentes etapas desta tese.
Aos professores e funcionários do Departamento de Parasitologia/Instituto de Biologia/Unicamp, pelo apoio para a realização deste trabalho.
Aos colegas do laboratório de Protozoologia: Mirna, Sandra, Nilson, Diego, Rita, Taís, pelo trabalho em equipe e pelo importante auxílio de cada um. À Luciana, pelas discussões de artigos, atenção e amizade.
À Profa. Dra. Maria Inês Zanoli Sato, pela amizade, incentivo e pelos esclarecimentos e discussões abordados nesse trabalho.
À Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco pela orientação, incentivo, apoio, e amizade durante o curso de Pós-Graduação e realização desse trabalho. Também pelos valiosos conhecimentos transmitidos através de nosso trabalho em conjunto nestes últimos anos.
A veiculação hídrica tem sido considerada uma das principais vias de transmissão de giardiose e criptosporidiose sendo implicada na ocorrência de vários surtos de gastroenterites, em vários países nos últimos anos. Diante deste panorama, no Brasil foi emitida Portaria 518/04 (Ministério da Saúde), que recomenda a pesquisa destes protozoários em água de consumo humano. Por este motivo, o objetivo deste estudo foi realizar um estudo comparativo entre as metodologias de concentração já existentes: Filtração em Membrana (FM) e Floculação em Carbonato de Cálcio (FCC), tecendo uma análise crítica das mesmas e verificando-se a sua aplicabilidade em amostras naturais de água superficial do Rio Atibaia. Este estudo foi conduzido em duas etapas: na primeira, foram realizados 52 experimentos, visando analisar o desempenho dos métodos propostos determinando-se a precisão inicial em amostras de água reagente inoculadas com suspensões comerciais de cistos e oocistos Easy Seed® (Biotecnology Frontiers, Austrália), aplicando-se ou não a etapa de purificação mediante o uso da separação imunomagnética. Quando foram avaliadas amostras do rio Atibaia, a suspensão comercial de cistos e oocistos utilizada para a contaminação artificial foi Color Seed® (Biotecnology Frontiers, Austrália). Em uma segunda etapa, um total de 36 experimentos foi conduzido com o objetivo de se avaliar o comportamento dos mesmos métodos frente a fatores interferentes, característicos da matriz de água bruta superficial, entre eles a turbidez. Nos experimentos controle com amostra de água reagente, a metodologia de FM recuperou mais organismos (21,5 % dos oocistos e 25,0 % dos cistos), quando comparada com a metodologia de FCC (5,3 % e 5,8 % dos oocistos e cistos, respectivamente). A inclusão da etapa de purificação por separação imunomagnética (IMS) não resultou num aumento na recuperação de cistos e
de recuperação dos organismos e quando incluída a etapa de IMS, uma melhora ocorreu apenas para a recuperação de cistos de Giardia spp. Quando avaliada amostras de água bruta superficial do rio Atibaia em condições de turbidez até 50 NTU a etapa de purificação por IMS acarretou uma maior eficiência de recuperação de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp., para as duas metodologias de concentração. Quando a turbidez das amostras foi superior a 50 NTU, uma melhora da recuperação ocorreu apenas para Cryptosporidium spp, utilizando-se o método de FM. Assim, ambas as metodologias avaliadas, mostraram-se eficientes para serem aplicadas em um monitoramento desses protozoários em amostras hídricas, mesmo em situações de alta turbidez. A etapa de purificação pela separação imunomagnética nem sempre apresentou um ganho na recuperação dos organismos e, as variações nos valores de recuperação para ambos os protozoários, são inerentes aos protocolos utilizados e também associados à matriz analisada. A FM é indicada pela praticidade, tempo e resultados, podendo auxiliar para o conhecimento da ocorrência destes patógenos e assim, minimizar a possibilidade de sua transmissão mediante veiculação hídrica.
Palavras-chave: Cryptosporidium; Giardia; métodos de detecção; amostras hídricas; turbidez; separação imunomagnética.
The waterborne transmission route of giardiosis and criptosporidiosis has been considered the major one, causing the occurrence of several gastroenteritis outbreaks in several countries in the last years. Looking to this panorama, was published in Brazil the Governmental Decree 518/04 (Health Department), that recommends the research of these protozoa in water samples. For this reason, the goal of this study was to accomplish a comparative study between Membrane Filtration (MF) and Calcium Carbonate Flocculation (FCC) concentration methodologies, doing a critical analysis of both and verifying its apply in natural samples of Atibaia River superficial water. Two stages took place: in the first one, 52 experiments were carried out, aiming to analyze the performance of the methods proposed, determining the initial precision in samples of reagent water inoculated with commercial suspensions of cysts and oocysts (Easy Seed®-Biotecnology Frontiers Australia), applying or not the purification step by Immunomagnetic Separation. When natural water samples were evaluated, the commercial suspension of cysts and oocysts utilized for the artificial contamination was (Color Seed®-Biotecnology Frontiers Australia). In a second step, 36 experiments were carried out aiming to evaluate the behavior of the methods facing interferential factors, peculiar of the superficial raw water matrix, as turbidity. In the trial control with reagent water sample, the FM methodology recovered more organisms (21.5% of the oocysts and 25.0% of the cysts), in comparison to the FCC methodology (5.3% of the oocysts and 5.8% of the cysts). The purification step by Immunomagnetic Separation (IMS) did not show an improvement in the recovery of cysts and oocysts in these methodologies (FM and FCC). In the experiments with natural water samples (Atibaia river), in a general way, the FCC methodology showed better recovery
samples with turbidity up to 50 NTU were evaluated, the purification step by IMS showed higher efficiency in the recovery of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts, for both concentration methodologies. When the turbidity of the sample was over 50 NTU, a recovery improvement occurred just for Cryptosporidium spp, using the FM method. Thus, both methodologies showed efficiency in monitoring these protozoa in water samples, even in situations of high turbidity. The purification step by Immunomagnetic Separation not always showed gain in the recovery of the organisms and the variations in the values of recovery for both protozoa are inherent to the protocols that were used and also associated to the analyzed matrix. However, the FM method is indicated for its practicability, time and results, being able to help the knowledge of the occurrence of these pathogens and minimize the possibility of its transmission by waterborne route.
Keywords: Cryptosporidium; Giardia; detection methods; water samples; turbidity; immunomagnetic separation.
Figura 1: Programa de Qualidade Operacional 24 Figura 2: Bacia Hidrográfica dos rios Piracicaba, Capivari e Jundiaí, com destaque da Região Metropolitana de Campinas... 31 Figura 3: Local da captação de água no Rio Atibaia – Campinas (vista aérea)... 31
Figura 4: Estações de Tratamento de Água 1 e 2, Campinas (vista aérea)... 32 Figura 5: Delineamento amostral da primeira etapa: estudo da performance dos
métodos de filtração em membranas (FM) e floculação em carbonato de Cálcio (FCC)...
37 Figura 6: Delineamento amostral da segunda etapa: estudo da performance dos
métodos de filtração em membranas (FM) e floculação em carbonato
de Cálcio (FCC)... 38 Prancha 1: Oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. pelo
metodo de Filtração em Membrana (FM), sem e com IMS, em amostras de água natural superficial do rio Atibaia... 78 Prancha 2: : Oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. pelo
método de Floculação em carbonato de cálcio (FCC), sem e com IMS, em amostras de água natural superficial do rio Atibaia... 79
de purificação por IMS, em ensaios com água reagente inoculada artificialmente com Easy Seed®... 52 Tabela 2: Eficiência de recuperação de oocistos de Cryptosporidium spp., média, desvio
padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR), utilizando as técnicas de FM e FCC, sem a etapa de purificação por IMS, em ensaios com água reagente inoculada artificialmente com Easy Seed®... 52 Tabela 3: Eficiência de recuperação de cistos de Giardia spp., média, desvio padrão (DP)
e desvio padrão relativo (DPR), utilizando as técnicas de FM e FCC, com a etapa de purificação por IMS, em ensaios com água reagente inoculada artificialmente com Easy Seed®... 54 Tabela 4: Eficiência de recuperação de oocistos de Cryptosporidium spp., média, desvio
padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR), utilizando as técnicas de FM e FCC, com a etapa de purificação por IMS, em ensaios com água reagente inoculada artificialmente com Easy Seed®... 54 Tabela 5: Eficiência de recuperação de cistos de Giardia spp., parâmetros físico-químicos,
média, desvio padrão (DP) e Precisão (PR), utilizando as técnicas FM e FCC em água bruta, sem a etapa de purificação por IMS, inoculada artificialmente com Color Seed®... 57 Tabela 6: Eficiência de recuperação de oocistos de Cryptosporidium spp., parâmetros
físico-químicos, média, desvio padrão (DP) e Precisão (PR), utilizando as técnicas FM e FCC em água bruta, sem a etapa de purificação por IMS, inoculada artificialmente com Color Seed®... 57 Tabela 7: Eficiência de recuperação de cistos de Giardia spp., parâmetros físico-químicos,
média, desvio padrão (DP) e Precisão (PR), utilizando as técnicas FM e FCC em água bruta, com a etapa de purificação por IMS, inoculada artificialmente com Color Seed®... 59 Tabela 8: Eficiência de recuperação de oocistos de Cryptosporidium spp., parâmetros
físico-químicos, média, desvio padrão (DP) e Precisão (PR), utilizando as técnicas FM e FCC em água bruta, com a etapa de purificação por IMS, inoculada artificialmente com Color Seed®... 59 Tabela 9: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físicos-químicos detectados por
litro, média e desvio padrão (DP), utilizando as técnicas de FM e FCC, em amostras de águas bruta superficial... 62
Tabela 11: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físicos-químicos detectados por litro média e desvio padrão (DP), utilizando as técnicas de FM e FCC, com a etapa de purificação (IMS) em amostras de águas bruta superficial... 64 Tabela 12: Número de oocistos de Cryptosporidium spp. e parâmetros físico-químicos
detectados por litro, média e desvio padrão (DP), utilizando as técnicas de FM e FCC, com a etapa de purificação (IMS) em amostras de água bruta superficial... 64 Tabela 13: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físicos-químicos detectados
por litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, sem purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)... 68 Tabela 14: Número de oocistos de Cryptosporidium spp. e parâmetros físicos-químicos
detectados por litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, sem purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)... 68 Tabela 15: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físico-químicos detectados por
litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, com purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)... 70
70 Tabela 16: Número de oocistos de Cryptosporidium spp. e parâmetros físico-químicos
detectados por litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, com purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)...
Tabela 17: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físico-quimicos detectados por litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, sem purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez > 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)... 73 Tabela 18: Número de oocistos de Cryptosporidium spp. e parâmetros físico-quimicos
detectados por litro, média e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, sem purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez > 50 NTU e uso de controle interno (ColorSeed®)... 73 Tabela 19: Número de cistos de Giardia spp. e parâmetros físico-químicos detectados por
litro, media e desvio padrão (DP), empregando as técnicas de FM e FCC, com purificação por IMS, em amostras de água bruta superficial com turbidez > 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)...
turbidez > 50 NTU e uso de controle interno (Color Seed®)... 75 Tabela 21: Avaliação comparativa das diferentes etapas entre os métodos de FM e FCC
para a detecção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras hídricas ... 106
Resumo... vi Abstract... viii Lista de Figuras... x Lista de Tabelas... xi 1. Introdução... 1 2. Revisão de Literatura... 7 2.1. Protozoários... 7 2.1.1. Giardia spp... 7 2.1.2. Cryptosporidium spp... 10
2.2. Doenças de Veiculação Hídrica: Surtos de Giardiose e de Criptosporidiose... 13
2.3. Métodos para avaliação da presença de Giardia spp. e Crypstosporidium spp... 16
2.4. Controle de Qualidade Analítica dos Métodos... 23
2.4.1. Precisão Inicial e Recuperação... 25
2.4.2. Inoculação em Matriz de Água Bruta... 26
2.4.3. Diagnóstico e Localização de Erros... 26
3. Objetivos... 28
4. Material e Métodos... 29
4.1. Local do Estudo... 29
4.2. Delineamento Amostral... 33
4.2.1. Teste Inicial de Eficiência do Protocolo de Separação Imunomagnética (IMS)... 33
empregando-se Easy Seed®, sem e com etapa de purificação por IMS... 34
4.2.2.2. Ensaios com água bruta superficial, inoculadas artificialmente, empregando-se Color Seed®... 34
4.2.2.3. Ensaios utilizando amostras de água bruta superficial (ocorrência natural)... 35
4.2.3. Segunda Etapa: Influencia da Turbidez sobre a performance dos Métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação em Carbonato de Cálcio (FCC)... 35 4.2.3.1. Ensaios com amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU... 35
4.2.3.2. Ensaios com amostras de água bruta superficial com > que 50 NTU... 36
4.2.4. Suspensões de cistos e oocistos usados nos experimentos de contaminação artificial das amostras... . 39 4.2.4.1. Easy Seed ™ BTF... 39
4.2.4.2. Color Seed™ BTF... 39
4.2.5. Coleta e Concentração das Amostras... 41
4.2.6. Medidas físico-químicas... 41
4.3. Análise Parasitológica... 42
4.3.1. Técnica de concentração por Floculação com Carbonato de Cálcio... 42
4.3.2. Técnica de concentração por Filtração em Membrana... 43
4.3.3. Purificação das partículas-alvo mediante a Separação Imunomagnética (IMS)... 45
4.3.4. Visualização e quantificação de organismos mediante a Técnica de Imunofluorescência ... 46
4.5.2 Eficiência de Recuperação dos Métodos... 48
4.5.3 Desvio Padrão Relativo... 49
4.5.4. Cálculo para Determinação da Precisão da Matriz... 49
5. Resultados... 50
5.1. Teste Inicial de Eficiência do Protocolo de Separação Imunomagnética (IMS)... 50
5.2. Primeira Etapa... 50
5.2.1. Ensaios com água reagente (Precisão Inicial)... 50
5.2.1.1. Comparação entre os métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio utilizando-se Easy Seed®, sem a etapa de purificação por IMS... 50
5.2.1.2. Comparação entre os métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio utilizando-se Easy Seed®, com a etapa de purificação por IMS... 53
5.2.2. Ensaios com água bruta superficial (Efeito da Matriz sobre a eficiência de recuperação)... 56
5.2.2.1. Comparação entre métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), utilizando Color Seed® sem a etapa de purificação por IMS... 56
5.2.2.2. Comparação entre métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), utilizando-se Color Seed® com a etapa de purificação por IMS... 58
5.2.2.3. Comparação entre os métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), sem a etapa de purificação por IMS, utilizando-se amostras de água bruta superficial (ocorrência natural)... 60
5.2.2.4. Comparação entre os métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), com a etapa de purificação por IMS, utilizando-se amostras de água bruta superficial (ocorrência natural)... 63
5.3.1. Ensaios em amostras de água bruta superficial com turbidez < 50 NTU.. 66
5.3.1.1. Comparação entre os métodos de Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), sem a etapa de purificação (IMS), com amostras de água bruta superficial (amostras naturais), com turbidez < 50 NTU... 66
5.3.1.2. Comparação entre os métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), com a etapa de purificação (IMS), com amostras de água bruta superficial (amostras naturais), com turbidez < 50 NTU... 69
5.3.2. Ensaios em amostras de água bruta superficial com turbidez acima de 50 NTU... 72
5.3.2.1. Comparação entre os métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), sem a etapa de purificação (IMS), com amostras de água bruta superficial (amostras naturais), com turbidez > 50 NTU... 72
5.3.2.2. Comparação entre os métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), com a etapa purificação (IMS), com amostras de água bruta superficial (amostras naturais), com turbidez > 50 NTU... 74
5.3.3. Controles negativos... 77
6. Discussão... 80
6.1. Precisão Inicial... 80
6.2. Controle Utilizando Água Reagente... 85
6.3. Controle Utilizando Amostras Naturais de Água Bruta do Rio Atibaia... 92
6.4. Comportamento dos Métodos... 96
6.5. Ocorrência em Amostras de Água Natural do Rio Atibaia... 101
6.6. Monitoramento... 105
1 - Introdução
A bacia hidrográfica dos rios Piracicaba, Capivarí e Jundiaí pertencem ao 5° grupo de UGRHs (Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos) do Estado de São Paulo, segundo lei Estadual n° 7.663 de dezembro de 2001 e ocupam uma área de 14.040 Km2
. Uma pequena porção das cabeceiras de alguns de seus rios encontra-se no Estado de Minas Gerais (1.280 Km2), estando, portanto todo o restante no Estado de São Paulo. Abrangem uma população de aproximadamente 4,2 milhões de pessoas distribuídas em 58 municípios que possuem sede nesta UGRH. As águas da bacia destinam-se principalmente ao abastecimento público, industrial e irrigação, recebendo grande aporte difuso de efluentes domésticos, industriais e agrícolas (CBH-PCJ, 2002).
A constante degradação ambiental em bacias hidrográficas de intensa ocupação antrópica tem alterado significativamente a qualidade de água dos mananciais, predominantemente utilizados para abastecimento público, irrigação e recreação (TUCCI, 2002; CANTUSIO NETO et al., 2006).
Em todo o mundo, existem relatos de surtos epidêmicos de doenças de transmissão hídrica causados por organismos patogênicos, com as mais variadas proporções de registros e de casos (FAYER, 2000); no Brasil, as doenças veiculadas pela água são responsáveis por 2/3 das internações hospitalares (FUNASA, 2007).
Entre os vários agentes patogênicos relacionados à veiculação hídrica, algumas das espécies dos protozoários parasitas Giardia e Cryptosporidium são reconhecidas como causadoras de surtos de diarréia e , nos últimos 25 anos, estes organismos alcançaram
grande relevância em Saúde Pública dado o expressivo número de casos (MACPHERSON 2005; GAJADHAR e ALLEN, 2004).
Cryptosporidium spp. é um protozoário de vertebrados que provoca infecção no homem e em várias espécies animais, causando a criptosporidiose que pode acometer de forma severa principalmente as crianças, os diabéticos, os idosos e os indivíduos imunocomprometidos como portadores do HIV (FAYER et al., 2000) ou imunosuprimidos, principalmente os receptores de transplantes.
Mediante os estudos de biologia molecular, o antigo genótipo 1 de C. parvum passou a ser considerado como uma nova espécie, denominada Cryptosporidium hominis, infectante para o ser humano, peixe-boi marinho e, experimentalmente, para cabras (FAYER, 2004). C. parvum é considerada um complexo de espécies onde se encontram outros genótipos que são infectantes para bovinos, o ser humano e vários animais o que confirma o potencial zoonótico inicialmente atribuído ao protozoário (FAYER, 2004; CACCIÓ et al., 2005). Atualmente são reconhecidas 16 espécies de Cryptosporidium sendo que 7 delas acometem o ser humano.
O protozoário flagelado Giardia spp. é uma das causas de gastroenterite no ser humano bem como nos animais domésticos; a giardiose ocasiona um espectro clínico diverso, desde infecção assintomática até quadros severos de diarréia persistente, sendo em crianças associada às seqüelas como má absorção intestinal e conseqüente, retardo no desenvolvimento infantil (físico e cognitivo) (PICKERING e ENGELKIRK, 1998; ALI e HILL, 2003).
A permanência no meio ambiente das formas de resistência destes protozoários, a sobrevivência em águas superficiais e, a resistência aos desinfetantes químicos empregados
nas estações de tratamento de água, bem como a baixa dose infectante para ambos os parasitos, são fatores que contribuíram para a ocorrência de numerosos surtos de criptosporidiose e giardiose em diferentes países (LeCHEVALLIER et al., 1991; RODGERS et al., 1995; DYKSEN et al., 1998; THOMPSON, 2000).
O surto de criptosporidiose que ocorreu em Milwaukee (EUA), no início da década de 90, acarretou um gasto aos cofres públicos americanos de U$ 96,2 milhões, sendo que U$ 31,7 milhões foram devido aos custos médicos e cerca de U$ 64,6 milhões em perda de produtividade (SUNNOTEL et al., 2006). Um levantamento utilizando técnicas moleculares e análise de 179 amostras de esgoto doméstico desta cidade, confirmou que a contaminação do manancial se deu através deste resíduo e, salientou que 27,9 % das amostras de esgoto continham 6 espécies de Cryptosporidium, sendo as espécies C. hominis e C. andersoni as mais comuns, e o subgenótipo Ib de C. hominis o mais predominante. Este achado é relevante, pois este subgenótipo apresenta uma maior virulência e, confirmou-se que há uma transmissão estável da infecção mesmo na ausência de registros da ocorrência de novos surtos (ZHOU et al., 2003).
Dados publicados no Brasil sobre a ocorrência destes protozoários patogênicos em amostras ambientais ainda são pouco numerosos. No Estado de São Paulo, já foi documentada a presença de oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia em águas superficiais de mananciais do Estado de São Paulo (Relatórios Ambientais – CETESB, 2000; Hachich et al., 2004); também foram detectados em água bruta no rio Atibaia (Franco et al., 2001a) e, recentemente investigados no sistema de tratamento de água da cidade de Campinas em amostras de água bruta (na tomada da captação) e em pontos estratégicos
do sistema de tratamento (após decantação; após filtração) (CANTUSIO e FRANCO, 2004).
Porém, questionamentos sobre a metodologia empregada nos estudos existentes no Brasil ainda são muito relevantes, pois os Métodos 1622 e 1623 (USEPA, 1999; 2001) que permanecem como procedimentos de referência, são caracterizados por grande variabilidade e baixa eficiência de recuperação de cistos e oocistos (CONNEL et al., 2001) frente à fatores interferentes, como a turbidez da água analisada e por altos custos para a execução dos mesmos.
No Brasil, a preocupação quanto à qualidade da água levou o Ministério da Saúde a emitir a Portaria n°1469 de 29/12/2000, republicada como Portaria n° 518 em 25 de março de 2004 (BRASIL, 2004) que estabelece procedimentos e responsabilidades com relação ao controle da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Quanto à presença de protozoários, não há obrigatoriedade desta análise como estipulado no “§ 8°; em complementação, recomenda-se a inclusão de pesquisa de organismos patogênicos, com o objetivo de atingir como meta, um padrão de ausência dentre outros, de enterovírus, cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium sp.”, em águas de abastecimento.
Embora a pesquisa dos protozoários patogênicos tenha sido contemplada nesta portaria, a não obrigatoriedade é justificada devido às dificuldades decorrentes da implantação deste tipo de investigação, considerando-se as limitações dos métodos atualmente propostos e da falta de pessoal capacitado (recursos humanos) para a realização dos mesmos.
Diante deste panorama, desde 2001, vêm sendo realizadas oficinas compostas por especialistas e membros do ministério da saúde, com o intuito de elaborar um diagnóstico sobre as condições metodológicas referentes às pesquisas já existentes no Brasil, e os possíveis monitoramentos já instalados em sistemas de abastecimento público para esses protozoários, em nível nacional, como ferramentas da implementação da Portaria 518/04 (BRASIL, 2004), buscando-se desta forma, caracterizar a ocorrência destes protozoários nos pontos de captação de abastecimento, objetivando a prevenção da contaminação do manancial e a obtenção de uma análise de risco quanto à possibilidade de ocorrência de surtos (CBH-PCJ, 2002; Grupo Técnico de Protozoários e Água/ Ministério da Saúde – comunicação pessoal).
O único método validado pela USEPA é o 1623, porém, apesar de ter sido desenvolvido visando contemplar tanto amostras de águas brutas quanto tratadas, ele é utilizado para amostras de águas de consumo, devido à influência da turbidez da água dos mananciais. Baseado na filtração e eluição da amostra através de uma cápsula de filtração, e posterior centrifugo-concentração, é seguido de uma etapa de purificação por separação imunomagnética (IMS) e visualização empregando reação de imunofluorescência direta (USEPA, 2005). Ressalte-se que desde 1998, altos custos têm sido observados em todas as suas etapas devido aos equipamentos e kits utilizados, além de apresentar uma alta variabilidade de resultados (FRICKER e CRAB, 1998).
No Brasil, dada a disparidade socioeconômica em todo o território nacional, a busca por metodologias com técnicas de concentrações mais simples e econômicas, e que requerem equipamentos menos complexos e de fácil execução laboratorial para amostras de
destacam a filtração em membrana (FM) e a floculação com carbonato de cálcio (FCC), as quais têm sido utilizadas em pesquisas científicas na geração de dados sobre a ocorrência destes protozoários em mananciais no país (GAMBA et al., 2000; FRANCO et al., 2001a; HACHICH et al, 2004). Entre estas duas alternativas metodológicas, somente a filtração em membrana permite a posterior identificação de espécies através de ferramentas moleculares (APHA, 2005).
Diante do exposto, o presente estudo pretende verificar a aplicabilidade destas metodologias, FM e FCC, em relação à detecção desses protozoários em mananciais eutrofizados, realizando-se uma análise crítica comparativa das mesmas; os resultados alcançados neste estudo poderão fornecer importantes subsídios para uma futura revisão da Portaria 518/04 do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004).
2 – Revisão de Literatura
De várias maneiras a água pode afetar a saúde do homem: através da ingestão direta (água contaminada por agentes biológicos: bactérias, vírus e parasitos), ou indiretamente pelo consumo de alimentos ou bebidas preparados com água contaminada. A contaminação do ser humano também pode ocorrer de forma acidental, durante atividades recreacionais ou profissionais.
2.1 – Protozoários
Entre os diversos agentes parasitários que podem ser veiculados pela água, destacam-se as espécies de protozoários Giardia e Cryptosporidium que nos últimos anos foram a causa de inúmeros surtos de veiculação hídrica, no mundo todo (KARANIS et al, 2007).
2.1.1. Giardia spp.
Giardia spp. é um protozoário flagelado que pertence a Classe Zoomastigophorea e Ordem Diplomonadida e está presente no trato intestinal de praticamente todas as espécies de vertebrados (LEVINE et al., 1980; THOMPSON, 2000; THOMPSON, 2004). Giardia duodenalis (também referida como Giardia intestinalis e Giardia lamblia) tem uma distribuição global e causa cerca de 2,8 x 108 casos por ano e, representa causa mais comum de surtos de doenças gastrintestinais de origem hídrica em humanos (LANE e LLOYD, 2002).
Quanto ao nome da espécie G. duodenalis ou G. intestinalis, Filice (1952) afirmou que intestinalis não seria válido por duas razões: o nome duodenalis fora o primeiro a ser atribuído por Davaine em 1875 e em nomenclatura científica deve-se respeitar a Lei
da Prioridade, e o nome intestinalis já havia sido anteriormente atribuído a outro organismo não estando portanto, disponível.
Lambl 1859 descrevera detalhadamente a Giardia encontrada em humanos denominando-a Cercomonas intestinalis; porém, este nome já havia sido precedido in totum pela transferência de Bodo intestinalis (Ehrenberg) para o gênero Cercomonas dujardin por Diesing (1850). De acordo com o Código Internacional de Nomenclatura Zoológica (antes de 1961), tanto o nome genérico como o específico dado por Lambl caiu em homonímia. O nome genérico Giardia proposto por Kunstler em 1882 foi aceito ao descrever Giardia em girino de anfíbio (THOMPSON, 1990).
Em 1875, Davaine descreveu uma forma de Giardia encontrada em coelho e denominou-a de Hexamita duodenalis e devido a Lei da prioridade, este é o nome correto da espécie (THOMPSON, 1990).
Seis espécies de Giardia são reconhecidas com base nas características morfológicas e ocorrência nos hospedeiros (OLSON et al., 2004). A taxonomia atual desse protozoário ainda não está totalmente elucidada devido às inúmeras variações genéticas relacionadas à espécie Giardia duodenalis (MONIS e THOMPSON, 2003; OLSON et al., 2004). Estudos realizados em diversos países com a aplicação de procedimentos baseados na amplificação do DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), caracterizaram diretamente o parasito a partir de amostras fecais e ambientais (THOMPSON, 2004). Tais pesquisas elucidaram divisões genéticas na espécie G. duodenalis, demonstrando que essa não é uma espécie uniforme, mas um complexo de espécies que compreende uma grande variedade de genótipos que exibem diferenças na especificidade dos hospedeiros e são denominados como assembléias (THOMPSON,2004).
São considerados os seguintes grupos genotípicos: A, subdivido em AI, amplamente distribuído geograficamente e com grande potencial zoonótico e AII antroponótico, e B que compreende dois subconjuntos, III e IV dos quais apenas o segundo é específico para humanos (THOMPSON, 2004). Assim, dentro do que se conhecia como G. duodenalis pode-se incluir, no mínimo, oito genótipos: A e B, que provém de infecções humanas e, nestes grupos, somente dois subgenótipos apresentam potencial zoonótico: AI e BIII; C e D, originados de cães; E, proveniente de gado bovino e suíno; F, derivado de gatos; G, de ratos domésticos e o genótipo derivado de roedores silvestres (THOMPSON, 2004).
Embora os animais silvestres sejam suscetíveis à infecção com genótipos zoonóticos de G. duodenalis, existem poucas evidências de que essas infecções tenham sido as fontes de surtos de origem hídrica. Esses animais têm uma maior probabilidade de se tornarem infectados a partir da água contaminada com material fecal de origem humana ou, menos provavelmente, a partir de animais domésticos, o que serviria para amplificar os números dos isolados contaminantes originais (CACCIÒ et al., 2005).
Thompson (2004) ressalta que a transmissão de Giardia de humano a humano pode ocorrer indiretamente por meio da ingestão acidental de cistos em água ou alimentos contaminados, ou diretamente em ambientes nos quais os níveis de higiene estejam comprometidos, como centros de saúde, creches ou comunidades menos favorecidas economicamente. Após a ingestão dos cistos, a exposição aos ácidos estomacais e aos sais biliares estimula a excistação. Os trofozoítos atingem o intestino delgado, dividem-se por fissão binária e colonizam a sua superfície. Conforme passam pelo intestino delgado, encistam e são eliminados posteriormente nas fezes (MONIS e THOMPSON, 2003;
Os cistos de Giardia spp. são recobertos por uma parede composta de uma camada filamentosa externa de 0,3 a 0,5 μm, que contém proteínas e galactosamina, além de uma camada interna dupla (CAPIZZI-BANAS et al., 2002). Os trofozoítos são móveis, apresentam simetria bilateral, formato piriforme a elipsoidal, com dimensões que variam de 8-12 μm de comprimento e de 6-8 μm de largura. Apresentam superfície dorsal convexa e um disco adesivo na face ventral, responsável pela adesão do protozoário ao epitélio intestinal; estes organismos vivem na superfície do lúmem intestinal. São binucleados, com quatro pares de flagelos e um par de corpos medianos distintos (THOMPSON, 2004).
2.1.2. Cryptosporidium spp.
O protozoário Cryptosporidium spp. pertence ao Filo Apicomplexa e ocorre na maioria das espécies de vertebrados (TZIPORI e WARD, 2002; FAYER, 2004). Esse gênero está relacionado aos coccídios, grupo composto por protozoários de importância para a medicina humana e veterinária (LEVINE, 1990). Entretanto, estudos moleculares recentes sugerem que Cryptosporidium tem afinidade filogenética com as gregarinas devido às semelhanças encontradas nos estádios do ciclo de vida (CARRENO et al., 1999; FAYER, 2004). Atualmente, são reconhecidas 16 espécies de Cryptosporidium: C. hominis, C. parvum, C. andersoni, C. muris, C.suis, C. felis, C. canis, C. bovis, C. wrairi, C. baileyi, C. meleagridis, C. galli, C. serpentis, C. saurophilum, C. molnari, C. scophithalmi (CACCIÒ et al., 2005; SUNNOTEL et al., 2006).
Dessas espécies, sete delas estão relacionadas com a doença humana (C. hominis, C. parvum, C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. suis e C. muris) além de dois genótipos, o de macaco e o de cervídeos (CACCIÒ et al., 2005).
No caso de C. parvum, é importante ressaltar que essa parece ser a espécie que apresenta menor especificidade de hospedeiro uma vez que foi identificada em camundongos, gados, humanos, cavalos e outros hospedeiros mamíferos (FAYER, 2004). Recentemente, foi proposta a criação de uma nova espécie, C. pestis, para designar o genótipo bovino de C. parvum, entretanto, ainda há controvérsias em relação à sua nomenclatura (SLAPETA, 2006).
Xiao et al. (2006), em resposta à Slapeta (2006) que propôs a mudança de nomenclatura, argumentam que, no simpósio “A taxonomia do gênero Cryptosporidium” haviam sido propostos alguns requerimentos para designar uma nova espécie (tais como os dados de tamanho e morfologia dos oocistos, caracterização genética, a verificação, quando possível, da especificidade de hospedeiro tanto naturalmente quanto experimentalmente) e seguir as regras da “International Code of Zoological Nomenclature”. Segundo tais autores, a nomenclatura de C. pestis não seguiu esses critérios enquanto Slapeta (2006; 2007) contra argumenta que a ultra-estrutura, genética e biologia dessa nova espécie já foram bem caracterizadas, justificando assim a sua criação.
O ciclo de vida do protozoário inicia-se com a ingestão do oocisto pelo hospedeiro: dez oocistos ou menos podem induzir infecção, como foi registrado em pesquisa realizada com voluntários adultos (TZIPORI e WARD, 2002). Após a excistação, quatro esporozoítos são liberados no intestino e invadem as células epiteliais do trato gastrointestinal e trato respiratório. Os estádios subseqüentes são intracelulares, mas extracitoplasmáticos, pois o parasito localiza-se na superfície da microvilosidade da célula epitelial hospedeira. É importante ressaltar que essa localização específica do
proteção da resposta imunológica do hospedeiro assim como do ambiente hostil do intestino, enquanto pode ter acesso às reservas nutricionais e energéticas. Além disso, ele permanece em um vacúolo parasitóforo circundado por uma membrana que permite a entrada de nutrientes da célula hospedeira para o parasito (TZIPORI e WARD, 2002).
O desenvolvimento assexuado realiza-se por meio de duas gerações sucessivas de merogonia, liberando oito e quatro merozoítos, respectivamente. Os quatro merozoítos liberados da segunda merogonia dão origem aos estádios de desenvolvimento sexuado, os micro e macro-gamontes os quais, após unirem-se, dão origem ao zigoto. Em seguida, esse zigoto sofre duas divisões, completando o ciclo com a formação do oocisto (TZIPORI e WARD, 2002; FAYER, 2004). Dois tipos de oocistos são formados: os de parede fina, responsáveis pela autoinfecção do hospedeiro (cerca de 20% da produção total) e os de parede espessa, liberados nas fezes ou no trato respiratório, resistentes às condições ambientais adversas (equivalente a 80% do total) (MONIS e THOMPSON, 2003).
Os oocistos apresentam um tamanho pequeno (3,0 a 8,5 µm) e formato esférico ou oval contendo quatro esporozoítos no seu interior, alongados e dispostos com formato de meia-lua (FAYER, 2004). A parede externa do oocisto, que circunda os esporozoítos, proporciona proteção sob condições extremas de temperatura e umidade por vários meses, especialmente nos países de clima temperado, nos quais a temperatura em rios e lagos permanece baixa durante o ano todo, mas acima da temperatura de congelamento da água, fazendo com que essas formas permaneçam infectantes (FAYER, 2004), mesmo após longo tempo de exposição ao ambiente.
2.2 – Doenças de Veiculação Hídrica: Surtos de Giardiose e de Criptosporidiose
A partir do primeiro surto de origem hídrica documentado e relatado em 1965, em Aspen, Co (EUA), ocorreu um total de 148 relatos de surtos de giardiose por veiculação hídrica nos Estados Unidos (em água para consumo humano e recreacional), com 30.009 casos confirmados até 2002 (Oliveira, 2005).
Quanto à criptosporidiose, o primeiro surto documentado por veiculação hídrica ocorreu no Texas (EUA) em 1984, tendo 2.006 casos estimados, causado por consumo de água de poço contaminada por esgoto doméstico (D’ANTONIO et al., 1984). De 1984 a 2002, 69 surtos de criptosporidiose foram relatados nos Estados Unidos afetando cerca de 436.232 pessoas, incluindo águas destinadas ao consumo humano e recreacionais como formas de transmissão(Oliveira, 2005).
Contaminação em água de abastecimento por Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em cidades da Rússia, como causadores de diarréias, foi relatado. Enquanto giardiose é rotineiramente diagnosticada na Rússia, dados de prevalência de criptosporidiose são escassos, pois o monitoramento em águas de abastecimento é limitado. Devido a esse quadro, uma pesquisa foi realizada na cidade de Cherepovets e outras sete cidades do país. Os resultados demonstraram a contaminação das águas pela presença destes protozoários ( naturais: 26,0 % positivas para Cryptosporidium e 30,0 % para Giardia; águas tratadas: 6,0 % positivas para Cryptosporidium e 7,0 % para Giardia). A resistência destes parasitos aos desinfetantes em águas naturais e águas tratadas foi meta desta pesquisa, devido ao número significativo de casos de diarréias nestas cidades (ERGOROV et al., 2002).
Craun et al. (2005) fizeram uma revisão das causas dos surtos de veiculação hídrica associadas às águas recreacionais nos Estados Unidos no período de 1971 - 2000, estudando a etiologia (bactérias ou protozoários). Giardia foi identificada em 6,0 % destes, e Cryptosporidium em 15,0 % dos epidódios associados às águas de piscinas para adultos e piscinas de crianças. Fatores como manutenções inadequadas, desinfecção e filtração foram consideradas nessa avaliação.
No Canadá, no período de 1974 a 2001, 288 surtos foram relacionados a água de consumo humano. Dentre os organismos encontrados, Giardia spp. foi causadora de 51 surtos e Cryptosporidium spp. foi responsável por aproximadamente 10 surtos. Muitos fatores foram relacionados e documentados como tendo contribuído nesses surtos: por exemplo, em de Walkerton, Ontário (2000), múltiplos fatores como uma combinação de chuvas intensas, presença de bactérias patogênicas no meio ambiente, tratamento inadequado da água associado ao erro humano, culminaram neste surto (SCHUSTER et al., 2005).
Smith et al. (2006) relataram 89 surtos de gastroenterite por veiculação hídrica, onde 4.321 pessoas foram afetadas na Inglaterra e país de Gales, no período de 1992 a 2003. Dentre os microrganismos identificados como causadores dos surtos, Giardia foi responsável por 2,0 % destes, encontrada em águas de propriedades privadas e piscinas. Cryptosporidium foi responsável por 61,0 %, e ocorreram em sistemas de abastecimentos públicos, privados, piscinas e origens não identificadas. Desta forma, providências como notificações a estes sistemas, e prevenção com adequação do tratamento da água foram adotadas.
Na Noruega, a giardiose é uma doença de notificação compulsória: 300 a 400 casos são normalmente informados anualmente com aproximadamente 8,5 casos por 100.000 pessoas, a maioria das quais alegam ter adquiridas tais infecções fora do país. Entretanto, em 2004, na cidade de Bergen mais de 1.500 casos de giardiose foram relatados associados aos surtos de veiculação hídrica. A criptosporidiose não é uma infecção relatada na Noruega, a menos quando associada ao diagnóstico de AIDS (ROBERTSON et al, 2006).
Cabe ressaltar o surto de criptosporidiose na cidade de Seneca Falls (New York), em um parque turístico, ocorrido em agosto de 2005, associado à água utilizada nas plataformas com sensores que liberam jatos d´água na forma de “spray” quando da passagem do turista. Foi notificada pelo sistema de saúde a ocorrência de aproximadamente 4.000 casos de doenças possivelmente relacionadas a esse sistema “spray” em 37 municípios no Estado de Nova York. Foram confirmados 743 casos de criptosporidiose, com sintomologia característica. Amostras foram coletadas na fonte de água potável próximo ao sistema “spray”, na área da praia, nos tanques de reservação do sistema “spray” e no filtro de água de retrolavagem para esse sistema. Todas essas amostras foram negativas para Giardia. Os oocistos foram encontrados no reservatório desse sistema (30 a 50 oocistos/L; e 222/100mL de E. coli) e no filtro de retrolavagem (30 oocistos/L). No efluente do tanque séptico, encontrou-se 8 x 104 oocistos /L. As amostras na área da praia foram negativas. Quanto aos oocistos do tanque de reservação, do efluente séptico e amostras clínicas, foram identificados como C. hominis, comprovando uma contaminação de origem humana. Nessa época, não haviam normas estabelecidas para controle dessas instalações recreacionais. Atualmente, novas normas já vigoram para que
esse controle ocorra, incluindo tratamento de desinfecção com luz ultravioleta (UV) (SLATER et al., 2006).
2.3 – Métodos para avaliação da presença de Giardia spp. e Cryptosporidium spp.
Na última década, o monitoramento da presença de protozoários na água foi espontaneamente introduzido em países como USA, Inglaterra e Austrália. Os dados obtidos empregando o método “ICR – Information Collection Rule - Protozoan Method for detecting Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in water by fluorescent antibody procedure” (USEPA 1995) apresentava muitas desvantagens, tais como: complexidade técnica, baixas taxas de recuperação, resultados falso-negativos e falso-positivos (CLANCY et al, 1999; ALLEN et al, 2000; FRANCO et al., 2001a; CBH-PCJ, 2002).
Em 1996, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) iniciou um programa com o objetivo específico de identificar métodos analíticos para o monitoramento de Cryptosporidium e Giardia em amostras de águas. Os métodos 1622 e 1623 (USEPA 1998; 1999) foram desenvolvidos em resposta a essa iniciativa. A inclusão de novos procedimentos de filtração, como a utilização de cápsulas de filtração (Envirocheck®; Gelman Sciences) ou de eluição, como a separação imunomagnética (IMS) dos oocistos e cistos (Dynalbeads®; Dynal Technologies, Austrália), acarretou um aumento significativo da performance do Método 1623 (USEPA, 1999) com eficiência de recuperação de 19,5 % a 54,5 % (MCCUIN e CLANCY, 2003; FRANCO, 2004).
Os métodos de recuperação e detecção de protozoários na água envolvem 3 passos: filtração da amostra de água com a finalidade de recuperar ou capturar os parasitas (cistos e oocistos); eluição e concentração e, visualização por microscopia de imunofluorescência (JAKUBOWSKI et al., 1996).
Inicialmente, para filtração, foram usados filtros de cartucho de polipropileno de porosidade de 1μm. Eram utilizados grandes volumes de água (1.000 L para água da saída dos filtros e 100 L para água bruta). A eluição era conduzida com detergente e mediante a extração mecânica dos oocistos ou cistos a partir das fibras do filtro. Para a etapa de purificação, o uso de sacarose ou Percoll- sacarose e visualização mediante a RID (reação de imunofluorescência direta). Tal metodologia apresentava limitações, como: não fornecer informações sobre a espécie ou a infectividade das formas de resistência dos protozoários, resultados falsos positivos e negativos, grande variabilidade e baixa eficiência de recuperação, variando de 14,0 % a 44,0 % (MUSIAL et al, 1987; JAKUBOWISKI et al., 1996).
A técnica de filtração em membranas (MF), empregada por Aldom e Chagla em 1995, foi desenvolvida para detecção de oocistos e cistos em água tratada e, atualmente, este método também é considerado para determinação destas formas em água bruta. Consiste na captura dos oocistos em membranas de acetato de celulose, seguida de eluição por dissolução da mesma em acetona e etanol ou extração mecânica, considerando os diferentes protocolos. A turbidez da água é o maior fator limitante, pois pode ocorrer rápida obstrução da malha filtrante, com conseqüente redução do volume efetivamente filtrado. A influência do método de eluição diminui a infectividade a cada etapa na dissolução em
acetona (CARRENO et al, 2001) e, dependendo do método empregado para eluição, perdas são consideradas. A média de recuperação é de cerca de 70,5 % (ALDOM e CHAGLA, 1995).
A técnica de floculação foi proposta como método de concentração de volumes de 10 L de água por precipitação e floculação química com carbonato de cálcio (VESEY et al, 1993). Em uma primeira etapa, são adicionadas soluções de cloreto de cálcio e bicarbonato de sódio aos volumes de até 10 L de amostra; a seguir, o pH é ajustado para 10,0 (com hidróxido de sódio) sendo a preparação mantida em repouso por um período de, no mínino 4 horas ou “overnight” em temperatura ambiente. O precipitado é dissolvido com ácido sulfâmico, a suspensão obtida é centrifugada e analisada por RID. O sedimento resultante é extremamente rico em material particulado, interferindo na RID, acarretando dessa forma resultados falso-positivos. As variações nas concentrações dos reagentes e do pH causam uma diminuição do número de organismos floculados. Também não fornece informações sobre a espécie ou infectividade. A eficiência de recuperação está entre 30,0 % a 40,0 % (FRICKER e CRABB, 1998; FRANCO et al., 2001a; CANTUSIO NETO, 2004).
Cabe ressaltar que apesar das técnicas de biologia molecular, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR – polymerase chain reaction) (STINEAR et al., 1996) e a determinação da infectividade através de cultivo de Cryptosporidium em monocamadas celulares (SLIFKO et al., 1997) terem sido propostas, o ensaio de microscopia de imunofluorescência continua sendo o mais utilizado no monitoramento. Quanto à biologia molecular, ela apresenta a vantagem da determinação da espécie do protozoário e embora a infectividade possa ser avaliada por meio do cultivo do protozoário Cryptosporidium spp.
em células esta metodologia não pode ser aplicada para Giardia spp. em função deste não ser um protozoário invasivo.
Medema et al. (1998) avaliaram a citometria de fluxo como método alternativo para detecção destes protozoários em grandes volumes de água e análise de imunofluorescência em até 2 horas. Porém, o seu uso é limitado custo do equipamento utilizado.
O desempenho para cada método utilizado, principalmente para águas brutas superficiais, é afetado por vários fatores que impõem limitações como: não fornecer informações sobre espécie ou infectividade; sofrer interferência direta da turbidez da água implicando no volume a ser filtrado e ser influenciado pelo teor de íons de ferro que são comumente encontrados nas amostras hídricas devido à adição de floculantes utilizados nos sistemas de tratamento (etapa de coagulação). O método 1623 prevê o uso de separação imunomagnética para promover a separação dos cistos e oocistos e partículas não-alvos, utilizando para isto, partículas magneticamente reagentes cobertas com anticorpos específicos, direcionados contra a parede dos oocistos e cistos, bem como a utilização do corante nuclear DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) para visualização de estruturas internas dos cistos e oocistos como critério adicional ao Contraste de Fase para confirmar a identificação (USEPA, 2001).
No Brasil, Tomps (1998) utilizou os métodos de dissolução da membrana filtrante e floculação com carbonato de cálcio para concentração de oocistos de Cryptosporidium em água para consumo humano no município de São Paulo/SP e relatou que em ambos os métodos, a positividade foi de 50,0 %.
Gamba et al. (2000) verificaram a presença de oocistos de Cryptosporidium spp. utilizando o método de floculação com carbonato de cálcio, em amostras de água subterrânea, no município de Itaquaquecetuba/SP.
O procedimento utilizado por Cantusio e Franco, 2004, foi a técnica de filtração em membranas. Esse método foi descrito por Aldom e Chagla (1995) que empregaram membrana de acetato de celulose para recuperação de oocistos de Cryptosporidium em amostras de água. Segundo estes autores, a média geral de recuperação foi de 70,5 % em amostras de água artificialmente contaminadas. Algumas modificações no método original foram introduzidas por Franco et al., 2001a, no desenvolvimento de uma metodologia mais acessível em termos de custos, mas que apresentasse taxas de recuperação similares. Estas alterações incluíram a redução do tamanho da membrana de 293 mm para 47 mm e, o procedimento de eluição foi realizado mediante a raspagem e lavagens sucessivas da superfície da membrana. Um dos critérios considerados foi a manutenção de um número mínimo de etapas laboratoriais com o objetivo de reduzir perdas. Embora as taxas de recuperação tenham variado de 25,3 % a 91,8 % (FRANCO e CANTUSIO NETO, 2002; CANTUSIO NETO e FRANCO, 2004) para diferentes tipos de água e de condições de experimento-controle, quando esta metodologia é aplicada à água bruta, as condições de turbidez desta interferem de forma que, usualmente, são filtrados pequenos volumes da amostra devido à obstrução dos poros da membrana.
Devido ao seu menor custo, quanto comparado com as outras metodologias, a técnica de filtração em membranas tem sido empregada (nos EUA) para a avaliação da eficiência de remoção de cistos e oocistos nas estações de tratamento, e em plantas-piloto (DUGAN et al., 2001; JAKUBOWSKI et al., 1996).
Hsu et al. (2001) avaliaram e compararam os métodos de concentração para Giardia e Cryptosporidium em água com filtro de cartucho de polipropileno, 1µm de porosidade nominal (5,2 organismos/ 100 L de água tratada e 14,4 organismos/ 100 L de água bruta) e, com filtração em membranas de policarbonato 142mm e 3 µm de porosidade (20,5 organismos/ 100 L água tratada e 259,3 organismos de água bruta), tendo esta, melhor performance pela alta recuperação.
DiGiorgio et al. (2002) testaram a relativa capacidade do uso de cápsulas de filtração (Envirochek® - Gelman), e performance do Método 1623, sob condições ambientais. Com alta turbidez, a cápsula Envirochek® (grandes volumes) foi mais eficiente na recuperação dos organismos, porém não foi possível filtrar volumes superiores a 10L. Quanto à recuperação de oocistos, esta foi significativamente mais alta para a cápsula de (Envirochek®)
Ware et al. (2003) avaliaram o método 1623, modificando o procedimento de dissociação da separação imunomagnética (dissociação ácida pela dissociação térmica), usando nesta etapa um período de incubação por 10 minutos a 80˚C, obtendo desta forma uma melhor performance na recuperação e confirmação de oocistos.
Cabe ressaltar que o único método validado pela USEPA é o 1623, porém, apesar de ter sido desenvolvido visando contemplar tanto amostras de águas brutas quanto tratadas, ele é utilizado especificamente para amostras de águas de consumo (CLANCY et al., 2003), devido à influência da turbidez da água dos mananciais. No entanto, procedimentos alternativos para a concentração inicial dos organismos são permitidos desde que sejam atestados os níveis similares de recuperação de organismos (CLANCY et al., 2003).
A Companhia de Tratamento de Água e Saneamento do Reino Unido Thames Water, considerada como referência mundial em tecnologia atual e por ser o único país a ter uma rigorosa legislação quanto à presença de Cryptosporidium spp. em água para consumo humano (DWI – Drinking Water Inspectorate, 2004), utiliza a tecnologia Genera Filta-Max (BUKHARI, 2000) para a etapa de filtração e concentração de protozoários em amostras de água, que foi validado no Método 1623, e é utilizado neste país. Esse sistema é composto por um filtro para capturar oocistos, constituído de múltiplas camadas de espuma comprimidas. Parte do princípio de uma armadilha para as partículas que são retidas desde o início do processo de filtração da amostra (volumes de até 2.000 L), sendo rapidamente recuperada pela descompressão e lavagem dessa matriz(PARTON et al., 1997). Para essa etapa do processo, são necessários equipamentos específicos (máquinas e filtros) o que acarreta altos custos, e seu uso é indicado para amostras de baixa tubidez, no caso, águas tratadas. No entanto, para amostras de água bruta, a técnica utilizada por esta companhia é a concentração por floculação com carbonato de cálcio e microscopia de imunofluorescência (Comunicação pessoal, 2005).
2.4. Controle de Qualidade Analítica dos Métodos
Resultados de ensaios laboratoriais são sempre elementos importantes para decisões, pois erros nos testes podem levar a equívocos na condução de problemas na área ambiental e consequentemente em saúde pública (BELLAMY, 2004). A elaboração de programas de qualidade analítica pode minimizar erros e aumentar o nível de confiança dos resultados laboratoriais. A proposta da estrutura para um controle de qualidade consiste em estabelecer metas de qualidade, desde um gerenciamento dos recursos humanos promovendo um treinamento atualizado e continuo da equipe de trabalho até a manutenção do laboratório e equipamentos (Figura 1). O Método 1623 possui uma seção de Controle de Qualidade que visa minimizar erros e promover dados confiáveis na análise de protozoários de veiculação hídrica (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.).
Desta forma, esse programa inclui a avaliação de manuais de uso, protocolos, instrumentos e equipamentos usados (calibração), qualidade dos reagentes, desempenho e treinamento dos analistas e também cartas controle (controle de qualidade interno e externo). Neste contexto, a análise mínima requerida nesse programa consiste em demonstrar a capacidade inicial do laboratório em realizar a análise, mediante os teste de precisão inicial e recuperação, de inoculação em matriz, controle negativo e controle de coloração, com demonstração continua desta capacidade.
RECURSOS HUMANOS TRABALHO LABORATORIAL COMUNICABILIDADE INTERNA / EXTERNA
Figura 1 - PROGRAM A DE QUALIDADE OPERACIONAL
CARGA DE TRABALHO EQUIPAMENTOS PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO REAGENTES COLETA DE AMOSTRAS CODIFICAÇÃO CONDIÇÕES DE TRANSPORTE RASTREABILIDADE IDENTIFICAÇÃO MANUSEIO ESPECIFICAÇÕES REGISTRO DE MANUTENÇÃO MANUSEIO ARMAZENAMENTO ORGANIZAÇÃO INFORMAÇÃO LIMPEZA ESPAÇO QUALIDADE PROFICIÊNCIA TREINO SEGURANÇA EDUCAÇÃO CONTINUADA EXPERIÊNCIA COMUNICAÇÃO
2.4.1. Precisão Inicial e Recuperação
A precisão inicial é determinada mediante a contaminação artificial de amostras de água reagente (n=4), com suspensões contendo um número conhecido de cistos e oocistos, usualmente com variação entre 100 a 500 organismos; estas amostras são processadas com o mesmo protocolo adotado no laboratório, baseado nas etapas de filtração, eluição, concentração, purificação, coloração e visualização de protozoários em amostras de água. Processa-se também uma amostra de água reagente livre de contaminação artificial que é considerado como controle-negativo e cujo resultado atestará as boas condições vigentes no
laboratório, pela ausência de contaminação quando processadas várias amostras. Usando os resultados gerados por estas 4 amostras, são calculados: i) a média da
porcentagem de recuperação dos protozoários e ii) o coeficiente de variação (CV, expresso como desvio padrão relativo máximo) e, efetuadas comparações ao padrão estabelecido (24 % a 100 % de recuperação para ambos os organismos, Cryptosporidium spp. e Giardia spp.). Se a média calculada e o CV estiverem dentro deste critério de aceitação, a performance do sistema é considerada aceitável e as análises de rotina podem ser iniciadas. Caso contrário, uma média abaixo do padrão, caracteriza uma performance do sistema inaceitável e o problema deve ser corrigido e o teste de precisão inicial deve ser repetido até estarem entre os limites aceitáveis (BELLAMY, 2004). Nestes ensaios de precisão inicial, atesta-se a habilidade de execução do método, livre de interferências da matriz, como por exemplo, a turbidez da amostra de água a ser analisada.
2.4.2. Inoculação em Matriz de água bruta
Nesta etapa, procede-se à contaminação artificial de uma alíquota da amostra de água bruta (de campo) com uma quantidade conhecida de cistos e oocistos, marcados com um fluorocromo diferente daquele empregado na etapa de visualização dos cistos e oocistos, para avaliar o efeito dessa matriz sobre a recuperação dos mesmos. Este procedimento deve ocorrer a cada 20 amostras de campo analisadas. Essas amostras, inoculadas ou não, devem ser processadas de acordo com o protocolo adotado (filtração, eluição, concentração, purificação, coloração e visualização) no laboratório para processar as amostras.
As recuperações obtidas nesta etapa devem estar dentro dos limites estabelecidos (13 – 111% para Cryptosporidium spp. e 15 – 118% para Giardia spp.). Da mesma forma como na precisão inicial, após análise de 5 experimentos inoculados, é feito o cálculo da média de porcentagem de recuperação e do desvio padrão. A precisão aceita pode ser expressa através do intervalo obtido da média de recuperação, mais ou menos dois desvios-padrão.
2.4.3. Diagnóstico e localização de erros
Se os resultados obtidos nas etapas acima descritas estiverem fora dos limites estabelecidos e a causa não for determinada, alguns procedimentos analíticos podem colaborar para uma melhora na performance dos procedimentos adotados, tais como:
a) checagem do sistema de microscopia e o anticorpo analisado, verificando a iluminação do microscópio e examinando alíquotas da suspensão controle positivo presentes nos kits comerciais de anticorpos monoclonais, observando que mais de 50% dos cistos e oocistos apresentem fluorescência compatível com os padrões previamente estabelecidos;
b) a etapa de purificação pela separação imunomagnética, através da inoculação de 100 a 500 organismos em 10 mL de água reagente e processando esta amostra através da separação imunomagnética, e visualização;
c) as etapas de filtração, concentração e eluição, através da contaminação artificial em água reagente e execução das etapas acima, seguidas da visualização mediante a reação de imunofluorescência direta, observando-se a integridade de cistos e oocistos durante a leitura das lâminas.
Estes critérios de avaliação devem ser correntemente aplicados e constantemente avaliados pelos laboratórios (CLANCY et al., 1999; LINDQUIST et al., 1999).
3 – Objetivos:
O presente trabalho tem como objetivos:
• Investigar e comparar o desempenho dos métodos de filtração em membrana de ésteres mistos de celulose (FM) e de floculação com carbonato de cálcio (FCC), quando aplicados em amostras de água artificialmente contaminadas com cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium (água reagente e em amostras naturais com turbidez significativa).
• Avaliar se a adição de separação imunomagnética (IMS) na etapa de purificação acarreta maior eficiência de recuperação de organismos em condições de experimentos controle (água artificialmente contaminada e apresentando turbidez significativa) e, em amostras naturais (água bruta superficial do rio Atibaia).
• Verificar a aplicabilidade do método de filtração em membranas e de floculação com carbonato de cálcio para detectar a presença de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia em amostras de água bruta superficial do rio Atibaia, na cidade de Campinas.
4. Material e Métodos
4.1. Local do estudo
O estudo foi realizado no Laboratório Central da Sociedade de Abastecimento de Água e Saneamento S/A - SANASA, localizado na cidade de Campinas, no parque da Estação de Tratamento de Água 1 e 2 (S 22º55’44.6” / W 47º02’14.4”) (Figuras 2 e 4).
Esta ETA foi inaugurada em 02 de maio de 1936, em homenagem ao engenheiro Cyro de Carvalho Lustosa, a quem se deve sua construção, situada à rua Abolição nº 2375, no bairro Swift. Com capacidade inicial de 300 L/s com água aduzida do Rio Atibaia através da adutora de recalque de água – ARA1, contava inicialmente com 2 decantadores e 5 filtros. A partir de 1953, houve aumento de sua capacidade de adução com a construção da ARA 2 e de tratamento (com a construção de mais um decantador e dois filtros). Em 1968, outro aumento da capacidade de adução com a construção da ARA3 e a construção de uma nova ETA, ao lado da ETA 1, a ETA Alfredo Sizenando P. Ribeiro (ETA 2).
A captação de água para o tratamento é feita no rio Atibaia (Figura 2) no ponto em que este mais se aproxima da cidade de Campinas, às margens da rodovia Dom Pedro I, sendo um rio com vazão média e classificado, de acordo com o Decreto 10.755/77, como um rio de classe 2. Este manancial é responsável pelo abastecimento das ETAs 1 e 2 (figura 4), bem como das ETAs 3 e 4 da SANASA, que juntas tem uma vazão aproximada de 4.100 L/s de água tratada.
O rio Atibaia está inserido na Bacia Hidrográfica do Piracicaba, Capivari e Jundiaí (Figura 3).
É uma ETA com tratamento convencional, uma vez que utiliza como floculadores chicanas de fluxo horizontal, que não necessitam de energia elétrica; porém a lavagem normal e periódica é obrigatória, assim como os decantadores que não tem removedores de lodo automáticos.
Este tipo de tratamento inclui as etapas de coagulação-floculação, seguida de decantação, filtração e desinfecção.
Neste estudo, as coletas de amostras de água reagente (Milli-Q) foram realizadas no próprio Laboratório de Microbiologia/Sanasa/Campinas, e as de água bruta foram feitas na chegada destas ETAs, nas Adutoras provenientes da captação da água do rio Atibaia. Estas ETAs são responsáveis por 95% do abastecimento da cidade, sendo captado um volume médio diário de 296.157m3 do rio Atibaia, para atendimento de uma população aproximada de 1.059.420 de habitantes (IBGE, 2006).
Figura 2: Bacia Hidrográfica dos rios Piracicaba, Capivari e Jundiaí, com destaque da Região Metropolitana de Campinas.
Figura 4 – Estações de Tratamento de Água 1 e 2, Sanasa, Campinas (vista aérea). Ponto de Colheita
4.2. Delineamento Amostral
O estudo foi conduzido primeiramente com um teste inicial do protocolo (IMS) e conduzido posteriormente em duas etapas, como segue:
4.2.1. Teste Inicial de Eficiência da Separação Imunomagnética (IMS).
Este foi o procedimento inicial aplicado como teste de eficiência para se verificar o manuseio dos equipamentos e processos na etapa de purificação com o uso da Separação Imunomagnética, como segue: foi usado um inóculo Easy Seed®, contendo 100 ± 1 DP oocistos e cistos em 10 mL de água Milli-Q, e imediatamente aplicada a separação imunomagnética, empregando o Kit comercial Dynabeads® GC-Combo (Dynabeads anti – Crypto e anti – Giardia), de acordo com o protocolo do fabricante.
4.2.2. Primeira Etapa: Estudo da Performance dos Métodos de Filtração em Membranas (FM) e Floculação em Carbonato de Cálcio (FCC).
Um total de 52 experimentos foi conduzido, incluindo os ensaios controles-negativos e positivos com água reagente, no período de outubro de 2005 a junho de 2006, com a finalidade de averiguar o desempenho dos métodos propostos neste estudo: Filtração em Membrana (FM) e Floculação com Carbonato de Cálcio (FCC), aplicando-se ou não uma etapa de purificação mediante o uso da separação imunomagnética (IMS), após o procedimento de eluição (Figura 5).
4.2.2.1. Amostras de água reagente Milli-Q, inoculadas artificialmente, empregando-se Easy Seed®, sem e com a etapa de purificação por IMS.
Para isto, foram coletados 10 L de água reagente (Milli-Q) para cada processamento das metodologias de FM e FCC, respectivamente e, foram inoculados empregando-se os frascos com suspensões de oocistos e cistos (Easy Seed®, Biotecnology Frontiers, Austrália) adquiridas comercialmente, e processadas de acordo com os procedimentos descritos no item 4.2.4.1. Após a inoculação, as amostras (n=4) foram homogeneizadas em seu volume total, e deixou-se um tempo de contato de duas horas, entre organismos e água. Logo após esse período, deu-se o prosseguimento da análise de acordo com o método utilizado.
4.2.2.2. Ensaios com água bruta superficial, inoculadas artificialmente, empregando-se Color Seed®.
Nestes ensaios foram utilizadas amostras de água bruta do rio Atibaia (1L e 10L), e foram empregadas suspensões purificadas de cistos e oocistos, adquiridas comercialmente (ColorSeed®, Biotecnology Frontiers, Australia), e processadas de acordo com os procedimentos descritos no item 4.2.4.2. Após a inoculação, as amostras foram homogeneizadas em seu volume total, e deixou-se um tempo de contato de duas horas, entre organismos e água. Logo após esse período, deu-se o prosseguimento da análise de acordo com o método utilizado.
