Modelos para os mecanismos enzim´ aticos - Coordenada de reação−

Coordenada de reação−

2.3.3 Modelos para os mecanismos enzim´ aticos

Mono e triésteres de fosfato foram usados como modelos das rea¸cões catalisadas por PTPs, porque estes eram os compostos mais próximos dos substratos selvagens das enzimas e, porque poderiam ter suas estruturas eletrônicas e energias determinadas com boa acurácia. Embora os substratos enzimáticos sejam monoésteres, a rea¸cão destas espécies é influenciada pela transferência intramolecular de H+ ₍_{§2.2 e §2.3), assim, as rea¸cões}

de triésteres são modelos para descrever a quebra e a forma¸cão intr´ınsecas das liga¸cões P−O e P−S, livre de efeitos de protona¸cão. A alquila¸cão dos oxigênios equatorias em triésteres também pode mimetizar o efeito da coordena¸cão dos oxigênios equatorias do substrato com a cadeia lateral da ARG e com os hidrogênios (ligados ao nitrogênio) da cadeia protéica principal no MC das PTPs (figura 10)[51]. Ésteres com grupos de sa´ıda aril e alquil derivados foram inclu´ıdos para modelar as rea¸cões das PTPs com fosfotiro- sina e das DSPs com fosfoserina e fosfotreonina. Além do estudo das PTPs selvagens, que utilizam um res´ıduo CYS para ataque nucleof´ılico ao substrato (forma¸cão da liga¸cão P−S, §1.3), também modelamos a rea¸cão catalisada pelos mutantes CYS→SER, em que o ataque nucleof´ılico envolveria uma alcoólise do éster de fosfato.

de fosfato aniônico (mono ou duplamente carregado) seja um modelo mais fiel ao estado de protona¸cão e ao mecanismo de catálise tradicionalmente propostos para atividade das PTPs (figura 11 e _{§1.3), a determina¸cão da estrutura eletrônica de derivados de fosfato} di ou trianiônicos na fase gasosa sugere que estas espécies são instáveis e podem sofrer autoioniza¸cão eletrônica (p. 149)[238]. Portanto, escolhemos as rea¸cões de tiólise e alcoólise de tri e monoésteres com carga total igual a −1, como modelos cuja estrutura eletrônica pode ser determinada com acurácia na fase gasosa.

As energias de ativa¸c˜ao (∆G‡

enz) para rea¸c˜ao catalisada pelas PTPs variam entre 14

e 18 kcal/mol para os diversos membros da superfam´ılia (_{§1.3). O mecanismo de catálise} ocorre em duas etapas (rea¸cões 1.9 e 1.10). Já a rea¸cão em solu¸cão ocorre geralmente em uma única etapa de hidrólise AnDn (§1.2.1). Portanto, não podemos analisar a enzima

em termos de sua afinidade pelo TS da rea¸cão em solu¸cão (_§1.1)[239]. A primeira etapa na catálise (rea¸cão 1.9) pode ser comparada à tiólise de monoéster em solu¸cão, mas esta rea¸cão nunca foi observada (p. 30). A hidrólise não catalisada de MeOP2− _{e PhOP}2− _(me-

tilfosfato e fenilfosfato dianiônicos) em solu¸cão aquosa, fortemente básica, tem ∆G‡_sol = 43 e 36 kcal/mol a 39◦_{C, respectivamente}[1]_.

Nos próximos parágrafos, as contribui¸cões e os processos envolvidos na primeira rea¸cão catal´ıtica (1.9) serão dissecados e comparados com os perfis de energia calculados.

A repulsão eletrostática presente na barreira de ataque do nucleófilo ionizado ao substrato carregado negativamente (figura 11) pode ser estimada aproximadamente, em solu¸cão aquosa, em 5 kcal/mol [∆∆G‡_(Q

P = 0 → QP = −1) ≈ 5 kcal/mol, onde QP ´e

a carga formal do grupo fosfato][52], a partir da diferen¸ca entre as energias de ativa¸cão medidas para ataque de OH− _{sobre um triéster (neutro e c´ıclico) e sobre um diéster}

monoaniônico. Assumindo que a contribui¸cão eletrostática é linearmente aditiva, a re- pulsão entre um nucleófilo ionizado e um substrato dianiônico (figura 11) contribuiria com ∆∆G‡_(Q

P = 0 → QP = −2) ≈ 10 kcal/mol para altura da barreira de rea¸c˜ao

em solu¸cão. As PTPs podem estabilizar esta repulsão eletrostática gra¸cas às cargas for- mais positivas (por exemplo, a cadeia lateral da ARG conservada) e ao potencial ele- trostático positivo[240] observados no s´ıtio ativo (este potencial foi calculado por métodos aproximados[145] e, portanto, deve ser analisado qualitativamente).

A barreira intr´ınseca para ataque de CH3S− sobre fosfatos neutros ´e representada pe-

las barreiras da primeira etapa das rea¸cões A e B (com alturas respectivamente de 16.0 e 10.7 kcal/mol), porque as rea¸cões de monoésteres são influenciadas pela transferência intramolecular de H+ ₍_{§2.3.2). Portanto, a forma¸cão da liga¸cão P−S no processo de catálise}

das PTPs não necessita de estabiliza¸cão, já que as barreiras intr´ınsecas são menores ou similares a energia de ativa¸cão observada experimentalmente.

A forma¸cão de um intermediário fosforana ou metafosfato durante a catálise necessita de estabiliza¸cão, independentemente do mecanismo adotado na enzima (An+Dn ou

Dn+An), já que as energias de forma¸cão destas espécies na tiólise de monoésteres varia

entre 24.4 a 31.2 kcal/mol (rea¸c˜oes E e F, figuras 21 e 22).

Se o mecanismo Dn+An ´e adotado pela PTP, a dissocia¸c˜ao do grupo de sa´ıda, cujas

barreiras são cerca de 30 kcal/mol (rea¸cões E e F), necessita de estabiliza¸cão, possivel- mente por uma transferência de H+ _{proveniente de um ácido geral da enzima. Uma}

estimativa da contribui¸cão da transferência de H+ _{para estabiliza¸cão do grupo de sa´ıda}

não pode ser facilmente obtida a partir das barreiras das etapas dissociativas das rea¸cões E e F Dn+An, já que a transferência de H+ nestas rea¸cões é intramolecular e a protona¸cão

estabiliza o grupo de sa´ıda (metanol ou fenol), mas deve desestabilizar o metafosfato.

Se o mecanismo enzimático é associativo, a barreira para dissocia¸cão do grupo de sa´ıda do intermediário pentacoordenado não será limitante caso o grupo esteja parcialmente protonado (segunda etapa das rea¸cões E e F An+Dn) ou caso o grupo seja fenóxido

(segunda etapa das rea¸cões A e B). Se o grupo de sa´ıda for metóxido, alguma estabiliza¸cão será necessária, provavelmente via protona¸cão, já que a barreira para sa´ıda de metóxido de uma fosforana é cerca de 20 kcal/mol (rea¸cão A).

Em resumo, as rea¸cões modelo de tiólise de mono e triésteres de fosfato calculadas permitem-nos especular que os processos que necessitam de estabiliza¸cão na primeira rea¸cão (1.9) da atividade das PTPs são:

• Repulsão eletrostática entre o nucleófilo ionizado e o substrato aniônico;

• Forma¸cão do intermediário de tiólise, seja este um metafosfato ou uma fosforana; • Dissocia¸cão do grupo de sa´ıda caso este seja um alquil derivado e não esteja proto-

nado.

Ao contrário do que é sugerido pelas regras emp´ıricas de posicionamento dos ligantes coordenados a uma TBP (p. 21), não existe gasto energético para posicionar um grupo menos eletrof´ılico, como o tiolato, em posi¸cão axial (p. 119). Portanto, as PTPs não precisam estabilizar o arranjo em linha no ataque nucleof´ılico ou na poss´ıvel forma¸cão de uma fosforana.

Também podemos especular quais são as poss´ıveis causas da inatividade das PTPs mutantes CYS→SER (§1.3.3). O oxigênio da cadeia lateral da SER mutante pode se posicionar desfavoravelmente para o ataque nucleof´ılico sobre o substrato fosforilado, localizando-se a uma distância inapropriada do fósforo do substrato [d(PS)=2.14 ˚A no MeSP− _{e d(PO)=1.68 ˚}_{A no MeOP}−_{] ou coordenando-se a outros centros, impedindo}

o ataque nucleof´ılico[111]. As distâncias da liga¸cão em forma¸cão no TS associativo das rea¸cões de triésteres variam em torno de 2.8 ˚A e são quase independentes da natureza do nucleófilo (tabela 8), assim, a distância da liga¸cão P_{−O num poss´ıvel TS na PTP} mutante seria similar a distância P−S do TS na PTP selvagem. No entanto, a d(PO) num poss´ıvel TS na PTP mutante pode estar aumentada, pois a liga¸cão C−O na cadeia lateral da serina é 0.4 ˚A mais curta do que liga¸cão C_{−S da ciste´ına.}

A maior basicidade do grupo metóxido resulta na tor¸cão dos grupos equatoriais nas rea¸cões de alcoólise dos triésteres (vide supra) e, portanto, os mutantes CYS_{→SER podem} ter o s´ıtio ativo, em especial os grupos coordenados ao nucleófilo, como a cadeia lateral da SER conservada no P-loop e os hidrogênios da cadeia principal do P-loop, torcidos ou mal posicionados para catálise[111]. A PTP foi otimizada pela evolu¸cão para catalisar a tiólise de fosfato e, portanto, os grupos catal´ıticos coordenam-se para estabiliza¸cão do TS desta rea¸cão e não para rea¸cão de alcoólise.

Mutantes CYS→SER são usados para aprisionar o substrato natural de PTPs, já que a muta¸cão não impede a forma¸cão do MC, mas inativa a desfosforila¸cão do substrato (p. 39). Uma vez que a ativa¸cão da liga¸cão P_{−O na etapa de dissocia¸cão do grupo de} sa´ıda é pouco influenciada pelo natureza do grupo nucleof´ılico (p. 102), sugerimos que a inatividade dos mutantes CYS→SER está relacionada à etapa de ataque nucleof´ılico, qualquer que seja o mecanismo empregado nas PTPs.

Em razão da transferência de H+ _{nas rea¸cões de monoésteres, a reatividade dos alquil}

e arilfosfatos nas rea¸cões E a H é semelhante. No entanto, os perfis de energia das rea¸cões de triésteres de alquil e arilfosfatos apresentam diferen¸cas de até 30 kcal/mol, além de diferen¸cas de até 0.5 ˚A na distância da liga¸cão P_{−O que é quebrada (tabela 8). Portanto,} supomos que as DSPs são capazes de catalisar rea¸cões com caracter´ısticas estruturais e perfis energéticos razoavelmente distintos. Os mecanismos utilizados por estas enzimas para catálise serão apresentados no cap´ıtulo 4.

No documento Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato... (páginas 148-152)