Ti´ olise e alco´ olise de ´ esteres de fosfato

Coordenada de reação−

2.3.2 Ti´ olise e alco´ olise de ´ esteres de fosfato

A alcoólise e tiólise de ésteres de fosfato não é facilmente observada experimentalmente, mesmo em solu¸cão (_{§1.2). Portanto, as rea¸cões A a H são uma referência para} a análise da reatividade intr´ınseca de ésteres de fosfato e dos poss´ıveis mecanismos de catálise em PTPs. Nesta se¸cão, os caminhos de rea¸cão (§2.2) serão discutidos, compa-

rando as estruturas das espécies e os perfis de energia de tiólise e alcoólise dos dos aril e alquil ésteres de fosfato.

A geometria dos IMCs é facilmente deformável, pois os dois reagentes (ou os produtos) não estão covalentemente ligados. Em solu¸cão aquosa, estes complexos são ainda menos estáveis, pois a solvata¸cão blinda as cargas formais das espécies, reduzindo a intera¸cão ele- trostática[73]. Os complexos de encontro (RS, figura 1) gerados têm geometrias diferentes das geometrias em fase gasosa. O s´ıtio ativo enzimático possue estrutura complemen- tar ao substrato, que estabiliza a forma¸cão do complexo de Michaelis (_{§1.1) e, assim, a} geometria deste complexo é diferente daquela observada em fase gasosa. Portanto, não discutiremos a estrutura dos IMCs calculados na fase gasosa.

As DRCs para as espécies estacionárias nas rea¸cões associativas de tiólise de mono e triésteres são em geral cerca de 0.5 ˚A menores do que as DRCs das espécies formadas na alcoólise dos mesmos reagentes. Esta diferen¸ca é conseqüência da maior distância da liga¸cão P_{−S. Por exemplo, d(PS) = 2.08 ˚}A para o TMDMP e d(PO) = 1.60 ˚A para o TMP. No entanto, os TSs da etapa de ataque nucleof´ılico nas quatro rea¸cões de triésteres possuem DRCs (p. 89) e distâncias de liga¸cão (tabela 8) próximas.

Nas rea¸cões de triésteres (figura 13), os TSs de quebra ou forma¸cão de liga¸cão P−O entre CH3O− e o grupo fosfato apresentam os grupos equatoriais torcidos como nos IMCs.

Os hidrogênios dos grupos metila equatoriais estão coordenados ao oxigênio do CH3O−.

Nos TSs de forma¸cão da liga¸cão P_{−S e de quebra da liga¸cão P−O de um grupo fenil,} os grupos equatoriais estão torcidos como nos intermediários (figura 13). Todos TSs das rea¸cões associativas de monoésteres têm os grupos OH equatoriais torcidos como nos intermediários (figura 19). Portanto, a maior basicidade do metóxido não é suficiente para retirar um hidrogênio das metilas equatoriais nos triésteres, mas resulta na tor¸cão dos grupos equatoriais nos TSs. A coordena¸cão aos hidrogênios dos grupos metila estabiliza os TSs de rea¸cões de metóxido. Nos monoésteres, os TSs das rea¸cões de metóxido são estabilizados pela transferência intramolecular de H+ _{e apenas um grupo equatorial é}

coordenado ao CH3O−.

As IRCs para todos TSs das rea¸cões Dn+An são dominadas pela transferência intra-

molecular de H+_{. Para a rea¸cão de dissocia¸cão de MeOP}−_{, a distância P}_{−O quebrada}

permanece constante na região do TS e as distâncias d(HX), onde X é o doador ou o aceptor de hidrogênio, sofrem mudan¸cas de mais de 0.6 ˚A (figura 20). As rea¸cões de dissocia¸cão de MeSP− _{e PhOP}− _{têm um comportamento semelhante. A transferência}

de H+ _{no mecanismo D}

rea¸cão ocorre somente quando o “ambiente” (a liga¸cão que se rompe, no caso das rea¸cões de fosfatos) assume uma configura¸cão ideal, que permanece praticamente imóvel durante a transferência[71].

A distância de liga¸cão P_{−S em todos TSs para tiólise varia de 2.6 a 3.1 ˚}A. A distância P_{−O varia de 2.2 a 2.4 ˚}A (tabela 8) nos TSs de sa´ıda do grupo aril e, varia de 2.0 a 2.9 ˚

A (tabela 8) nos TSs envolvendo rea¸c˜ao de CH3O−, sugerindo que a transferˆencia de H+

influencia as distˆancias P−OMe mais que nos outros grupos. A IRC das rea¸c˜oes An+Dn

de monoésteres envolvendo CH3SH e PhOH é exclusivamente composta pela forma¸cão ou

pela quebra da liga¸cão P_{−S ou P−O. Quando a rea¸cão envolve CH}3OH, a IRC é uma

combina¸cão da liga¸cão P−O e da transferência de H+_.

As freqüências imaginárias de baixa magnitude observadas em todos TSs das rea¸cões de triésteres e em alguns TSs das rea¸cões de monoésteres sugerem que a PES na região destes TSs é plana (tabela 8). Freqüências de maior magnitude são caracter´ısticas das rea¸cões de monoésteres envolvendo metóxido e indicam PES com maior curvatura na região dos TSs. As freqüências imaginárias acima de 1000i cm−1 _{indicam barreiras com}

acentuada curvatura, associadas apenas à transferência de H+_{e caracter´ısticas das rea¸cões}

Dn+An.

A PES é relativamente rugosa nas regiões de quebra e forma¸cão das liga¸cões P−O e P_{−S e, portanto, o arranjo dos grupos equatoriais influenciou a otimiza¸cão da geometria} dos TSs (p. 85). Por exemplo, no cálculo do caminho da rea¸cão A, os ângulos diedrais responsáveis pelas tor¸cões dos grupos equatorias combinavam-se à coordenada de rea¸cão. Pequenas varia¸cões nestes ângulos diedrais e na distância da liga¸cão (P_{−S) em forma¸cão} resultavam em grandes varia¸cões de energia, com diversos m´ınimos locais na PES (p. 85). Sugerimos que esta rugosidade era causada pela falta de flexibilidade N-eletrônica na ex- pansão da fun¸cão de onda e que uma descri¸cão multiconfiguracional seria necessária no cálculo da PES em torno dos TSs de forma¸cão da liga¸cão P_−S[211]. No entanto, investiga¸cões posteriores, incluindo cálculos multiconfiguracionais[234][121, cap. 12], popula¸cão de orbitais naturais[235], quebra de simetria da fun¸cão de onda eletrônica irrestrita[138], reoti- miza¸cões de geometria e o cálculo de IRC com conjunto base ampliado indicaram que a rugosidade na PES era causada por falta de flexibilidade no conjunto base de 1-elétron, especialmente pela ausência de fun¸cões difusas (p. 53). Estas investiga¸cões também indicaram que uma configura¸cão eletrônica (ou um determinante de Slater, _{§1.4.1) era} suficiente para descri¸cão da fun¸cão de onda das espécies de rea¸cão estudadas. Portanto, o conjunto 6-31+G* foi usado nas otimiza¸cões de geometria para todas outras rea¸cões

estudadas. Também conclu´ımos que a inclusão da correla¸cão eletrônica, pelo menos em segunda ordem (§1.4.1), é essencial para descri¸cão energética, pois barreiras de ativa¸cão calculadas no n´ıvel HF são até 18 kcal/mol superiores às barreiras calculadas no n´ıvel MP2[74, 211].

As estruturas formadas ao longo do caminho das rea¸cões A a H apresentam os átomos ligantes coordenados ao fósforo nas posi¸cões de uma TBP (figuras 4, 13 e 16). O fósforo e os ligantes equatorias são coplanares apenas nos intermediários (são exatamente coplanares nos C:I e G:Ia, pois essas rea¸cões são simétricas). As outras espécies formadas são TBPs distorcidas. Os mecanismos dissociativos e os IMCs das rea¸cões associativas de monoésteres (figura 19) são as únicas espécies cuja geometria otimizada não equivale a TBPs. O arranjo de TBP é caracter´ıstico dos intermediários propostos para rea¸cões de ésteres de fosfato[37, 39, 45] e é observado experimentalmente em compostos de fósforo (V ) hipervalente[162] e pentacoordenado, como fosforanas (p. 21)[39, 55].

Para alguns intermediários otimizados, o posicionamento dos grupos na TBP não segue as regras estabelecidas empiricamente (§1.2.1, p. 21)[39, 53]. Segundo os valores sugeridos por Pearson[46, tabela F.3], a eletronegatividade (χ) dos ligantes segue a ordem: χHO > χCH3O > χPhO > χCH3S. Os intermediários D:I, E:Ia, F:Ia, G:Ia e H:Ia possuem

ligantes de menor eletronegatividade, como PhO− _{e CH}

3S−, em posi¸c˜oes axiais (contra-

riando o item 2, p. 21). O D:I contém o grupo fenóxido em posi¸cão axial (contrariando os itens 1, 2 e 3, p. 21). Na rea¸cão A, barreiras similares são observadas para dissocia¸cão de metóxido com o grupo CH3S− posicionado axial (A:TS3) ou equatorialmente (A:TS2,

figura 13 e tabela 4), sugerindo que o posicionamento dos grupos não-reativos na TBP não influencia as alturas de barreiras de rea¸cão. Portanto, conclu´ımos que as regras emp´ıricas para posicionamento dos ligantes não são respeitadas para os intermediários de tiólise e alcoólise formados na fase gasosa e que o posicionamento dos grupos em rela¸cão a TBP não influencia as barreiras de ativa¸cão.

Barreiras energéticas envolvidas na pseudorrota¸cão (_{§1.2) foram propostas como causa} da dificuldade de forma¸cão (ou rea¸cão) de intermediários de ésteres de fosfato[40, 53, 54]. Pseudorrota¸cões são observadas nas rea¸cões associativas estudas (por exemplo, na rea¸cão A, entre as espécies A:TS1 e A:I1, p. 86), mas não apresentam barreiras de ativa¸cão. Não procuramos por caminhos de rea¸cão nem TSs para interconversões de pseudorrotâmeros a partir dos intermediários. Todavia, se as alturas destas barreiras são iguais às diferen¸cas de energia entre os pseudorrotâmeros, 3 kcal/mol para as rea¸cões de triésteres (p. 89), as barreiras serão facilmente transpostas. A barreira para a pseudorrota¸cão do intermediário

pentacoordenado da rea¸cão de OH−_{+ TMP, obtida por cálculos de estrutura eletrônica,}

é menor que 1 kcal/mol[212]. Conclu´ımos que a interconversão de pseudorrotâmeros não é um processo mecanisticamente importante e não deve dificultar a forma¸cão ou a rea¸cão das fosforanas na tiólise e alcoólise.

A única fosforana que pode ser observada experimentalmente é C:I, pois a barreira para sua decomposi¸cão é alta e suas energias de forma¸cão são exotérmicas (figura 17). Aparentemente, a metodologia empregada por Lum e Grabowski[40], no estudo da rea¸cão de TMP com diversos nucleófilos em fase gasosa, permite a deteçcão de intermediários aniônicos, mas a observa¸cão de uma fosforana não foi reportada. Estes autores sugerem que fosforanas não são formadas e que a etapa determinante da velocidade de rea¸cão é a adi¸cão do nucleófilo ao TMP[40] já que o composto deuterado, C2D3H3O4P−, que in-

dica ataque de CD3O− sobre f´osforo do TMP, foi detectado em pequenas quantidades (o

ataque sobre fósforo é observado apenas como tra¸cos de rea¸cão, cerca de 1.5% do total). Lum e Grabowski argumentam que a forma¸cão de uma fosforana resultaria em maior incorpora¸cão de CD3O− nos produtos, porque o intermediário poderia se decompor para

TMP-d3 e ser novamente atacado por CD3O−, gerando C2D6O4P−, que tamb´em n˜ao foi

detectado. O perfil energético calculado para a rea¸cão C sugere outra interpreta¸cão destes resultados experimentais. A barreira para a rea¸cão total corresponde à decomposi¸cão da fosforana. A adi¸cão de CD3O− a TMP é cerca de 107 vezes mais rápida do que a

dissocia¸cão do grupo de sa´ıda (figura 15). A baixa quantidade de composto deuterado detectada experimentalmente deve-se à maior barreira total para rea¸cão sobre fósforo em rela¸cão à rea¸cão sobre o carbono do TMP e ao ataque sobre carbono ser termodinamicamente favorável, ao contrário do ataque sobre fósforo[212]. O produto deuterado duplamente substitu´ıdo não é observado, porque a barreira para rea¸cão no fósforo tem que ser transposta duas vezes, sem que nenhuma outra rea¸cão concorrente (ataque sobre o carbono, ou dissocia¸cão do CD3O−) ocorra. Esta hipótese é energética e estatisticamente

desfavorável e a quantidade de C2D6O4P− formada deve ser inferior ao limite de deteçcão

experimental (0.2% do total do produto de rea¸c˜ao).

Os produtos formados na tiólise de triésteres são mais instáveis do que os produtos de alcoólise e, logo, as energias de rea¸cão de tiólise são maiores do que as energias de alcoólise (figuras 15 e 17). A diferen¸ca da energia de rea¸cão entre tiólise e alcoólise para o mesmo grupo de sa´ıda (rea¸cões A vs. C e B vs. D) é cerca de 35 kcal/mol. A diferen¸ca entre as rea¸cões com o mesmo nucleófilo, mas grupos de sa´ıda distintos (rea¸cões A vs. B e C vs. D), também é cerca de 35 kcal/mol. As rea¸cões e forma¸cões de intermediários nos monoésteres são endotérmicas e a faixa de varia¸cão das energias é restrita. Os inter-

mediários formados no ataque dos triésteres ar´ılicos são cerca de 10 kcal/mol mais estáveis do que os intermediários alqu´ılicos (A:I1 vs. B:I e C:I vs. D:I).

A energia de dissocia¸c˜ao de H+ _{de fenol em fase gasosa ´e cerca de 30 kcal/mol mais}

baixa do que a dissocia¸cão do metanol. Portanto, o fenóxido deve ser um melhor nu- cleófugo que metóxido e as energias de rea¸cão cujo grupo de sa´ıda é fenóxido são mais favoráveis. A basicidade do fenóxido é menor por causa da deslocaliza¸cão da carga nega- tiva pelo anel aromático. Para as rea¸cões de monoésteres, a transferência de H+ _{do grupo}

fosfato neutraliza a carga formada no nucleófugo e, portanto, as energias das rea¸cões cujos grupo de sa´ıda são metanol ou fenol são semelhantes. A protona¸cão do grupo de sa´ıda por um ácido geral é um dos mecanismos utilizados pelas PTPs para catalisar a desfosforila¸cão do substrato[42].

Portanto, a estabilidade termodinâmica dos triésteres depende da natureza dos grupos nucleof´ılicos e de sa´ıda. A desesterifica¸cão e protona¸cão resultam em considerável independência da estabilidade termodinâmica dos monoésteres de fosfato em rela¸cão à natureza dos grupos reativos. As energias de rea¸cão e de forma¸cão dos intermediários das rea¸cões E a H são menores do que 7 kcal/mol. Nas rea¸cões Dn+An, a etapa dissociativa é

sempre endoérgica e a etapa associativa é sempre exoérgica. Ao contrário dos triésteres, as altas energias de forma¸cão de intermediários sugerem que mecanismos divididos em duas etapas não são favorecidos para as rea¸cões de monoésteres. A barreira para decomposi¸cão de G:Ia é 7.1 kcal/mol. Assim como C:I, este intermediário também pode ser detectado experimentalmente, caso o mecanismo operacional na fase gasosa seja associativo (vide infra). Estes intermediários correspondem a rea¸cões identidade de alcoólise. Os outros intermediários formados nas rea¸cão associativas de monoésteres têm barreiras de decomposi¸cão menores do que 2 kcal/mol e, portanto, são instáveis na fase gasosa.

As alturas de barreira calculadas para as rea¸cões de monoésteres diferem considera- velmente das barreiras de triésteres. A rea¸cão com menor barreira é a alcoólise de DMPP (rea¸cão D, figura 17). Esta rea¸cão deve ser observada experimentalmente já que a barreira para alcoólise sobre carbono alqu´ılico pode ser estimada em cerca de 8.5 kcal/mol, pela diferen¸ca entre a energia relativa do TS de alcoólise sobre o carbono na rea¸cão de CH3O−+ TMP, calculada por Chang e Lim[212] (neste trabalho o C:TS1 é denominado

TS-6, com ∆ET = ∆EM P 2+ ∆ZP E = −12.7 kcal/mol, mas a ∆ET do IMC n˜ao ´e re-

portada), e a energia do C:IMC1 (o IMC formado para ataque sobre fósforo é o mesmo daquele formado quando o ataque ocorre sobre o carbono). A rea¸cão de tiólise de DMPP também apresenta uma barreira transpon´ıvel (figura 17) e deve ser observada experimen-

talmente. A barreira para ataque de CH3S− sobre carbono alqu´ılico foi calculada em

12.6 kcal/mol[211] e, portanto, deve ser competitiva com a tiólise sobre fósforo do DMPP (rea¸cão B, figura 15). O ataque nucleof´ılico sobre o carbono aromático é improvável em ambas rea¸cões. Portanto, sugerimos que quantidades significativas de ataque sobre fósforo devem ser observadas na fase gasosa, para rea¸cão de triésteres de fosfato com um grupo de sa´ıda aril-derivado, como DMPP, com nucleófilos como CH3O− e CH3S−, ao contrário

da reatividade de tri´esteres de alquila (_§1.2.2).

Nenhum dos estudos experimentais de ataque nucleof´ılico sobre TMP em fase gasosa apresentou constantes de velocidade para ataque sobre fósforo (_§1.2.2)[40, 41, 81]. O único dado cinético experimental que pode ser comparado com as alturas de barreira calculadas nesta tese é uma rela¸cão entre as constantes de velocidade para ataque sobre carbono e sobre fósforo da rea¸cão CD3O−+ TMP. Esta rela¸cão corresponde a uma diferen¸ca de 2.2

kcal/mol entre as barreiras, onde a rea¸cão sobre carbono é mais rápida[40]. A barreira estimada para ataque de CH3O− sobre carbono do TMP é 8.5 kcal/mol (vide supra) e a

barreira calculada para ataque sobre fósforo é 14.0 kcal/mol (figura 15). Assim, a diferen¸ca entre as barreiras calculadas é 5.5 kcal/mol, isto é, 3.3 kcal/mol acima da diferen¸ca entre as barreiras experimentais. A proximidade das diferen¸cas de barreira calculada e experimental demonstra que as computa¸cões efetuadas tem capacidade preditiva, pelo menos, semiquantitativa. As diferen¸cas de altura de barreira não são mais próximas em virtude das incertezas possivelmente associadas às seguintes fontes:

• Medida experimental, pois a observa¸cão do produto de ataque sobre fósforo foi pequena e próxima do limite de deteçcão[40];

• Suposi¸cão que o mecanismo de rea¸cão é AnDn, para calcular a rela¸cão entre as

constantes a partir das distribui¸c˜oes de produtos observadas[40];

• N´ıvel de cálculo de estrutura eletrônica (MP2/6-31+G*//HF/6-31+G*) usado na determina¸cão da energia relativa do TS de ataque sobre carbono[212].

A compara¸cão entre os valores calculados e experimentais é resultado da diferen¸ca entre dois valores, computados ou medidos, e, portanto, o erro final é a soma dos erros de cada valor. O erro associado ao n´ıvel de cálculo usado na computa¸cão da altura de barreira de ataque sobre fósforo (_{§2.2.4 e §2.3.1) deve ser menor do que as três poss´ıveis fontes de} erro mencionadas acima.

A constante de velocidade de alcoólise intramolecular de um aril diéster de fosfato em solu¸cão aquosa é cerca de 107 _{vezes maior do que a tiólise intramolecular de um substrato}

equivalente. Esta diferen¸ca corresponde a um ∆∆G‡_{= 9.5 kcal/mol a 25}◦_C[76]_{. O efeito}

da solvata¸cão aquosa na diferen¸ca de energia relativa (∆∆G) entre estas rea¸cões deve ser cancelado em grande parte, já que a rea¸cão é intramolecular e a estrutura do solvente em torno do álcool e do tio derivado deve ser similar. Observamos um bom acordo entre a diferen¸ca das alturas de barreira das rea¸cões B e D, 7.7 kcal/mol, e a diferen¸ca entre as energias de ativa¸cão experimentais. Os mecanismos de rea¸cão de diésteres de fosfato são associativos e similares aos mecanismos de triésteres (_§1.2).

A rea¸c˜ao de HS−_{+ TMP medida em fase gasosa ´e totalmente regiosseletiva para}

carbono e o ataque sobre fósforo não é observado[40]. O perfil energético calculado para a rea¸cão A (figura 15) sugere que a rea¸cão de tiólise sobre fósforo não é observada, porque a rea¸cão é termodinamicamente desfavorável (∆Greac > 30 kcal/mol), apresenta um alta

barreira para elimina¸cão do grupo de sa´ıda e uma pequena barreira para decomposi¸cão do intermediário na dire¸cão dos reagentes (4.2 kcal/mol, figura 15). Lum e Grabowski[40], e Chang e Lim[212] propõem que o passo limitante para o ataque ao centro de fósforo em triésteres é a adi¸cão do nucleófilo. Os resultados apresentados na §2.2.1 mostram que a etapa limitante é o ataque sobre fósforo apenas para rea¸cão B e a etapa de dissocia¸cão do grupo de sa´ıda é limitante nas outras rea¸cões de triésteres. Portanto, parece-nos que, para as rea¸cões de triésteres em geral, a etapa de dissocia¸cão do grupo de sa´ıda é determinante da velocidade de rea¸cão.

As energias de descomplexa¸cão dos IMCs dos produtos nas rea¸cões B, C e D são maiores que as barreiras associadas aos TS1 e TS2 de cada rea¸cão. Embora as energias de complexa¸cão estejam superestimadas em até 1

8 dos valores, em conseq¨uˆencia do BSSE [140]

(p. 54), a acumula¸cão dos IMCs dos produtos ou a rea¸cão inversa (ataque por metóxido nas rea¸cões A e C, e por fenóxido nas rea¸cões B e D) podem ser observadas em fase gasosa.

Dois tipos de mecanismos foram calculados para as rea¸c˜oes de mono´esteres (figura 3). As diferen¸cas entre as alturas de barreira observadas no mecanismo An+Dn e no Dn+An

não ultrapassam 7 kcal/mol, assim, os dois mecanismos podem ser competitivos. Para a rea¸cão E (Dn+An), a barreira de ativa¸cão total é 7 kcal/mol mais baixa que a barreira

para o mecanismo associativo. A altura de barreira total da rea¸c˜ao F (An+Dn) ´e 28.7

kcal/mol. A dissocia¸c˜ao de PhOP− _{apresenta uma barreira de 29.4 kcal/mol e, assim,}

a forma¸cão do F:IMC1d pode ser competitiva com a forma¸cão do F:IMC2a (figura 21 e tabela 9). Todavia, o mecanismo An+Dndeve ser preferido, porque a energia de forma¸cão

No documento Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato... (páginas 137-148)