CAPÍTULO 5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.5. COMPARAÇÃO DA DIVERSIDADE BACTERIANA NAS AMOSTRAS DE REJEITO
REJEITOS PELA TÉCNICA PCR-DGGE
O mesmo procedimento de extração de DNA dos isolados foi aplicada à fração sólida das amostras brutas do rejeito composto (RC) e da barragem (RB), sendo possível obter o DNA genômico total extraído dos microrganismos presentes nas amostras. A partir destes extratos, realizou-se o procedimento de amplificação do gene DNAr 16S utilizando iniciadores específicos para análise de bactérias por DGGE (357F-GC e 907R). Simultaneamente foram realizadas amplificações com estes iniciadores a partir dos extratos genômicos das culturas isoladas (Figura 5.14).
(a)
(b)
107 Para o estudo de ecologia microbiana, a DGGE oferece um caminho rápido, pois independe do cultivo dos microrganismos ela possibilita a identificação de populações predominantes no ambiente. A DGGE é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de mesmo comprimento, mas de diferentes sequências de pares de bases. Pelos fragmentos de RNAr 16S amplificados, diferentes perfis de banda podem ser visualizados representando a diversidade filogenética de uma comunidade.
A análise por DGGE requer uma quantidade significativa de DNA e por isso, a necessidade de uma amplificação por PCR antes da técnica. Uma amplificação completa do gene pode ser obtida usando-se iniciadores universais para os domínios Bacteria. Depois da reação de amplificação tem-se uma mistura dos genes rRNA 16S de todas as bactérias presentes nas amostras.
A DGGE tem sido usada para caracterizar populações microbianas complexas em ambientes naturais. Usando DGGE pode-se obter informações qualitativas sobre a diversidade presente nas amostras, mas essas metodologias não fornecem dados quantitativos, informação chave para a ecologia microbiana.
No geral, essas técnicas de eletroforese somente indicam as espécies predominantes na comunidade. Vários estudos revelaram que populações bacterianas de 1% ou mais podem ser detectadas por PCR-DGGE (MUYZER e WAAL, 1993). Um valor similar também foi encontrado por LEE et al. (1996) usando PCR para caracterizar estruturas de comunidades microbianas. No entanto, assim como todos os métodos, a DGGE possui suas limitações sendo necessária a busca de novas estratégias para o isolamento e a caracterização fisiológica de microrganismos a fim de revelar o papel da diversidade microbiana no funcionamento dos ecossistemas.
Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante de 30-70% a fim de separar os diferentes fragmentos de DNA presentes nas amostras brutas. A Figura 5.15 (a) apresenta uma imagem do gel ilustrando o perfil de bandas encontradas para as amostras RC e RB, observadas em duplicata.
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(a) (b)
Figura 5.15. Gel de DGGE corado com brometo contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S amplificado com primers universais para Bacteria. (K e K‟) Isolado K; (RC e RC‟) Amostra bruta do rejeito composto;
(RB e RB‟) Amostra bruta do rejeito da barragem.
Por meio da caracterização microbiana presente nas amostras pela técnica de PCR-DGGE, se obteve em geral, um pequeno número de bandas para as duas amostras envolvidas neste trabalho. Como o perfil de bandas gerado pela técnica PCR-DGGE representa a diversidade de bactérias dominante presente nas amostras, pode-se supor que poucas espécies compõem a comunidade bacteriana nas amostras de rejeito composto e da barragem.
109 Uma das hipóteses para explicar essa baixa diversidade pode ser o fato de que as espécies pobremente representadas não foram amplificadas ou foram amplificadas, mas foram mascaradas por bandas mais intensas provenientes das espécies predominantes. Há de se considerar ainda que o ambiente físico das amostras é bastante extremo considerando os valores de pH medidos (~10), que certamente tem um impacto na diversidade bacteriana presente.
YANG et al. (2010) analisaram a diversidade bacteriana no efluente alcalino de celulose, chamado de licor negro, o qual é gerado a partir da tecnologia de extração alcalina. As amostras foram coletadas no verão, outono, inverno e primavera e os valores de pH foram de aproximadamente 8,5 no verão e outono, mas acima de 10 no inverno e na primavera. Através da técnica PCR-DGGE foi observado que a diversidade bacteriana sofreu alterações de acordo com as condições da amostra, sendo encontrada maior diversidade nas amostras do verão e do outono, as quais apresentaram menor pH e temperatura entre 20 e 40°C. Nas amostras do inverno e da primavera foi observado uma menor diversidade bacteriana, sendo essa justificada pelo alto valor de pH e, também, pela temperatura extrema de -15°C.
Aparentemente a abundância de algumas bactérias presentes no resíduo composto diminui na barragem uma vez que algumas bandas presentes na amostra RC não apareceram na amostra RB. Este resultado pode ser visto nas réplicas das corridas do DGGE mostradas na Figura 5.15 (a). A barragem recebe, além dos resíduos provenientes da flotação do minério, águas residuárias de outros processos, permanecendo neste ambiente por longo período de detenção. Apesar desta diferença, os motivos que explicam o resultado comparativo entre os dois pontos de amostragem permanece desconhecido, uma vez que somente com uma plena caracterização dos ambientes de coleta poderia mostrar o que de fato difere entre eles. Infelizmente não foi possível comparar o perfil de bandas das amostras brutas com todos os isolados obtidos, pois, mesmo após várias tentativas a qualidade dos produtos de PCR gerados não foram suficientemente bons para serem detectados pela técnica DGGE. Porém foi possível comparar o perfil de bandas das amostras brutas com o fragmento correspondente ao isolado K, identificado como pertencente ao gênero Bacillus.
110 O produto da PCR obtido do isolado K foi comparado com produtos das amostras brutas RC e RB, conforme Figura 5.15 (b), onde pode ser confirmada a presença considerável do isolado K nas amostras do rejeito composto. A elevada intensidade correspondente à banda do isolado K na amostra RC indica que esta bactéria é de fato um membro bacteriano dominante no ambiente, o que justifica a obtenção de isolados similares, provavelmente pertencentes ao gênero Bacillus, tal como o isolado K.
YANG et al. (2010) estudaram sobre a diversidade bacteriana no licor negro da celulose e identificaram os principais grupos bacterianos em amostras coletadas no verão, outono, inverno e primavera, sendo que essas amostras apresentaram variados valores de pH e temperatura e diferente diversidade bacteriana. Foram encontrados 10 gêneros nessas amostas, como Alkalibacterium, Atopostipes, Bacillus, Halolactibacillus, Amphibacillus, Clostridium, Actinobacuus, Halomonas, Desulfobacterium e Aquabacterium, sendo a maior a parte deles pertencentes ao filo Firmicutes, no qual a grande maioria dos indivíduos é formadora de esporos, o que justifica então a diversidade bacteriana encontrada. Cerca de 50% dos indivíduos nas amostras da primavera e do inverno pertenceram ao gênero Alkalibacterium, o qual apresenta capacidade de crescimento em temperaturas abaixo de 45ºC e pH entre 9 a 12. A espécie anaeróbia Clostridium apareceu com proporções elevadas nas amostras do verão e do outono e representou menor proporção nas demais amostras, o que pode ser justificado pelas temperaturas mais elevadas no verão e outono, o que fez com que muitas bactérias aeróbias consumissem mais oxigênio dissolvido e, em seguida, formou-se um melhor ambiente anaeróbico para o crescimento de espécies de Clostridium. Mas, diferente da variação encontrada nesses grupos, o gênero Bacillus apareceu em todas as amostras e apresentou uma pequena variação, sendo considerado o grupo mais estável encontrado nas amostras. Por ser este um gênero com capacidade de esporulação, foi sugerido que as condições alcalinas extremas e a grande variação da temperatura não afetaram esse grupo de microrganismos.
Tentou-se realizar a purificação das bandas obtidas no gel de poliacrilamida das amostras brutas para posterior sequenciamento e identificação por meio de análises comparativas em bancos de dados. No entanto as amplificações não apresentaram resultados satisfatórios, não sendo possível realizar a identificação desse material.
111 Cabe ressaltar que a técnica PCR-DGGE aplicada à este estudo, utilizou apenas iniciadores para o domínio Bacteria, e que portanto possui amplitude restrita ao grupo das bactérias. Outros microrganismos podem estar presentes nas amostras isoladas, tais como fungos filamentosos, leveduras e arquéias, e que ainda podem ter alguma participação no processo de biodegradação in situ das aminas, porém ainda é um campo para ser investigado,