An´ alise do mecanismo proposto

A intera¸c˜ao do substrato com o grupo guanidina da arginina no P-loop ´e essencial para cat´alise. Muta¸c˜oes ARG→ALA resultam em redu¸c˜ao de 104 _{vezes em k}

cat e de 106

vezes na velocidade do primeiro evento irrevers´ıvel, sugerido como a rea¸c˜ao 1.9[91, 100, 101].

O grupo tiol da ciste´ına no P-loop est´a em posi¸c˜ao ideal para o ataque nucleof´ılico, alinhado com a liga¸c˜ao P–O que ´e quebrada[88, 102]. A muta¸c˜ao CYS_{→SER, uma simples} substitui¸c˜ao de enxofre por oxigˆenio na cadeia lateral, inativa a enzima[91, 96]. Esta ob- serva¸c˜ao ´e totalmente diferente da reatividade de ´esteres de fosfato em solu¸c˜ao aquosa, em que nucle´ofilos centrados em oxigˆenio s˜ao at´e 107 _{vezes mais eficientes do que aqueles cen-}

de formar complexos de Michaelis e, portanto, liga-se ao substrato[88, 102]. Este mutante ´e de grande utilidade, pois permite que os substratos naturais fosforilados das PTPs sejam identificados[43, 84].

Nas PTPs cl´assicas, DSPs e LM-PTPs, o res´ıduo que funciona como ´acido geral na primeira rea¸c˜ao e base geral na segunda ´e um ´acido asp´artico (ASP), localizado de 30 a 40 res´ıduos do s´ıtio ativo na dire¸c˜ao N-terminal[42]. O ASP est´a localizado num la¸co flex´ıvel, chamado “WPD-loop” (do c´odigo de uma letra para amino´acidos), que tamb´em cont´em um res´ıduo triptofano (ou ALA para as DSPs) e uma prolina. Na enzima livre, o ASP est´a cerca de 10 ˚A distante do s´ıtio ativo, mas, ap´os a liga¸c˜ao do substrato, o WPD-loop sofre uma mudan¸ca conformacional[86] e a cadeia lateral do ASP fica a cerca de 4 ˚A do oxigˆenio esterificado do substrato, posicionada para uma transferˆencia de H+[88, 102]_{. A}

muta¸c˜ao ASP_{→ALA resulta em redu¸c˜ao da atividade catal´ıtica em at´e trˆes ordens de} magnitude[92, 103, 104]. Embora a existˆencia do ´acido geral seja postulada para as CDC25s, a identifica¸c˜ao deste res´ıduo n˜ao foi efetuada[22, 105]. A observa¸c˜ao da estrutura crista- logr´afica indica que nenhuma al¸ca ou res´ıduo est´a corretamente posicionado para funcio- nar como um ´acido geral na CDC25A[106]ou CDC25B[107]. No entanto, dois res´ıduos GLU s˜ao conservados no P-loop das CDC25s e foram propostos como poss´ıveis ´acidos gerais nessas enzimas[42, 93, 105].

A fun¸c˜ao postulada para os res´ıduos de histidina (HIS) conservado no P-loop ´e de diminuir o pKae estabilizar a forma ionizada da CYS nucleof´ılica via uma rede de liga¸c˜oes

de hidrogˆenio[42, 102]. A muta¸c˜ao HIS_{→ALA resulta em diminui¸c˜ao de 10 vezes na k}cat

e em aumento de 1.5 unidades no pKa atribu´ıdo `a CYS[108]. Na LM-PTP, em que um

res´ıduo de valina (VAL) substitui a HIS, o pKa atribu´ıdo `a CYS tamb´em ´e cerca de 1.5

unidades superior `aquele atribu´ıdo `a CYS de outras fosfatases[108] (vide infra).

Postula-se que o res´ıduo SER ou THR conservado no P-loop ´e necess´ario para cat´alise, principalmente da rea¸c˜ao 1.10, pois estabiliza a regenera¸c˜ao do tiolato na CYS por uma liga¸c˜ao de hidrogˆenio da cadeia lateral (figura 10)[42]. A muta¸c˜ao SER_{→ALA resulta em} redu¸c˜ao de 100 vezes em kcat, mas em pouca ou nenhuma altera¸c˜ao de kcat/KM ou de k2

para as enzimas PTP1B e VHR[95, 109].

O efeito isot´opico cin´etico (p. 22) pode ser usado para investigar a estrutura do TS de rea¸c˜oes enzim´aticas[60, cap. 12, 13 e 14]. J´a que o m´etodo competitivo ´e usado para as determina¸c˜oes do KIE em enzimas[20], o efeito ´e relativo ao kcat/KM (normalmente

chamado de V /K), o que inclui a por¸c˜ao do mecanismo at´e a primeira etapa irrevers´ıvel. A invariˆancia dos KIEs enzim´atico com o pH e a magnitude dos valores (substancialmente

Tabela 3: Efeito isot´opico cin´etico em rea¸c˜oes de hidr´olise de pNPP catalisada por PTPsa

Enzimab 15_{(V /K)} 18_{(V /K)}

bridge 18(V /K)nonbridge

PTP1B, VHR, YOP51[20] 0.9999–1.0001 1.0118–1.0152 0.9998–1.0003

CDC25A[105] 1.0030 1.0357 0.9988

YOP51 e VHR (ASP_→ALA)[20] 1.0024–1.0030 1.0275–1.0297 1.0019–1.0024

YOP51 (ARG_→ALA)[20] 1.0012 1.0200 0.9990

VHR (SER_→ALA)[42] 1.0002 1.0119 1.0001

a _{o erro associado `as medidas ´e na ´ultima casa decimal.} b _{se mais de uma enzima est´a} indicada, os valores dados s˜ao as faixas de varia¸c˜ao. Mutantes s˜ao indicados entre parˆenteses pela substitui¸c˜ao do amino´acido no P-loop.

diferentes de 1 e semelhantes aos valores em solu¸c˜ao, tabela 1) indicam que uma etapa

qu´ımica (em que ocorre rea¸c˜ao) ´e limitante da velocidade para cada uma das enzimas

estudadas. Portanto, os KIEs caracterizam o TS da forma¸c˜ao da enzima tiofosforilada.

A liga¸c˜ao do substrato e a mudan¸ca conformacional do WPD-loop parecem ser r´apidas e revers´ıveis, sem impor barreiras cin´eticas para cat´alise[86].

Os KIE medidos para enzimas PTPs cl´assicas e VHR selvagens s˜ao pr´oximos, suge- rindo que os TSs de cada enzima s˜ao semelhantes. O valor de 15_{(V /K) para as enzimas}

PTPs cl´assicas e VHR ´e pr´oximo de 1, indicando que pouca densidade de carga ´e desloca- lizada no anel arom´atico no TS da rea¸c˜ao 1.9. Este dado ´e interpretado como evidˆencia da neutraliza¸c˜ao do grupo de sa´ıda pela transferˆencia do H+_{do ´acido geral para o oxigˆenio da}

liga¸c˜ao P–O que se quebra (p. 22). Os mutantes ASP_{→ALA tem um}15_{(V /K) significati-}

vamente maior que um e pr´oximo ao de mono´esteres em solu¸c˜ao (tabela 1), indicando que, neste caso, o grupo de sa´ıda ´e o ˆanion p-nitrofen´oxido. A CDC25A selvagem apresenta um

15_{(V /K) t´ıpico das enzimas mutantes sem o ´acido geral, indicando que, para pNPP como}

substrato, a cat´alise acontece sem protona¸c˜ao do grupo de sa´ıda. O 18_{(V /K)}

nonbridge me-

nor ou pr´oximo de 1 observado para as enzimas selvagens e para a mutante ARG→ALA indica diminui¸c˜ao da ordem de liga¸c˜ao P–O dos oxigˆenios n˜ao ligantes. Estes valores de

18_{(V /K)}

nonbridge s˜ao interpretados como evidˆencia da forma¸c˜ao de um TS com car´ater

mais dissociativo, semelhante ao metafosfato[20]. J´a os valores de 18_{(V /K)}

nonbridge > 1

observados para os mutantes ASP→ALA s˜ao semelhantes aos observados na hidr´olise de tri´esteres de fosfato (tabela 1) e indicam um TS mais associativo, com participa¸c˜ao do nucle´ofilo. O valor de18_{(V /K)}

nonbridgepara CDC25A ´e ainda mais baixo do que nas outras

enzimas e foi interpretado como evidˆencia de que as CDC25s utilizam um mecanismo de estabiliza¸c˜ao do TS diferente das outras fosfatases[105]. O18_{(V /K)}

bridge´e elevado para to-

das enzimas e seus mutantes, e ´e semelhante ao efeito medido para hidr´olise do mono´ester de fosfato dianiˆonico (_{§1.2.1 e tabela 1). Estes valores sugerem uma quebra substancial da}

liga¸c˜ao P–O no TS e caracterizam um mecanismo cuja etapa determinante da velocidade ´e dissociativa (figura 3). Os KIEs para VHR mutante SER→ALA s˜ao pr´oximos dos KIEs para as enzimas selvagens, indicando que esta muta¸c˜ao n˜ao altera o TS da rea¸c˜ao 1.9.

A velocidade de hidr´olise de uma s´erie de derivados de mono´esteres de arilfosfatos foi obtida para enzimas selvagens e mutantes (ASP_{→ASN) que n˜ao possuem um ´acido} geral posicionado para cat´alise. Para as enzimas PTP1B e VHR selvagens, nenhuma dependˆencia de kcat com o pKado grupo de sa´ıda foi observada, sugerindo que o grupo de

sa´ıda ´e protonado[95]ou que a quebra da liga¸c˜ao P–O para dissocia¸c˜ao do grupo de sa´ıda n˜ao ´e uma etapa limitante. Todavia, a CDC25[93, 105]e as enzimas mutantes[95]apresentam uma dependˆencia consider´avel da kcat com o pKa do grupo de sa´ıda (por exemplo, para

VHR mutante o βlg =−0.5)[95], sugerindo que, nestas enzimas, a quebra da liga¸c˜ao P–O

´e limitante da velocidade total e que n˜ao ocorre protona¸c˜ao do grupo de sa´ıda.

As observa¸c˜oes estruturais (figura 10) e os experimentos cin´eticos e de mutagˆenese comentados acima sugerem que a singular eficiˆencia catal´ıtica[1] das PTPs ´e obtida por estabiliza¸c˜ao eletrost´atica do TS (§1.1.2.6)[20, 42, 86]. A estabiliza¸c˜ao pode ser atribu´ıda `as liga¸c˜oes de hidrogˆenio entre os oxigˆenios n˜ao ligantes do grupo fosfato e os hidrogˆenios ligados aos nitrogˆenios da cadeia principal e da cadeia lateral da ARG[42, 110–114]. A trans- ferˆencia de H+ _{para o grupo de sa´ıda tamb´em deve contribuir para a cat´alise (§1.1.2.5).}

Assim, as bases moleculares para cat´alise est˜ao razoavelmente bem estabelecidas, por´em, d´uvidas ainda persistem. Em particular, os estados de protona¸c˜ao do substrato e dos grupos catal´ıticos designados experimentalmente tˆem sido questionados, porque as medidas podem ter diferentes interpreta¸c˜oes[115].

A influˆencia do pH do meio sobre a atividade enzim´atica pode ser usada para estimar as ioniza¸c˜oes de res´ıduos importantes para cat´alise. A varia¸c˜ao de kcat/KM com pH

descreve a ioniza¸c˜ao da enzima livre e do substrato nas etapas que envolvem desde a liga¸c˜ao do substrato at´e a cat´alise de rea¸c˜ao. A dependˆencia de kcat com o pH refere-se

`a cat´alise a partir do complexo de Michaelis, especialmente no caso das PTPs cuja etapa qu´ımica deve ser limitante da velocidade total. Um perfil de pH versus velocidade de rea¸c˜ao de hidr´olise de mono´ester de fosfato catalisada por PTPs ´e tipicamente em forma de sino, com pH ´otimo = 6[42, 83]. No perfil de kcat/KM vs. pH a inclina¸c˜ao ascendente

(do lado ´acido) ´e igual a +2 e a inclina¸c˜ao descendente (do lado b´asico) ´e−1. Para curva de kcat vs. pH, a inclina¸c˜ao ascendente ´e igual a 1 e a descendente ´e−1[103, 104, 116].

A identifica¸c˜ao dos grupos titul´aveis na enzima e no substrato n˜ao ´e direta uma vez que o substrato, o nucle´ofilo (grupo tiol da CYS) e o ´acido geral (cadeia lateral

da ASP) parecem ter seus pKas deslocados para valores pr´oximos de 7[42]. Tradici-

onalmente, a inclina¸c˜ao ascendente ´e atribu´ıda `a ioniza¸c˜ao da cadeia lateral da CYS, porque os pKas (pKaCY S) obtidos dos perfis de atividade contra pH para diferentes en-

zimas concordam com aqueles determinados por inativa¸c˜ao da enzima por iodoacetato: pKCY S

a = 4.7 para YOP51, 5.6 para PTP1B, 5.5 para VHR, 7.5 para LM-PTP[42, 115]

e 5.9 para CDC25B[22, 93]. Embora os pKas sejam obtidos de ajustes dos dados a uma

equa¸c˜ao cin´etica (portanto, possuem incertezas de cerca de 0.5 unidade), a concordˆancia dos valores de pKCY S

a obtidos por dois m´etodos experimentais distintos e as evidˆencias

cin´eticas que suportam o mecanismo de ataque nucleof´ılico (figura 11) sugerem que a cadeia lateral da CYS est´a ionizada.

Como a inclina¸c˜ao ascendente no perfil de kcat/KM vs. pH ´e +2, outro grupo, al´em

do tiol da CYS, deve estar ionizado para que a liga¸c˜ao do substrato e a cat´alise ocorram eficientemente. A interpreta¸c˜ao mais comum atribui este pKa no lado ´acido `a ioniza¸c˜ao

do substrato e, portanto, o diˆanion do mono´ester de fosfato deve se ligar a PTP[42, 83, 117]. Os resultados de KIE [18_{(V /K)}

nonbridge, tabela 3] tamb´em indicam que os oxigˆenios n˜ao

ligantes devam estar desprotonados[20, 42]. No entanto, a interpreta¸c˜ao dos perfis de pH ´e complicada, porque res´ıduos estruturalmente importantes, mas n˜ao envolvidos direta- mente com a cat´alise, podem afetar as inclina¸c˜oes dos gr´aficos. Por exemplo, a muta¸c˜ao do ´acido glutˆamico (GLU) conservado em todas PTPs e que realiza uma ponte salina com a cadeia lateral da ARG do P-loop resultou em anula¸c˜ao da inclina¸c˜ao ascendente do lado ´acido do perfil de kcat vs. pH[116].

A inclina¸c˜ao descendente dos perfis de atividade enzim´atica contra pH foi atribu´ıda `a ioniza¸c˜ao tanto do substrato como do ´acido geral[42, 115]. PTPs mutantes ASP→ALA apresentam o valor de kcat/KM constante em pH > 6 e, portanto, a inclina¸c˜ao descendente

foi atribu´ıda ao ´acido geral que deve estar protonado para cat´alise nas enzimas selvagens (figura 11)[103, 104, 116]. Contudo, perfis de pH de enzimas selvagens e de mutantes n˜ao podem ser diretamente comparados em alguns casos. A muta¸c˜ao ASP→ALA em LM- PTP[92], por exemplo, resulta na acumula¸c˜ao da enzima tiofosforilada, pois a energia livre desta esp´ecie ´e menor do que a energia do MC e, portanto, o k3 (que comp˜oem kcat,

equa¸c˜ao 1.11) ser´a medido em rela¸c˜ao a esp´ecie tiofosforilada cujos grupos catal´ıticos podem ter um estado de protona¸c˜ao diferente do MC.

Estudos computacionais utilizando a equa¸c˜ao de Poisson-Boltzmann tamb´em estima- ram o pKa dos grupos catal´ıticos nas PTPs[118, 119]. Embora os resultados dependam

macromol´ecula, entre outras aproxima¸c˜oes (por exemplo, a estrutura prot´eica n˜ao ´e rela- xada), os pKas obtidos para CYS no P-loop de diferentes PTPs, utilizando uma constante

diel´etrica igual a 20, concordam[118] com as medidas experimentais obtidas por inativa¸c˜ao da enzima. A orienta¸c˜ao dos microdipolos gerados pela cadeia principal do P-loop nas PTPs parece ter um maior impacto na estabiliza¸c˜ao da forma ionizada do que o campo eletrost´atico gerado pela α-h´elice localizada abaixo do P-loop[118]. O uso de uma constante diel´etrica igual a 4[119] resultou em pKas negativos calculados para o grupo tiol da CYS,

em ´obvio desacordo com as medidas experimentais. Por´em, os pKas calculados para o

´acido geral da cadeia lateral do ASP no WPD-loop est˜ao pr´oximos daqueles estimados experimentalmente e sugerem que o ASP est´a protonado no complexo de Michaelis. As principais contribui¸c˜oes para estabiliza¸c˜ao da forma ionizada no caso da CYS e da forma protonada no caso do ASP tamb´em foram atribu´ıdas aos microdipolos da cadeia principal, em especial ao P-loop, e ao grupo guanidina da ARG conservada[119].

M´etodos computacionais e experimentais mostram que a cadeia lateral da CYS nas PTPs apresenta um pKa menor do que a CYS livre (pKa = 8.3) e que o grupo tiol nas

PTPs deve estar ionizado no pH fisiol´ogico (figura 3). No entanto, grande parte dos estudos cin´eticos e interpreta¸c˜oes mecan´ısticas ´e realizada no pH ´otimo de atividade das PTPs, em torno de 6[42], e o grupo tiol pode estar protonado nestas condi¸c˜oes.

O estado de protona¸c˜ao tradicionalmente atribu´ıdo ao substrato, um diˆanion, tem sido mais contestado[115], j´a que os perfis de atividade enzim´atica versus pH n˜ao tˆem uma ´

unica interpreta¸c˜ao (vide supra). A an´alise das estruturas tridimensionais, determinadas por raios-X dos cristais de PTPs selvagens e mutantes ligados a diferentes substratos e inibidores, sugere que, preferencialmente, duas cargas negativas s˜ao acomodadas no s´ıtio ativo[115]. Portanto, se a cadeia lateral da CYS est´a ionizada, o substrato deveria se ligar como um monoˆanion monoprotonado[115, 120]. Esta hip´otese ´e baseada num argu- mento eletrost´atico intuitivo: um substrato dianiˆonico n˜ao “gosta” de interagir com o nucle´ofilo ionizado (tiolato da cadeia lateral da CYS). Contudo, o P-loop cont´em uma ARG com uma carga positiva na cadeia lateral e os hidrogˆenios ligados aos nitrogˆenios da cadeia principal est˜ao direcionados ao substrato aniˆonico e, portanto, a repuls˜ao ele- trost´atica entre o substrato e o nucle´ofilo deve estar minimizada[111]. Simula¸c˜oes computa- cionais empregando o m´etodo de liga¸c˜ao de valˆencia emp´ırica (EVB, “Empirical Valence Bond”)[10, 19][49, cap. 3 e 4]testaram a reatividade dos substratos mono e dianiˆonicos para a LM-PTP bovina[112, 113, 120]. As barreiras de ativa¸c˜ao para a rea¸c˜ao 1.9 calculadas para a LM-PTP selvagem ligada ao substrato mono ou dianiˆonico e para o mutante ASP_→ALA ligado ao substrato monoaniˆonico, reproduzem os valores experimentais[112]. A simula¸c˜ao

do mutante ligado ao substrato dianiˆonico n˜ao foi descrita. No entanto, a energia livre para liga¸c˜ao do substrato dianiˆonico `a LM-PTP foi estimada em 14 kcal/mol acima da energia de liga¸c˜ao do monoˆanion[112].

Assim, levantamos as seguintes perguntas sobre as PTPs:

• Qual o estado de protona¸c˜ao do substrato e do grupo nucleof´ılico no qual a cat´alise se processa?

• Por que enzimas mutantes CYS→SER s˜ao inativas?

• Qual res´ıduo funciona como ´acido geral na cat´alise das CDC25s?

O objetivo das simula¸c˜oes enzim´aticas desenvolvidas (cap. 4) foi responder estas quest˜oes. As prote´ınas tirosina-fosfatases de dupla especificidade, VHR[88]e CDC25B[107], foram os modelos prot´eicos escolhidos. A an´alise das evidˆencias experimentais e compu- tacionais apresentadas nesta se¸c˜ao como, por exemplo, enfatizado na p. 40, indica que apenas a primeira etapa de cat´alise, rea¸c˜ao 1.9, est´a relacionada com as quest˜oes acima e, portanto, somente esta rea¸c˜ao foi estudada.

1.4

C´alculo de estrutura eletrˆonica molecular

Qu´ımica quˆantica ou a determina¸c˜ao da estrutura eletrˆonica de mol´eculas ´e uma das ciˆencias computacionais mais bem sucedidas dos ´ultimos 30 anos. Nesta se¸c˜ao apresenta- remos um parte das id´eias e do formalismo b´asico para o c´alculo de estrutura eletrˆonica

ab initio (§1.4.1) ou por m´etodos semiemp´ıricos (§1.4.2). Esta informa¸c˜ao pode ser usada para otimizar geometrias moleculares (§1.5.1), obter propriedades termodinˆamicas (apˆendice B) e, assim, calcular caminhos de rea¸c˜ao de ´esteres de fosfato (cap. 2) e simular a cat´alise enzim´atica (cap. 4).

Embora o autor prefira a linguagem da segunda quantiza¸c˜ao[121, cap. 1 e 2] devido a sua clareza e elegˆancia, as equa¸c˜oes da qu´ımica quˆantica ser˜ao apresentadas na primeira quantiza¸c˜ao, porque a descri¸c˜ao dos m´etodos semiemp´ıricos e suas aproxima¸c˜oes nesta linguagem s˜ao mais usuais.

Uma nota sobre esta se¸c˜ao e a §1.6. Apenas uma pequena parte das id´eias sobre c´alculo de estrutura eletrˆonica e simula¸c˜ao molecular ser˜ao apresentadas. A escolha das equa¸c˜oes e dos m´etodos mostrados foi baseada nas t´ecnicas usadas nos cap´ıtulos seguintes

desta tese. N˜ao nos aprofundaremos na discuss˜ao dos m´etodos, porque o foco desta tese foi a utiliza¸c˜ao, ao inv´es do desenvolvimento ou aprimoramento das metodologias.