Rea¸ c˜ oes em solu¸ c˜ ao - Cat´ alise enzim´ atica

O Escritor Desconhecido UR-042 Detroit, EUA, 1997.

1.1 Cat´ alise enzim´ atica

1.2.1 Rea¸ c˜ oes em solu¸ c˜ ao

O fator que determina o mecanismo observado é o estado de alquila¸cão do éster de fosfato [37–39, 45]. Dados experimentais para rea¸cões em solu¸cão são normalmente interpretados[37–39, 45] como evidências de que monoésteres de fosfato reagem segundo um

mecanismo Dn+Anou sob um mecanismo AnDncujo TS apresenta significativa quebra da

liga¸cão P−O entre o fosfato e o grupo de sa´ıda. Os dados experimentais também sugerem que diésteres e triésteres reagem segundo mecanismo AnDnse o grupo de sa´ıda for ativado

(como, por exemplo, p-nitrofenol), mas com maior participa¸cão do nucleófilo no TS do que as rea¸cões de monoésteres; ou formam intermediários estáveis, reagindo segundo um mecanismo An+Dn.

Condi¸cões do meio, natureza do nucleófilo e do grupo de sa´ıda, e o estado de protona¸cão para os di e monoésteres também influenciam qual mecanismo é observado.

O ataque nucleof´ılico sobre triésteres de fosfato apresenta uma cinética de segunda ordem[38]e pode ocorrer sobre o fósforo ou sobre um dos átomos de carbono. A natureza e basicidade do nucleófilo afetam tanto a regiosseletividade como a velocidade das rea¸cões. Em solu¸cão aquosa, nucleófilos duros (segundo a classifica¸cão de Parr e Pearson[46, §5.3]), como OH−_{, atacam preferencialmente o fósforo. Já nucleófilos moles, como H}

2O, Br− e

I−_{, atacam preferencialmente um ´atomo de carbono do tri´ester}[38]_{. Considerando o ata-}

que sobre o fósforo, nucleófilos de pequena basicidade reagem mais lentamente[37] do que nucleófilos mais básicos ou aqueles com “efeito α”[8, §2.D.9][47, 48]. Por exemplo, a constante de velocidade de segunda ordem de ataque de OH− _{é 10}4 _{vezes maior do que a constante}

de ataque de H2O sobre o fósforo de um triaril fosfato[38]. A hidrólise de triésteres não é

catalisada por H+_{, ao contrário da hidrólise de monoésteres (vide infra).}

A varia¸cão da constante de velocidade de rea¸cão com o pKa do nucleófilo ou do grupo

de sa´ıda pode ser representada por uma rela¸cão linear de energia livre (LFER)[49, cap. 6]. Nas rea¸cões de triésteres de fosfato, o βnuc (inclina¸cão da LFER usando o pKa do nu-

cle´ofilo) varia de 0.30 a 0.48[50]. O βnuc significativamente diferente de zero indica efetiva

participa¸cão do nucleófilo na etapa determinante da velocidade de rea¸cão e, portanto, é considerado uma evidência de mecanismo associativo (AnDn ou An+Dn)[37, 39, 50].

A entropia de ativa¸cão (∆S‡_{) medida para rea¸cões de triésteres em solu¸cão, cerca de}

−35 cal mol−1 _K−1_{, ´e interpretada como perda de entropia translacional dos reagentes,}

geralmente associada a rea¸cões bimoleculares[49, §5.4.4] e, portanto, também é considerada como evidência de um mecanismo AnDnou An+Dn[51]. A distin¸cão entre mecanismos uni-

moleculares e bimoleculares em fun¸cão do ∆S‡_{é poss´ıvel, caso a contribui¸cão dominante}

para ∆S‡ _{seja a entropia translacional. Esta condi¸c˜ao deve ser verdadeira nos experimen-}

tos com tri´esteres[51], cujos valores de ∆S‡ _{s˜ao bastante negativos, mas deve ser vista com}

ressalvas no caso dos experimentos com mono´esteres (vide infra)[52]. ´

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Figura 4: Exemplo de uma bipirâmide trigonal. O plano equatorial está indicado por um triângulo pontilhado. Legenda: átomo central em preto, átomos equatoriais em linhas diagonais e átomos axiais em linhas cruzadas.

com três grupos na posi¸cão equatorial e dois grupos na posi¸cão axial (figura 4). Estas espécies podem sofrer pseudorrota¸cões[53], ou seja, mudan¸cas dos ângulos de liga¸cão que resultam em troca de posi¸cão entre um grupo equatorial e outro axial na TBP. Uma espécie pentacoordenada que forma um intermediário estável de rea¸cão de éster de fosfato é denominada fosforana. A forma¸cão de fosforanas foi proposta para rea¸cões de di e triésteres nos casos em que uma pseudorrota¸cão seja necessária para posicionar axialmente o grupo de sa´ıda[40, 45, 53, 54]. Fosforanas foram observadas experimentalmente para alguns sistemas especiais[55, 56], mas evidências computacionais[57, 58] sugerem que fosforanas não são necessariamente formadas em todas as rea¸cões de triésteres de fosfato.

As seguintes regras emp´ıricas foram propostas para o arranjo dos grupos ligantes numa fosforana[39]:

1. Nucleófilos e nucleófugos entram e saem da TBP por uma posi¸cão axial;

2. Ligantes mais eletronegativos preferem posi¸c˜oes axiais;

3. Ligantes doadores de el´etrons π preferem posi¸c˜oes equatoriais;

4. Efeitos est´ericos s˜ao minimizados, posicionando-se os ligantes impedidos equatorialmente;

5. Caso o fósforo e dois de seus átomos ligantes sejam membros de um anel de 4 ou 5 membros, estes dois átomos estarão posicionados axial e equatorialmente.

Estas regras, em grande parte baseadas na reatividade de fosfatos c´ıclicos, têm sido cri- ticadas, principalmente em rela¸cão à necessidade de entrada e sa´ıda dos ligantes pela posi¸cão axial[39].

Efeito isotópico cinético (KIE) foi medido para rea¸cões de ésteres de fosfato em diferentes condi¸cões[20]. O KIE é a rela¸cão entre a constante de velocidade de rea¸cão obtida com o reagente marcado com um isótopo leve sobre aquela obtida com um isótopo pesado[59, cap. 7]e pode ser usado para investigar a estrutura do TS da etapa determinante da velocidade de rea¸cão[60, cap. 12, 13 e 14]. Um KIE é chamado de primário se a liga¸cão que se quebra ou se forma durante a rea¸cão envolve o átomo marcado e de secundário se o isótopo se encontra em outras posi¸cões. O KIE é conseqüência das diferen¸cas nos modos vibracionais dos quais o átomo marcado participa, entre os reagentes e o TS do passo limitante da rea¸cão[59, cap. 7]. O KIE também pode ser interpretado em termos de mudan¸cas da ordem de liga¸cão observada no TS limitante[20]. O grupo de sa´ıda p-nitrofenol é usado em medidas de KIE em rea¸cões de ésteres de fosfato. Assim, o KIE primário, 18_k

bridge,

refere-se à liga¸cão P_{−O entre o fosfato e o grupo de sa´ıda, e mede o grau de dissocia¸cão} desta liga¸cão no TS. Um18_k

bridge > 1 indica que a quebra da liga¸c˜ao P−O ´e substancial

no TS da etapa determinante da velocidade de rea¸cão. Os KIE secundários medidos são aqueles do nitrogênio do grupo de sa´ıda, 15_{k, e dos oxigênios não esterificados do grupo}

fosfato, 18_k

nonbridge. O 15k indica a densidade de carga negativa deslocalizada no grupo

nitro[20]. Caso o grupo de sa´ıda se dissocie como um ˆanion, o 15_{k ser´a maior que 1. Se}

alguma protona¸cão neutraliza parte da densidade de carga formada da quebra da liga¸cão P_−O, 15_k _{≈ 1. A diminui¸cão ou anula¸cão do KIE em razão da protona¸cão também é}

observada no 18_k

bridge. O 18knonbridge indica se o grupo fosfato no TS tem caracter´ıstica

de um metafosfato dissociado, em que 18_k

nonbridge < 1, ou se o grupo fosfato tem carac-

ter´ısticas mais associativas, como uma fosforana, em que 18_k

nonbridge > 1. O 18knonbridge

também sofre influência da protona¸cão dos oxigênios não esterificados do grupo fosfato.

Para as rea¸cões de diésteres e, principalmente, triésteres, o18_k

nonbridge´e bem maior que

1, indicando um TS na etapa determinante com significativo car´ater associativo (tabela 1). A reduzida magnitude de15_{k e}18_k

bridgepara as rea¸cões de triésteres e diésteres indica

que, no TS determinante da velocidade de rea¸cão, a densidade de carga negativa no grupo de sa´ıda e a quebra da liga¸cão P_{−O são reduzidas e sugere que a etapa determinante da} velocidade é o ataque nucleof´ılico.

Para di e triésteres com um grupo de sa´ıda ativado, como o p-nitrofenol, o TS tem caráter associativo, mas não há evidências que comprovem a existência de uma fosforana e, assim, o mecanismo proposto é AnDn[39, 45]. Para grupos de sa´ıda mais básicos como

fen´oxido e met´oxido, o18_k

nonbridge´e mais elevado e, portanto, a forma¸c˜ao de uma fosforana

Tabela 1: Efeito isotópico cinético em rea¸cões de hidrólise de ésteres de fosfato em solu¸cãoa

reagente 15_k 18_k

bridge 18knonbridge

mono´ester diˆanion em H2O 1.0028 1.0189 0.9994

mono´ester diˆanion em t-butanol 1.0039 1.0202 0.9997

mono´ester monoˆanion 1.0005 1.0094 1.0199

di´esterb _{1.0007(16) 1.0042(63) 1.0028(56)}

tri´esterb _1.0007 _1.0063 _1.0063(250)

a _{o erro associado `}_{as medidas}[20]_{é na ´}_{ultima casa decimal.} b _{KIEs para diésteres e triésteres} correspondem à hidrólise alcalina. Os números em parênteses mostram os valores máximos nas ´

ultimas casas decimais indicadas obtidos para diferentes reagentes.

A reatividade de monoésteres de fosfato é mais complexa, porque diferentes estados de protona¸cão são acess´ıveis a estes compostos. O primeiro e o segundo pKados oxigênios

não esterificados em monoésteres de fosfato são 1.5 e 6.5, respectivamente[61]. Os pKas

podem variar em torno destes valores, dependendo do grupo ligado ao fosfato[61]. O perfil de varia¸cão da constante de velocidade de hidrólise de monoésteres versus o pH do meio tem forma de um sino, com máximo em torno de pH = 4, e torna-se independente do pH para valores abaixo de 1 e acima de 9 unidades[62, 63]. A cinética de hidrólise é de primeira ordem e nenhuma troca de 18_{O entre H}18

2 O e CH3OH ´e observada na hidr´olise

de metilfosfato, indicando que o ataque nucleof´ılico ocorre sobre o f´osforo[63].

Monoésteres neutros (duplamente protonados) estão presentes em baix´ıssimas con- centra¸cões em solu¸cão neutra in vitro ou in vivo e, portanto, não são importantes meca- nisticamente.

O mecanismo proposto para rea¸cões de monoésteres dianiônicos (não protonados) em solu¸cão aquosa é AnDn, cujo TS apresenta significativa quebra da liga¸cão P−O com o

grupo de sa´ıda e m´ınima forma¸cão de liga¸cão com o nucleófilo. Esta interpreta¸cão é baseada nas seguintes observa¸cões experimentais:

• Alta dependˆencia da velocidade de rea¸c˜ao com o pKa do grupo de sa´ıda (lg) (βlg =

−1.2)[62];

• Baixa dependência da velocidade de rea¸cão com o pKado nucleófilo (βnuc = 0.1)[64, 65];

• ∆S‡_{positiva e pequena, cerca de 3 cal mol}−1_K−1_{para p-nitrofenil fosfato (pNPP)}[51]_;

• Inversão de configura¸cão quando o grupo fosfato é quiral[66]; • Medidas de KIE primário e secundário (tabela 1)[20];

• Intermediário metafosfato não foi isolado e sua existência não foi diretamente com- provada[39].

Ao contrário de triésteres, o βnucé quase nulo na rea¸cão de monoésteres, o que indica

pouca ou nenhuma participa¸cão do nucleófilo no TS determinante da velocidade de rea¸cão. O alto βlgindica que a etapa determinante é efetivamente composta pela quebra da liga¸cão

P−O.

A pequena entropia de ativa¸c˜ao, sugerida como indica¸c˜ao do mecanismo AnDn, deve

ser vista com ressalvas, porque outros fatores além da entropia translacional, como, por exemplo, efeitos de solvata¸cão causados pela redistribui¸cão e deslocaliza¸cão de carga no TS, podem contribuir significativamente para ∆S‡_.

A inversão de configura¸cão na rea¸cão de um fosfato quiral (contendo [16_O,17_O,18_O]-

fosfato) pode ser vista tanto como evidência de um mecanismo com caráter associativo ou como um mecanismo dissociativo em que o metafosfato não é uma espécie difusionalmente equilibrada. Neste caso, o intermediário reativo metafosfato não tem tempo de vida suficiente para difundir na solu¸cão e é capturado por uma molécula de água antes de escapar da esfera de solvata¸cão onde a rea¸cão ocorre.

Observando os KIEs do mono´ester dianiˆonico em H2O (tabela 1), temos que os valores

de15k e 18kbridge são 4 vezes superiores àqueles observados para rea¸cões de di e triésteres,

indicando significativa quebra da liga¸cão P−O e forma¸cão de carga negativa no grupo de sa´ıda na etapa determinante da velocidade de rea¸cão. O valor de 18_k

nonbridge < 1 indica

que o TS ´e dissociativo, com caracter´ıstica de metafosfato.

Em solu¸cão aquosa, o metafosfato nunca foi diretamente observado[39]. Porém a rea¸cão do monoéster dianiônico em t-butanol tem os valores de15_{k e}18_k

bridge maiores do que em

H2O (tabela 1), indicando que a quebra da liga¸c˜ao P−O neste solvente ´e mais avan¸cada e

o TS é mais dissociativo do que em água. Neste solvente alcoólico, a rea¸cão de um fosfato quiral produz uma mistura racêmica dos produtos[66]. Estas duas observa¸cões sugerem que em t-butanol, um composto pouco nucleof´ılico e impedido estericamente, o grupo metafosfato é formado e tem tempo de vida suficientemente grande para difundir pelo solvente e, portanto, permitir que o ataque nucleof´ılico ocorra com a mesma chance pelas duas faces do PO−

3 planar.

Grande parte dos resultados experimentais comentados acima foram obtidos com p- nitrofenil fosfato. Parte das conclusões discutidas acima não deve ser válida para rea¸cões com grupos de sa´ıda pouco ou desativados, pois as rea¸cões de monoésteres de fosfato

R P O O H O H O O H _

Figura 5: Estrutura do poss´ıvel TS para dissocia¸cão assistida por água de monoéster de fosfato monoprotonado[68].

dependem significativamente da basicidade do grupo de sa´ıda (vide supra)[62]. Em solu¸cão aquosa, a hidrólise de metilfosfato e fenilfosfato dianiônicos são retardadas com a adi¸cão de DMSO à solu¸cão, mas a rea¸cão de pNPP é acelerada cerca de 104 _vezes[67]

. Estes resultados foram interpretados como evidência de que a rea¸cão de hidrólise de monoésteres dianiônicos com grupos de sa´ıda de basicidade igual ou superior a de fenol ocorre segundo um mecanismo diferente da rea¸cão de pNPP[67].

Em geral, a hidrólise de monoésteres de fosfato monoaniônicos (monoprotonados) se processa mais rapidamente do que a rea¸cão do diânion e a rea¸cão de diésteres no mesmo pH[62]. Esta observa¸cão foi atribu´ıda à protona¸cão, via uma transferência intramolecular, do oxigênio do grupo de sa´ıda. A transferência de H+ _{pode ocorrer num passo rápido de}

pr´e-equil´ıbrio, formando um zwitter´ıon, RO+_(H)PO2−

3 , ou simultaneamente `a dissocia¸c˜ao

do grupo de sa´ıda. Kirby et al. propuseram que, para grupos de sa´ıda com basicidade menor do que fenóxido, a transferência de H+ _{ocorre conjuntamente à quebra da liga¸cão}

P_{−O e para grupos de sa´ıda mais básicos (como alquilfosfatos), a transferência é rápida} e anterior à dissocia¸cão[62]. Também foi proposto[62] o envolvimento de uma molécula de água na transferência protônica. O anel de seis membros formado na rea¸cão de trans- ferência com participa¸cão da água (figura 5) é menos tencionado do que o anel de quatro membros formado na ausência da molécula de água.

Na hidrólise do monoéster monoaniônico, a entropia de ativa¸cão é pequena, ocorre inversão de configura¸cão de um fosfato quiral e o βlg = −0.27[39, 62]. Estes dados são

consistentes com um mecanismo dissociativo alternativo, com forma¸cão de um zwitter´ıon. O KIE para hidrólise de pNPP monoânion (tabela 1) também difere significativamente do diânion, pois os baixos valores de15_{k e}18_k

bridgeindicam que a densidade de carga formada

pela dissocia¸c˜ao do grupo de sa´ıda foi neutralizada e o valor de 18_k

nonbridge significativa-

A hipótese da influência da basicidade do grupo de sa´ıda na ordem de transferência de H+ _{é suportada pela diferen¸ca no efeito isotópico do solvente, k}

H2O/kD2O, que passa

de 0.87 na hidrólise de metilfosfato para 1.45 na hidrólise de 2,4-dinitrofenil fosfato[62]. Espera-se um efeito significativo caso a transferência de H+ _{participe da coordenada de}

rea¸cão da etapa limitante, e um efeito pequeno (próximo de 1) caso a transferência seja anterior a etapa limitante da rea¸cão[59, cap. 7].

Um interessante estudo computacional de estrutura eletrônica molecular acoplada a uma representa¸cão do solvente aquoso estabeleceu recentemente a existência de um zwitter´ıon aniônico, RO+_(H)PO2−

3 , como um intermediário de rea¸cão estável[68]. O in-

termediário zwitteriônico foi encontrado quando R = H, metil e fenil, mas não foi encontrado quando R = 2,4-dinitrofenil[69]. Estes cálculos concordam com a proposta de Kirby et al. para a rea¸cão de hidrólise. A barreira de ativa¸cão calculada (∆G‡_calc) para rea¸cão de hidrólise de metilfosfato corresponde à experimental (∆G‡_calc = 30.3 e ∆G‡

exp=

30.7 kcal/mol a 100◦_C[38]

) e o efeito isotópico do solvente calculado é idêntico ao experimental (vide supra). Os mecanismos Dn+An e AnDn com TS dissociativo, calculados[68]

para rea¸c˜ao de hidr´olise de CH3OPO−3·H2O, ou seja, metilfosfato coordenado com uma

molécula de água (que forma o anel de 6 membros na transferência de H+_{, figura 5),}

apresentam barreiras de ativa¸c˜ao de 30 kcal/mol e, portanto, n˜ao podem ser distinguidos com base apenas nos valores computados para altura de barreira.

Ao analisar as constantes de velocidade de hidrólise de ésteres de fosfato, ˚Aqvist, Warshel e colaboradores propuseram um mecanismo alternativo para rea¸cão de monoés- teres, que inclui uma etapa de pré-equil´ıbrio, com a transferência de H+_{do nucleófilo para}

o substrato[52, 70]:

H2O + ROPO2−3 ⇀↽ OH−+ ROPO3H− k

′

→ HOPO2−

3 + ROH (1.8)

O ataque de OH− _{ocorreria segundo um mecanismo associativo, em que a dissocia¸c˜ao}

do grupo de sa´ıda seria limitante da velocidade de rea¸cão. Observa¸cões cinéticas são consistentes com esta proposta, baseada na equa¸cão 1.8, ou com um mecanismo Dn+An

ou AnDn, como tradicionalmente aceito (figura 3, vide supra).

Aqvist, Warshel e colaboradores também analisaram as LFER experimentais[39] em termos de parábolas de Marcus[19], em que as energias dos TSs estão correlacionadas com o cruzamento de parábolas que representam a superf´ıcie de energia diabática dos reagentes e produtos. Este tipo de representa¸cão é válida para sistemas desacoplados em que a coordenada de rea¸cão na região do TS não inclui as distor¸cões nucleares dos reagentes,

como, por exemplo, transferências de elétrons[71]. As rea¸cões de fosfatos não representam sistemas desacoplados e, portanto, a análise das LFER por parábolas de Marcus deve ser feita cautelosamente. A conclusão de ˚Aqvist, Warshel e colaboradores referente à análise das LFER é que estes dados são consistentes com as propostas tradicionais[37, 39, 45] mas também com um mecanismo An+Dn cuja a segunda etapa, dissociativa (Dn), é

determinante da velocidade de rea¸cão. Os KIE medidos para hidrólise de monoésteres (tabela 1) também podem ser interpretados de acordo com um mecanismo An+Dn com

a segunda etapa determinante.

A análise de ˚Aqvist, Warshel e colaboradores é sustentada por computa¸cões de uma LFER por cálculos de estrutura eletrônica molecular acoplados a uma representa¸cão da solu¸cão aquosa para a rea¸cão CH3O−+ ROPO−3, onde RO são derivados de fenol com

pKa entre 5 e 10[72]. Estes resultados mostram que um mecanismo An+Dncom a segunda

etapa determinante reproduz o βlg experimental para rea¸cões de monoésteres dianiônicos

(vide supra)[72]. Porém, limita¸cões (otimiza¸cões parciais de geometria e um conjunto base atômico reduzido utilizado para expansão da fun¸cão de onda de um diânion na fase gasosa, §1.4) da metodologia usada neste estudo computacional sugerem que os resultados devem ser vistos cautelosamente.

Aqvist, Warshel e colaboradores também apontaram que os TSs importantes para um mecanismo An+Dn tradicional (sem pré-transferência de H+, figura 3) devem ser

bastante similares aos TSs de um mecanismo associativo baseado na equa¸cão 1.8. Estes autores comparam os mecanismos associativos e dissociativos para hidrólise de metilfosfato neutro, mono e dianiônico, utilizando cálculos de estrutura eletrônica acoplados a uma representa¸cão de solvente aquoso simplificada (que não contém moléculas de água expl´ıcitas, ou seja, que possam catalisar ou participar da rea¸cão)[73]. As barreiras de ativa¸cão computadas, cerca de 40 kcal/mol, são semelhantes para ambos mecanismos, porém 10 kcal/mol maiores do que as energias de ativa¸cão medidas.

Outro recente estudo computacional da hidrólise de metilfosfato[74] empregou uma metodologia mais rigorosa, incluindo explicitamente moléculas de água além da representa¸cão do solvente aquoso. A barreira de ativa¸cão calculada para o mecanismo Dn+An

é de 29 kcal/mol, um valor bastante próximo ao experimental (vide supra). Contudo, o efeito isotópico cinético do solvente calculado neste mecanismo não corresponde ao efeito medido, ao contrário dos resultados de Bianciotto, Barthelat e Vigroux[68], em que um intermediário zwitteriônico é obtido (vide supra). A barreira calculada para o mecanismo

No documento Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato... (páginas 40-51)