Controle Utilizando Água Reagente

Atestada a habilidade em executar a separação imunomagnética, os próximos passos consistiram na verificação da performance do método escolhido, com a finalidade de comprovar a sensibilidade das metodologias na ausência de fatores interferentes e inerentes à matriz (como a turbidez) e avaliar a variabilidade intralaboratorial dos resultados, entre diferentes ensaios. Para isso, foram usadas quatro amostras de água reagente inoculadas com um número conhecido de cistos e oocistos, isto é, a suspensão Easy Seed®, adquirida comercialmente na empresa BTF Pty Ltda., North Ryde, Austrália.

Nesse contexto, o método de FCC, incluindo ou não a etapa de purificação por IMS, alcançou uma baixa recuperação (2,0 % a 11,0 % para cistos de Giardia spp. e de 2,0 % a 8,0 % para Cryptosporidium spp. sem IMS e, de 2,0 % a 5,0 % para cistos de Giardia spp. e 1,0 % a 6,5 % para Cryptosporidium spp. quando utilizado o IMS). Resultados de recuperação variáveis são relatados na literatura quando a FCC é empregada. Quando oocistos foram semeados em água destilada, baixas porcentagens foram observadas como valores de recuperação menores que 10,0 % alcançando o máximo de 23,0 % (FARIAS, 2002; NIEMINSK et al., 1995; SKERRET et al., 2000; GREINERT et al., 2004).

Neste estudo, a eficiência de recuperação não apresentou uma melhora nos resultados mesmo quando acrescida a etapa de purificação por IMS após a concentração por FCC, sendo inclusive, que melhores valores recuperados de Giardia spp. e Cryptosporidium spp., foram obtidos sem a etapa de purificação por IMS (Tabelas de 1 à 4).

Algumas hipóteses podem explicar esta baixa recuperação: devem-se levar em consideração os danos causados nas paredes dos organismos, ocasionados durante a etapa da concentração para obtenção do precipitado, na floculação química. O uso de sais os quais promovem a precipitação com a alta elevação do pH ocorre na forma de: bicarbonato, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio e, quando adicionado o ácido sulfâmico, essas espécies químicas são solubilizadas, ocorrendo uma forte reação de efervescência proveniente da liberação de gás carbônico. Sabe-se que, a caleação (aplicação de cal/hidróxido de cálcio) visa à inativação de patógenos presentes em amostras de lodo de esgoto, utilizado na agricultura (MIGNOTTE-CADIERGUES et al., 2001). Assim, por inferência, a geração desta substância durante a precipitação química que ocorre na FCC pode ser responsável por danos aos cistos e oocistos de uma forma que tenha dificultado o seu reconhecimento durante o processo de visualização por IFA, ou ainda, podendo interferir de maneira negativa na adesão do anticorpo aos epítopos presentes na parede dos organismos danificados. As várias centrifugações exigidas na etapa de concentração durante a floculação constituem outro fator que pode ter acarretado a baixa eficiência de recuperação de cistos e de oocistos quando inoculados na água reagente (MIGNOTTE- CARDIEGUES et al, 2001; GREINERT et al., 2004).

Qualquer variação na velocidade ou tempo de centrifugação, acarretam perdas de oocistos no sobrenadante, mesmo em amostras naturais (VESEY et al., 1993; YAMASHIRO e FRANCO, 2007).

O pH é um dos fatores mais importantes na floculação, pois influencia diretamente a ação do agente floculante, permitindo a formação completa do floco ou não. Nesta etapa, a exposição dos cistos e oocistos a um pH=10,0, com permanência mínima de 4 horas, afeta a

excistação desses organismos em até 75,5 %, quando usado a FCC (CAMPBEL, 1994). Embora a excistação in vitro meça a habilidade do protozoário em completar apenas uma etapa do seu ciclo de vida, e não seja um método indicado para verificar a infectividade destes organismos, sugere um grau de injúria produzido nestas formas infectantes. Ressalte- se que este método de concentração não é indicado quando se pretende avaliar posteriormente, a infectividade ou ainda observar a genotipagem do parasito (KARANIS e KIMURA, 2002; APHA, 2005).

Quando comparada à FCC, a FM gerou melhores porcentagens de recuperação nos ensaios com água reagente, onde a etapa de purificação por IMS não foi aplicada. Cabe ressaltar que quando a etapa de purificação por IMS foi realizada, esta não acarretou maiores valores significativos de recuperação (Tabelas de 1 a 4).

Farias (2000) obteve 22,0 % de recuperação de oocistos de Cryptosporidium spp. em água destilada filtrada em membrana de 142 mm. McCuin e Clancy (2003) obtiveram porcentagens de recuperação em água reagente de 45,4 e 61,3 % para cistos e oocistos, respectivamente, utilizando o método de filtração por Filta Max® para a etapa de concentração.

Porcentagens maiores de recuperação foram obtidas, em experimentos com água destilada concentrada por filtros de polipropileno, seguido da etapa de purificação por IMS: 17,6 % (5,2 a 28,2 %) para oocistos de Cryptosporidium spp e 41,5 % (25,5 a 57,5 %) para cistos de Giardia spp. (CARMENA et al, 2007).

Considerada a variabilidade dos resultados acima mencionados, deve-se ressaltar que a composição da membrana é um fator relevante: membranas compostas por acetado de

spp., enquanto que cistos de Giardia spp. foram melhor recuperados, quando a filtração foi feita com membranas compostas de nitrato de celulose (SHEPHERD e JONES, 1996).

Wohlsen et al. (2004) obtiveram médias de recuperação para oocistos de Cryptosporidium spp. variando entre 6,0 e 29,0 % e, de 20,0 a 30,0 % para cistos de Giardia spp. mediante à aplicação da etapa de concentração por FM, usando membranas mistas de ester de celulose.

Resultados de recuperação desses protozoários considerados satisfatórios (91,8 % para Giardia spp. e 41,6 % para Cryptosporidium spp.) foram obtidas utilizando membranas de acetato de celulose, para a filtração de amostras de água superficial e mineral (FRANCO et al., 2001a; FRANCO e CANTUSIO NETO, 2002).

Além dos diferentes tipos de matriz, a escolha do método de eluição é outro fator que contribui para a variabilidade dos resultados (SHEPHERD e JONES, 1996). Quando comparado os protocolos de eluição por extração mecânica e lavagens da superfície da membrana e eluição por meio da dissolução de membrana em acetona, melhores resultados para recuperação de cistos e oocistos foram observados quando a eluição foi realizada pelo primeiro método: 20,0 % a 91,8 %, contra 4,0 % a 36,0 % obtido pela dissolução em amostras de água bruta inoculadas (FRANCO et al., 2001b).

Quando aplicada a purificação por IMS, outra variável a ser considerada é o kit utilizado no que diz respeito à captura do parasito pelo anticorpo o que afeta diretamente os valores de recuperação (REYNOLDS et al.,1999). Hsu et al. (2000) demonstraram que fatores tais como a idade dos oocistos ou cistos, e também a maneira como é feita a técnica de contaminação artificial das amostras de água podem desempenhar um importante papel

na recuperação dos organismos, bem como a presença de fragmentos inorgânicos que podem interferir na contagem dos organismos.

É comum aos trabalhos acima citados, a grande variação nos valores de recuperação destes protozoários quando utilizada água reagente como matriz. Assim, as porcentagens obtidas neste estudo encontram-se de acordo com os achados de outros autores que usaram a mesma matriz para experimentos controles (SARTORY et al., 1998; HSU et al., 2000).

Considera-se que a variabilidade dos resultados é inerente aos diferentes métodos, como também a baixa reprodutibilidade, pois, um mesmo laboratório alcança valores distintos em diferentes ensaios (FRICKER e CRAB, 1998; COOK et al., 2006).

Quanto aos melhores resultados obtidos de recuperação para Giardia spp. comparativamente aos dos oocistos de Cryptosporidium spp., pode-se sugerir que devido ao maior tamanho, há maior facilidade de visualização destes durante a leitura das preparações. Além disso, em função do menor tamanho e da carga superficial negativa, os oocistos podem ficar fortemente aderidos à matriz filtrante devido às pressões exercidas durante a filtração (FALK et al.,1998) e as interações eletrostáticas entre oocistos (negativo) e a superfície da membrana (positiva).

No entanto, a realização de ensaios empregando água reagente e suspensões de cistos e oocistos é extremamente importante, pois os resultados atestam a capacidade do laboratório em executar a análise na ausência de qualquer fator interferente e inerente à matriz. Recomenda-se que estes resultados sejam exigidos quando da implantação destas análises em um laboratório.

laboratórios, entre os analistas e entre os vários tipos de água. Essas variações são originadas nas pequenas diferenças que ocorrem nos procedimentos e nas propriedades físico-químicas das amostras de água (WARNECKE et al, 2003).

Baseado no desempenho do teste da precisão inicial e recuperação, segundo o Método 1623 (USEPA, 2005) aplicado em água reagente, e estabelece um critério de aceitação de 24 a 100 % tanto para Cryptosporidium spp. quanto para Giardia spp. Neste estudo, as médias obtidas com FM e FCC nesta etapa estão fora deste critério, sendo que apenas a recuperação de cistos com FM mostrou-se dentro deste critério aceitável (25,0 %). Vale ressaltar que os valores das médias de recuperação obtidas com FM estão próximos ao mínimo aceitável (com ou sem o uso do IMS). Se analisados os experimentos de forma individual, 50,0 % deles realizados com FM apresentaram recuperação dentro desta faixa de aceitação, fato não ocorrido quando as amostras foram analisadas com FCC (Tabela 1 a 4).

O valor máximo do desvio padrão relativo (DPR) estabelecido quando avaliado a recuperação de Cryptosporidium spp. em água reagente é de 55,0 % e 49,0 % para Giardia spp. Para este último protozoário esse valor foi excedido quando aplica as duas metodologias sem a etapa de purificação por IMS, porém com critério aceitável quando utilizada a etapa de purificação. Nos experimentos de recuperação de oocistos, o valor do DPR só foi excedido quando avaliada a metodologia de FCC seguida da purificação por IMS. Valores maiores que o estabelecido para o DPR indicam variabilidade entre os experimentos realizados.

O LMD (Limite Mínimo de Detecção), usado tradicionalmente para determinar analítos químicos, não foi usado neste trabalho. Tal fato se deve as controvérsias entre cientistas quanto ao uso deste método para calcular analitos microbiológicos. O foco da discussão está nas diferenças características entre microrganismos que permanecem como discretas partículas suspensas na água, e os analítos químicos que são uniformemente dispersos (CLANCY et al., 1999).