QUANTIFICAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS

4.3.1. Método Verde de Bromocresol (ARAÚJO et al., 2009)

Os métodos colorimétricos que envolvem o uso de corantes orgânicos foram utilizados intensamente para análise qualitativa e quantitativa de surfactantes e sais de amônio (MUKERJEE, 1956; AUERBACH, 1943). Estes métodos consistem na formação de sais coloridos de amina-corante orgânico que são extraídos com solventes orgânicos. Estes corantes orgânicos são solúveis em solução aquosa e insolúveis em solventes orgânicos e, após a reação com os sais de amina, o composto formado torna-se solúvel em solventes orgânicos. O método do verde do bromocresol é caracterizado por uma satisfatória acurácia e precisão, possuindo uma detecção limite abaixo de 1mg.L-1_{. A recuperação dessa} metodologia é de 98,53% (ARAÚJO et al., 2009).

57 Figura 4.1. Fluxograma evidenciando o delineamento experimental na fase do desenvolvimento

metodológico adotado.

Coleta das amostras do rejeito composto (RC) e do rejeito da barragem (RB) Aquisição da cultura de

Serratia marcescens (ATCC 13880O)

Teste de bidegradabilidade das éter-aminas por S.

marcescens ATCC 138800 Isolamento em cultura pura

Caracterização morfológica Extração de DNA PCR-16S Sequenciamento Análise filogenética Desenvolvimento e Validação do Orange II DGGE Testes de biodegradação Análise da diversidade bacteriana Cinética de biodegradação

58 A amina na presença de verde de bromocresol pode formar dois tipos de compostos: em soluções alcalinas é formado um sal de diamina de coloração verde, enquanto que em soluções ácidas é formado um sal de monoamina de coloração amarelada (MUKERJEE, 1956; AUERBACH, 1943).

O princípio do método verde de bromocresol consiste na formação de um sal de amônio quartenário, entre a éter-amina e o corante, em clorofórmio, e através da colorimetria é medida a intensidade da cor formada que está diretamente relacionada com a concentração de amina presente na solução. Assim, se há um sistema de duas fases, clorofórmio e solução aquosa de verde de bromocresol, tamponada em pH5, coloca-se uma solução diluída de sal amínico e se agita, o clorofórmio se tinge de amarelo. Dessa forma, através da comparação com as curvas padrões, é possível determinar fotometricamente a intensidade da tonalidade de amarelo fazendo uma quantificação indireta da éter-amina presente na amostra.

Foram utilizados padrões de 5, 10, 25, 40, 50, 80 e 100mg.L-1 de éter-monoamina Flotigam EDA-3B), éter-diamina (Flotigam F 2835) e de uma solução de 25% e 75% em massa de éter-onoamina e éter-diamina respectivamente, para a elaboração da curva de calibração. Colocou-se em um funil de separação de 250mL, 25mL de clorofórmio, adicionou-se 10mL de solução de verde de bromocresol, acrescentou 10mL da amostra a ser quantificada. Agitou-se o funil. Retirou-se o solvente orgânico, já com coloração amarelada, para posterior leitura da absorbância no espectrofotômetro Biospectro SP220, no comprimento de onda de 405nm, em cubeta de vidro de 10mm. O branco utilizado para a leitura foi feito com 10mL de água destilada, substituindo a amostra.

4.3.2. Método do Orange II

Este método de análise colorimétrica de éter-aminas foi desenvolvido no presente trabalho. O processo de extração é semelhante ao método do Verde de Bromocresol, sendo utilizado o Orange II como corante no sistema. A absorbância foi determinada no comprimento de onda de 485nm.

59 4.3.2.1. Validação do método químico do Orange II (INMETRO, 2003)

É fundamental que os laboratórios demonstrem, através da validação, que os métodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida. Se um método existente for modificado para atender aos requisitos específicos, ou um método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve se assegurar de que as características de desempenho do método atendem aos requisitos para as operações analíticas pretendidas. Para tanto, deve-se ser feita a validação, comprovação através do fornecimento de evidências objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram atendidos.

De acordo com as orientações do INMETRO, foram realizados testes para a padronização do método de quantificação das éter-aminas utilizando o orange II como corante. Os testes específicos para a validação foram faixa de trabalho e faixa linear de trabalho e limite de detecção.

- Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho: Para qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito ou valores da propriedade no qual o método pode ser aplicado, chamada de faixa de trabalho. A faixa linear de trabalho de um método de ensaio é o intervalo entre os níveis inferior e superior de concentração do analito no qual foi demonstrado ser possível a determinação com a precisão, exatidão e linearidade exigidas, sob as condições especificadas para o ensaio. Essa faixa linear de trabalho é definida como a faixa de concentrações na qual a sensibilidade pode ser considerada constante e é normalmente expressa nas mesmas unidades do trabalho obtido pelo método analítico. Foram utilizadas soluções padrões nas concentrações de 5, 10, 20, 25, 30, 40, 60, 80 e 100mg.L-1 de éter-monoamina, éter-diamina e uma mistura de 25% de Flotigam EDA-3B e 75% de Flotigam F 2835 em massa, para a elaboração das curvas de calibração. A extração foi realizada conforme procedimento descrito para o Método do Verde de Bromocresol, mas utilizando o Orange II como corante. A leitura das absorbâncias foi realizada no espectrofotômetro Biospectro SP220 no comprimento de onda de 485nm.

60 Verificou-se, visualmente, nos gráficos a existência de pontos dispersos que pudessem interferir na regressão e esses foram removidos. Foi calculado então o coeficiente de determinação (R2).

Calculou-se os resíduos, ou seja, a diferença entre o valor observado e o valor calculado pela equação da reta de regressão para cada valor de x. Uma distribuição aleatória em torno da linha reta confirmou a veracidade dos dados.

– Limite de Detecção: Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo método.

O limite de detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do analito que produz um sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do equipamento e o limite de detecção do método (LDM) é a menor concentração que o método pode detectar com precisão nos resultados.

Foram feitas soluções padrões nas concentrações de 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 e 1,00mg.L-1 da éter-monoamina, éter-diamina e da solução de 25% de éter-monoamina e 75% de éter- diamina, e realizadas as extrações conforme descrito pra o Método do Verde de Bromocresol, mas utilizando o Orange II como corante do sistema. A leitura da absorbância foi realizada no espectrofotômetro Biospectro SP220 no comprimento de onda de 485nm. Os resultados foram plotados em gráficos e utilizados para estabelecer o LDE. Para a determinação do LDM, foram calculadas as variâncias (S2)de cada concentração, de acordo com a equação 4.1:









onde: Xi – absorbância teórica Xo – absorbância observada n – número de análises

61 Para o cálculo da absorbância teórica foram utilizadas as equações de regressão linear obtidas nos gráficos da curva de calibração, para cada concentração.

Em seguida foi calculado o desvio padrão (s) de cada concentração e esse valor utilizado para calcular o LDM, segundo a equação 4.2:

 

 

s t

LDM n1,1 .

Equação 4.2 onde: LDM = limite de detecção do método

t(n-1, 1-α) = valor da abscissa t (Student) para (1-α) x 100% nível de confiança e (n-1) graus de liberdade.

s = desvio padrão das análises em replicata

Foram utilizados 6 graus de liberdade, pois foram realizadas 7 replicatas para cada concentração trabalhada. O valor t unilateral, para 99% de confiança, foi de 3,707 de acordo com a tabela de distribuição t (student test). Para encontrar a concentração do LDM, foram utilizadas novamente as equações de regressão linear de cada curva de calibração.

4.4. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS