CAPÍTULO 4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.6. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS ISOLADAS
4.6.1. Condições de isolamento e caracterização dos isolados
O isolamento das bactérias presentes nas amostras brutas foi realizado em meio ágar nutriente e meio Bromfield modificado (BROMFIELD, 1954) acrescido de 30g.L-1 de ágar bacteriológico e 100mL de solução de 0,1g.L-1 de éter-monoamina Flotigam EDA-3B e éter-diamina Flotigam F 2835 em mistura de 25,0% e 75,0% em massa, respectivamente. Os meios de cultura, sem adição das éter-aminas, foram esterilizados em autoclave a 120ºC por 20 minutos e só após o resfriamento a solução de aminas foi adicionada ao meio. Os meios foram transferidos para placas de Petri descartáveis estéreis para posterior inoculação.
Apenas a fração líquida das amostras de rejeitos foi utilizada no isolamento de microrganismos cultiváveis. 1,0mL do sobrenadante foi transferido para um tubo de ensaio contendo 9mL de solução salina 0,85%. Foram realizadas diluições seriadas para 10-1 e 10-2 e utilizados 0,5mL dessas diluições no paqueamento a fim de promover o crescimento das colônias viáveis. As placas foram incubadas à 35°C ± 2°C por 24 horas na estufa de cultura 002CB Fanem.
As colônias isoladas crescidas nas placas de Petri foram transferidas para tubos de ensaio individuais esterilizados contendo 4,0mL de meio de cultura líquido, previamente autoclavado, correspondente ao meio utilizado no isolamento. As culturas foram incubadas a 35°C ± 2°C por 48 horas e repicadas novamente em meios de cultura sólido, para confirmar a presença de um único tipo de colônia Este procedimento foi realizado duas
65 vezes até que o isolamento estivesse confirmado. Ao final do isolamento, 1,0mL de isolado crescido em meio líquido foi preservado à -20°C em microtubos de 1,5mL contendo 0,5mL de glicerol 80% autoclavado.
Foram obtidas fotografias das placas de petri com crescimento bacteriano isolado, realizada a caracterização morfológica das colônias, coloração de Gram das células isoladas para diferenciação da estrutura da parede celular (RENDE e OKURA, 2008) e coloração de esporos pelo Verde Malaquita (RENDE e OKURA, 2008).
Para identificação mais precisa dos isolados, foram utilizadas técnicas de biologia molecular baseadas na extração de DNA genômico e amplificação do gene DNA ribossomal 16S conforme descrito a seguir.
4.6.2. Identificação dos isolados
4.6.2.1 - Extração de DNA
As culturas obtidas foram utilizadas para extração de DNA pelo método fenol/clorofórmio (GRIFFITHS et al., 2000), assim como as amostras brutas coletadas na etapa de concentração do minério de ferro e na barragem de rejeitos. Para cada cultura isolada ou amostra bruta foram adicionados os componentes de acordo com a Tabela 4.1, em microtubos de 2,0mL
Tabela 4.1. Soluções e volumes da extração de DNA pela técnica fenol/clorofórmio (FONTE: GRIFFITHS et al., 2000).
Componente Quantidade
Cultura isolada/amostra bruta 5 colônias/0,5g
Pérola de vidro estéril 0,5g
SDS10%* 10µL
Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico* (24:24:1) 0,3mL
PBS 1X* + PVPP* 1% 0,3mL
* Composição das soluções descritas no Anexo II
Promoveu-se 2 agitações de 30 segundos cada no vórtex, mantendo as amostras imersas no gelo durante o intervalo entre as agitações. Centrifugou-se, utilizando a Microcentrífuga Refrigerada Novatécnica NT805, por 5 minutos à 14.000rpm à 5°C e o sobrenadante foi
66 transferido para novo microtubo. Adicionou-se igual volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) (Anexo II) e agitou-se manualmente. Nova centrifugação foi realizada por 5 minutos à 14.000rpm e 5°C. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo e precipitado com 0,1V de acetato de sódio (3M, 5,2) (Anexo II) e 2V de etanol 100%. Os microtubos foram incubados à -20°C por 1 hora e centrifugados por 10 minutos à 14.000rpm e 5°C. O sobrenadante foi então descartado e o pellet lavado com 200µL de etanol 70%. Procedeu-se nova centrifugação por 3 minutos à 14.000rpm e 5°C e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi deixado à temperatura ambiente por 16 horas para secagem, ressuspendido em 50µL de Tris (tris(hidroximetil)aminometano, 10mM e pH8) e estocado à -20°C até a utilização para a amplificação do gene DNA ribssomal 16S.
4.6.2.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
As reações de amplificação por PCR a partir do DNA genômico extraído das cultura puras ocorreram na presença dos reagentes descritos na Tabela 4.2 e dos iniciadores universais para o domínio Bacteria 27F (5‟-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‟) e 1492R (5'- TACGGYTACTTGTTACGACTT-3') (LANE,1991).
Tabela 4.2: Reagentes utilizados para a preparação da mistura de reação da PCR para a amplificação do gene
DNAr 16S. (*reagentes da marca Fermentas; **Sintetizados pela empresa Bioneer)
Componentes Concentração estoque Concentração por reação Volume por reação (µL)
Água Milli– Q ---- ---- 15,85 Tampão* 10x 1x 2,5 MgCl2* 25mM 2,0mM 2,0 Iniciador 1** 10pmol/µL 500nM 1,25 Iniciador 2** 10pmol/µL 500nM 1,25 dNTP‟s* 10mM total 0,2mM 0,5 BSA* 5mg/L 0,2mg/L 1,0
Taq polimerase* 5µ/µL 1,5u/µL 0,1
DNA template ---- ---- 0,5
VOLUME FINAL ---- ---- 25
Após a adição de todos os reagentes, estes foram transferidos para microtubos e em seguida, foi adicionada à mistura de reação, 0,5µL da amostra a ser analisada.
67 A amplificação foi realizada no Termociclador Automático Biocycler TM MJ96+, seguindo o programa de 3 minutos a 94ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC (desnaturação), 1 minuto a 55ºC (ligação dos iniciadores) e 1 minuto a 72ºC (extensão); 7 minutos a 72º C (extensão final). Após a amplificação, as amostras foram armazenadas a 4°C. Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de agarose 1% (p/v) em TAE (tampão Tris-Acetato-EDTA, pH8) 1X (Anexo II), durante 30 minutos a uma voltagem de 100V, corados com SybrSafe DNA Gel Stain (Invitrogen), seguida de observação em um transiluminador de luz UV.
O sequenciamento do DNA das culturas isoladas foi realizado a partir dos produtos das amplificações (PCR) utilizando os iniciadores das extremidades 27f e 1492R, por serviço terceirizado pela empresa Genomic Engenharia Molecular (São Paulo), assim como a purificação e quantificação de DNA presente nos amplicons. As sequências obtidas foram analisadas nos programas BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal Database Project Release 10 – (COLE et al., 2009) para o alinhamento das mesmas com sequências depositadas no seu banco de dados utilizando o modelo de Jukes-Cantor. A árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S alinhados foi construída pelo método Neighbor Joining modificado, disponível no RDP (BRUNO et al., 2000 ).
Para montagem da árvore filogenética foram reunidas as sequências de DNA que codificam para o RNAr 16S do isolado K desse estudo e suas respectivas espécies de referência obtidas no Bando de Dados RDB. Todas as sequências foram alinhadas usando esse programa. Após a montagem, a árvore filogenética foi editada usando o software de edição do MEGA 4.1, com o objetivo de formatação.